王偉軍，李延華

（1.貝因美嬰童食品股份有限公司，浙江杭州311106；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018）

乳源嗜冷菌產(chǎn)胞外耐熱酶檢測方法的對比分析

王偉軍1，李延華2

（1.貝因美嬰童食品股份有限公司，浙江杭州311106；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018）

乳及乳制品中污染的嗜冷菌可分泌耐熱的胞外蛋白酶和脂肪酶，直接影響產(chǎn)品品質(zhì)。介紹從乳體系中分離鑒定的嗜冷菌種類，指出熒光假單胞菌是產(chǎn)胞外蛋白酶和脂肪酶的主要嗜冷菌菌株；分別闡述乳中污染的嗜冷菌所分泌蛋白酶和脂肪酶的熱穩(wěn)定性，并比較乳體系中耐熱酶的測定方法，期望為有效預(yù)測乳中嗜冷菌污染程度、在線檢測和控制耐熱酶活性、提升乳制品的質(zhì)量提供理論參考。

乳；嗜冷菌；蛋白酶；脂肪酶；檢測方法

乳品工業(yè)中嗜冷菌被定義為在7℃或者7℃以下能夠繁殖的一類細(xì)菌，是一類能引起乳品腐敗的微生物［1］。目前，嗜冷菌是乳與乳制品加工過程中最為關(guān)鍵的腐敗菌。已有研究指出：并不是嗜冷菌本身導(dǎo)致原料乳、液態(tài)奶、乳粉等腐敗變質(zhì)，而是其分泌的胞外酶作用產(chǎn)生［2］。作為冷藏原料乳中生長的優(yōu)勢菌群，在原料乳貯存過程中可以產(chǎn)生耐熱的脂肪酶和蛋白酶，這些酶類在巴氏殺菌或高溫殺菌處理后仍會有殘留，并在乳制品貯藏過程中繼續(xù)分解其中的脂肪和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)地產(chǎn)生變化。脂肪酶主要是分解脂肪產(chǎn)生酸敗味及其它風(fēng)味缺陷，蛋白酶主要是引起乳中蛋白質(zhì)分解導(dǎo)致酪蛋白膠束不穩(wěn)定和乳發(fā)生凝固現(xiàn)象［3］。因此，原料乳及乳制品的質(zhì)量監(jiān)測中檢測熱穩(wěn)定性蛋白酶和脂肪酶比直接檢測嗜冷菌更有現(xiàn)實(shí)意義。

1乳中污染的嗜冷菌的種屬特性

原料乳中已經(jīng)分離出很多菌屬嗜冷菌，包括革蘭氏陰性菌：假單胞菌、氣單胞菌、靈桿菌、不動桿菌、產(chǎn)堿桿菌、無色桿菌、腸道細(xì)菌、不動桿菌和革蘭氏陽性菌：芽胞桿菌、梭狀芽胞桿菌、棒狀桿菌、細(xì)球菌屬、鏈鎖狀球菌、葡萄球菌、乳（酸）桿菌。其中假單胞菌屬是文獻(xiàn)中報(bào)道最多的一類菌［4］。Kumaresan.G提出假單胞菌屬中熒光假單胞菌（Ps.fluorescens）、惡臭假單胞菌（Ps.putida）、莓實(shí)假單胞菌（Ps.fragi）、腐敗假單胞菌（Ps.putrefaciens）和銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa）是縮短液態(tài)乳4℃貯藏貨架期的主要微生物［5］。Martin分析從乳中分離的假單胞菌，指出假單胞菌屬的五種基因型中，Ps．fluorescens，可能還有Ps.fragi能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶和軟磷脂酶，而分離出來的22種假單胞菌中只有2株P(guān)s.putida具有脂肪酶和蛋白酶活性［6］；Swart等報(bào)道從原料乳中分離的44株P(guān)s.Putida中43株不具有脂肪和蛋白分解作用［7］。因此，Ps.fluorescens是最主要的分泌脂肪酶和蛋白酶的影響原料乳品質(zhì)的假單胞菌株。

2乳中嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶

2.1嗜冷菌蛋白酶的耐熱性

嗜冷菌通常在對數(shù)生長期后期及穩(wěn)定期最大程度的產(chǎn)生蛋白酶。原料乳中嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶有三種形式，即胞內(nèi)蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶。目前研究集中于胞外蛋白酶，多數(shù)屬于耐熱性的堿性金屬蛋白酶，Zn2+和Ca2+是酶活性中心。Fairbairn等指出假單胞菌主要產(chǎn)生一種類型以Zn2+為活性中心的胞外蛋白酶，分子量40 ku～50 ku，最適溫度30℃～40℃，最適pH為6～8［8-9］。

嗜冷菌所分泌蛋白酶的耐熱機(jī)理在于經(jīng)過高溫處理后，未被破壞的處于非折疊狀態(tài)的蛋白酶分子（無活性）重新折疊成有活性的天然構(gòu)象［2］。大多數(shù)嗜冷菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶對熱處理具有高度的穩(wěn)定性。Griffiths等研究了13株假單胞菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性，經(jīng)77℃、17 s的加熱處理可保留55%～65%的活性，140℃、5 s后仍能保留20%～40%的活性［10］。Adams發(fā)現(xiàn)10種不同的假單胞菌蛋白酶在pH7.5的緩沖液中經(jīng)149℃、10 s熱處理后仍具有活性［11］。從乳中分離的嗜冷菌所分泌的蛋白酶在pH=7緩沖液中的熱穩(wěn)定性見表1。

表1　乳源嗜冷菌分泌的蛋白酶在緩沖液中的熱穩(wěn)定性（pH=7）Table 1Thermal stability of the protease secreted by psychrophile in milk（pH=7）

純化后的蛋白酶在乳中比在水中具有更高的穩(wěn)定性，原因可能為乳中含有一定的可溶性鈣。Daniel等指出大約0.38 mg/mL（～9.5 mmol/L）Ca2+可以通過阻礙蛋白分子表面局部環(huán)的暴露和敏感性而對蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有保護(hù)作用，減少熱失活過程中的自我降解；Ca2+也可通過蛋白分子多肽鏈之間遠(yuǎn)端配位體的相互交聯(lián)（類似二硫鍵的作用），使整個(gè)分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［17］。

另外，與在高溫時(shí)具有熱穩(wěn)定性相比，多數(shù)嗜冷菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶對40℃～70℃左右的熱處理非常敏感，這種現(xiàn)象被稱為低溫失活。Stepaniak指出假單胞菌蛋白酶在55℃的D值只有0.6 min～1.1 min［18］。分析原因可能是酶分子間的自我分解，即無活性的非折疊狀態(tài)的酶分子被天然構(gòu)象處于折疊狀態(tài)、有蛋白水解活性的酶分子所分解，引起低溫失活現(xiàn)象。在溫度大于70℃以后，隨著溫度的升高，由于肽鍵水解、二硫鍵的隨機(jī)配對、氨基酸殘基被破壞、Maillard反應(yīng)，被破壞降解的肽與乳清蛋白凝聚而沉淀，以及不正確構(gòu)象的產(chǎn)生等原因可使酶失活速率加快［19］。

2.2乳中嗜冷菌蛋白酶的測定方法

Hull早期通過福林-酚法測定乳中酪氨酸或色氨酸的增加量來測定蛋白酶含量［20］。

瓊脂擴(kuò)散法是檢測乳中蛋白酶的簡便方法：用加有特定指示劑的瓊脂制成平板后打孔，將嗜冷菌的細(xì)胞上清液加入孔中，通過測定孔周圍透明圈的大小來測定上清液中蛋白酶的活性。其中，脫脂乳瓊脂是最常用而有效的方法，該方法不足之處是靈敏度稍低［21］。

熒光胺、硝基苯、鄰苯二甲醛等試劑可用來檢測氨基酸的變化而測定蛋白酶［22-23］。Hockney等對福林-酚法、瓊脂擴(kuò)散、280 nm吸收和茚三酮法測定乳中嗜冷菌蛋白酶活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)這些方法都檢測不到低水平含量的蛋白酶活性，福林-酚法也僅檢測到3×10-7kat/mL的活性，同時(shí)指出當(dāng)乳中添加50 cfu/mL～500 cfu/mL嗜冷菌時(shí)，放置11 d～13 d發(fā)現(xiàn)蛋白酶量呈現(xiàn)曲線增多［24］。

Bendicho以干酪素為底物，檢測乳中熒光假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶。原理為Azocasein在蛋白酶的作用下釋放發(fā)色團(tuán)，其在345 nm處具有最大吸收，進(jìn)而測定嗜冷菌蛋白酶活性。該方法測定原料乳中的蛋白酶活性時(shí)一般需要添加疊氮化鈉（0.5 g/L）抑制細(xì)菌生長［25］。

Dupont等采用纖溶蛋白酶IgG單克隆抗體的方法檢測脫脂乳中纖溶蛋白酶的活性，于37℃下反應(yīng)5 h［26］。該方法存在一定的缺陷，不能區(qū)分所測的酶活性是源于有活性的酶，還是源于鈍化的酶，而使檢測結(jié)果偏高。

Matta等采用桿菌蛋白酶IgG單克隆抗體22.5℃、3.5h～6.5h檢測緩沖液或乳中蛋白酶［27］；采用Pseudomonas AFT-36蛋白酶的多克隆抗體檢測緩沖液中或乳中的細(xì)菌蛋白酶，22.5℃、85 min可檢測出酶活性［28］。

王輝等研究了牛乳中嗜冷菌數(shù)與其產(chǎn)生的耐熱胞外蛋白酶活性的相關(guān)性。指出牛乳中單一嗜冷菌數(shù)與蛋白酶活性呈一定正相關(guān)，回歸方程為Y= 0.454 8ln（x）+0.417 8，R2=0.817 2，差異極顯著（P＜0.01）。自然狀態(tài)下，原料乳在不同條件下貯存，嗜冷菌數(shù)有明顯的增加趨勢，但自然存放條件下，原料奶中嗜冷菌數(shù)和蛋白酶活性之間沒有相關(guān)性［29］。此外，由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品問題，反向高效液相色譜和熒光分光光度計(jì)在乳中蛋白酶活力檢測的應(yīng)用具有局限性［2］。

3乳中嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱脂肪酶

3.1乳中嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶的耐熱性

牛乳中的微生物脂肪酶主要來源于嗜冷菌，其顯著特征為耐熱性，尤其是具有在UHT乳中存活的特性。大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶屬于胞外脂肪酶，產(chǎn)生于細(xì)菌生長的對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定生長期的前期，最適pH在7～9之間，分子量在30 ku～50 ku，在sn-1和sn-3位有特異性。細(xì)菌脂肪酶的三級結(jié)構(gòu)是一個(gè)共同的折疊模式，稱為α/β水解酶折疊，折疊有一個(gè)親核的氨基酸順序（絲氨酸、半胱氨酸或者天門冬氨酸），一個(gè)酸性催化殘基（天門冬氨酸鹽或谷氨酸鹽）和一個(gè)組氨酸殘基。親核絲氨酸存在于活性中心的五肽順序中（五肽順序?yàn)間ly-X-ser-X-gly）［2］。

假單胞菌屬是牛乳中降解脂類的主要菌群，該菌脂肪酶存在ser活性部位，氨基酸序列與牛乳的脂蛋白脂肪酶不同。同時(shí)氣單胞菌屬、無色桿菌屬、黃桿菌屬等也能分泌脂肪酶。多數(shù)桿菌脂肪酶在60℃～75℃具有最大活性，而假單胞菌在30℃～45℃具有最大活性。不同嗜冷菌分泌的脂肪酶耐熱性不同，黃桿菌分泌的脂肪酶與假單胞菌和氣單胞菌分泌的脂酶相比較具有較差的耐熱性。

Law等將提取的不同脂肪酶經(jīng)63℃、30 min加熱后活性為原來的55%～100%［30］。Champagne指出假單胞菌屬可產(chǎn)生耐熱的蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶，在巴氏殺菌過程中基本不受影響，即使在140℃、2 min的處理后，仍然會有10%的殘留［31］。Andersson等指出脫脂乳中P.fluorescens SIK W1脂肪酶在100℃的D值為23.5 min，t1/2為7 min［32］；研究進(jìn)一步指出同一細(xì)菌既能產(chǎn)生脂肪酶，也能產(chǎn)生蛋白酶，但是在乳粉長期貯藏時(shí)脂肪酶的熱穩(wěn)定性較蛋白酶要高［33］。

3.2乳中脂肪酶活力測定方法

測定不同體系中脂肪酶活力的方法大致分為：滴定法［34］、4-甲基傘形酮熒光測定法［35］、液相色譜法［36］、分光光度法［37］、層析法［38］、酶法［39］、以Br，CL-吲哚氧基辛酸鹽為底物的試紙條檢測法［40］和量熱法［41］等。Choi提出應(yīng)用脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生的脂肪酸來測定脂肪酶活性，該方法簡便、省時(shí)、藥品使用量少，并可同時(shí)測定多個(gè)樣品，而且直觀性強(qiáng)，適于定性分析，但是該方法在定量描述上缺乏一定的準(zhǔn)確度［42］。熒光測定法檢測牛乳中脂肪酶活力耗費(fèi)時(shí)間長，樣品準(zhǔn)備繁瑣、儀器復(fù)雜，因此不作為快速鑒定的方法。Kannappan用高效液相色譜法對不同嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶進(jìn)行測定，這種方法適合于對底物具有專一性的酶的分析，并且靈敏度高，但設(shè)備昂貴［36］。Richardson等以三丁酸甘油脂為底物，根據(jù)反射比色法檢測樣品濁度和pH的變化來檢測脂肪酶的活力，此種方法適用于檢測脂肪酶濃度高的樣品［37］。Blake用對硝基苯酚辛酸鹽比色法測定熒光假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶活力，此方法操作簡單，靈敏度高，檢測時(shí)間為10 h［38］。

由于乳中嗜冷菌數(shù)量少，因此產(chǎn)生的耐熱性脂肪酶含量也少，同時(shí)由于檢測方法或是冗長費(fèi)時(shí)，或是檢測成本高、或是特異性強(qiáng)而難以實(shí)現(xiàn)，所以這些方法應(yīng)用于乳體系中脂肪酶檢測過程中都具有一定的局限性。近年來國內(nèi)外測定乳中嗜冷菌脂肪酶時(shí)主要采用對硝基苯酚分光光度法，該方法測定乳中脂肪酶的原理是脂肪酶在一定條件下水解硝基苯酚酯，釋放出具有黃色的物質(zhì)對硝基苯酚，此物質(zhì)在405 nm處對光有最大吸收，通過測定對硝基苯酚的吸光值，從而得到脂肪酶的活力。Humbert采用測定脂肪酶活力時(shí)為消除濁度對吸光度的影響，使用澄清劑溶解乳中酪蛋白膠粒和脂肪球，省去了萃取和離心的繁瑣步驟，使檢測方法更加方便快捷［39］。Stead提出脫脂乳經(jīng)離心處理后脂肪酶會有一定的損失，可能是由于脂肪酶與乳中的酪蛋白有一定的結(jié)合引起的［40］。Bendicho改進(jìn)了分光光度法，使得最低檢測量為9.31 mU/mL，提高了檢測速度及靈敏度［41］。此外，靳磊指出單一嗜冷菌數(shù)與脂肪酶活性呈一定正相關(guān)，回歸方程為Y=0.013 3x+1.069，R2=0.712 7［42］。張樹利指出脂肪酶活性與嗜冷菌的相關(guān)系數(shù)為0.746 9［43］。然而，這種相關(guān)性的建立基礎(chǔ)是為了基于脂肪酶的活性評估嗜冷菌的數(shù)量，同時(shí)乳體系的菌屬復(fù)雜，相關(guān)模型需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4結(jié)論與展望

乳中嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶是一種反映嗜冷菌污染程度的指標(biāo)，同時(shí)嗜冷菌分泌的耐熱酶也是乳品科學(xué)領(lǐng)域努力攻克的難題。目前國內(nèi)主要是通過控制牛體、奶站環(huán)境、擠奶器具、儲奶和運(yùn)奶器具的衛(wèi)生來控制原料乳中嗜冷菌的生長，從而控制其耐熱性酶的分泌?？梢?，原料乳中嗜冷菌的快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測，將對乳制品中耐熱酶的活性控制及產(chǎn)品的品質(zhì)提高具有重要意義。

雖然目前對從乳中分離出的嗜冷菌所分泌的蛋白酶、脂肪酶的數(shù)量及酶活性影響因素有一定研究，但是這些耐熱酶的精確的耐高溫機(jī)理還不清楚，有必要探討嗜冷菌分泌耐熱酶與普通酶的構(gòu)象差異，從而確定嗜冷菌分泌的胞外酶的獨(dú)特耐熱結(jié)構(gòu)。同時(shí)，要針對耐熱酶的控制方法進(jìn)行系統(tǒng)、深入研究，研究中可以考慮嗜冷菌耐熱酶的低溫失活現(xiàn)象來抑制酶活性，也可以采取物理或化學(xué)的方法抑制耐熱酶發(fā)揮作用，從而最大限度地減少因嗜冷菌耐熱酶引起乳制品的腐敗變質(zhì)而產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失。

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Comparing Detection Methods for Extracellular Thermostable Enzymes Secreted by Psychrophile in Milk

WANG Wei-jun1，LI Yan-hua2
（1.Beingmate Baby&Child Food Co.，Ltd.，Hangzhou 311106，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Zhe Jiang Gong Shang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

Extracellular protease and lipase could be secreted by psychrotrophic bacteria in dairy products. These enzymes directly influenced the quality of dairy products.The study described the species of psychrophile isolated from milk，pointing out that pseudomonas fluorescens were the main strains which could metabolize protease and lipase.Thermal stability of these enzymes was elaborated and the methods of detection them were compared.It was expected to provide theoretical thoughts to predict the amount of contaminated psychrophile in dairy and dairy products，online detect and control the activity of thermostable enzyme and improve the quality of dairy products.

milk；psychrophile；protease；lipase；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.021

2014-01-01

王偉軍（1979—），男（漢），博士，研究方向：乳品科學(xué)。