袁春穎　侯春生　李貝貝　熊成　刁青云

（1遼寧省畜產品安全監(jiān)督察所，興城125100；2中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京100093）

遼寧省首次發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺病毒病

袁春穎1侯春生2李貝貝2熊成1刁青云2

（1遼寧省畜產品安全監(jiān)督察所，興城125100；2中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂病毒病是危害蜜蜂健康的重要病原之一。鑒于遼寧地區(qū)部分蜂場蜂群突然大量死亡或新出房蜂不能參加采集任務的現(xiàn)象，通過在發(fā)病蜂場采樣，采用RT-PCR方法進行病毒檢測，發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，以下簡稱BQCV）普遍存在于大量死亡蜂群。進化分析顯示，BQCV遼寧株與吉林株、韓國株相近，表明此毒株與亞洲株最相近。推測黑蜂王臺病毒可能是導致蜂群大量死亡的重要原因之一，為進一步探討病原防治提供基礎。

黑蜂王臺病毒病，PCR鑒定，蜂群大量死亡

1　引言

遼寧省山區(qū)眾多，蜜源豐富，尤其是荊條蜜是我國優(yōu)質蜂蜜之一。但近兩年來，蜂群遭受了嚴重的損失，尤其是今年春季，大部分蜂場均有報道蜂群突然死亡或新出房幼蜂不能飛翔，于箱門前亂爬。前期調查研究中，曾在中華蜜蜂群中檢測到中蜂囊狀幼蟲病毒［1］，自此，病毒病在遼寧地區(qū)的蜂群開始引起關注。同時，另一個病毒，黑蜂王臺病毒，由于其感染子一代的能力較強，對蜂群的危害尤為嚴重。BQCV在世界許多國家及我國蜂場均有報道，但大多是西方蜜蜂感染此病較多，并且該病毒大多時候處于隱性感染狀態(tài)，即看似健康的蜜蜂可能已經感染此病毒，而未被激活。黑蜂王臺病毒首次于發(fā)育的蜂王病蛹中發(fā)現(xiàn)而得名［2］。最初，BQCV主要引起蜂王幼蟲死亡，后來發(fā)現(xiàn)普遍存在于成蜂及幼蟲體內［3］，進一步研究又發(fā)現(xiàn)感染微孢子蟲的蜜蜂更易檢測到BQCV［4］。BQCV不僅能垂直傳播，而且能水平傳播，由于蜂王是唯一產后代的個體，因此對整個蜂群的危害是相當嚴重的。

在國外，Allen［5］等人最先報道了BQCV的基本特征及分布，隨即又發(fā)現(xiàn)微孢子蟲與BQCV的互作將極大增強了BQCV的致病力［6］，繼而發(fā)現(xiàn)其他寄生，如蜂螨也能有效傳播BQCV，并增強其危害性［7］。2000年，BQCV的全基因組序列公布［8］，大大推動了BQCV的研究進展。繼而在我國蜂群中也普遍檢測到BQCV的存在［9-11］。最近，楊倩等［12，13］報道BQCV吉林株的全基因組序列，為深入研究BQCV的分布及危害奠定基礎。近兩年遼寧省部分蜂群發(fā)病頻率較高，原因未明，還未見在遼寧有BQCV報道。本研究通過采集病蜂樣本，采用RT-PCR方法檢測病毒BQCV，為探明BQCV在遼寧地區(qū)的危害及分布奠定基礎。

2　材料與方法

2.1樣本采集

采自遼寧省不同地區(qū)近15個蜂場的健康蜂及巢門前的爬蜂，樣品的采集是基于蜂農發(fā)現(xiàn)蜜蜂大量死亡或爬蜂，采集的樣品快速冷凍低溫保存。蜂種主要包括意大利蜜蜂和中華蜜蜂。

2.2RNA提取

將大約20只蜜蜂置于15 ml無菌管中，在組織勻漿設備進行研磨，至細末狀，加入適量的Trizol總RNA提取試劑，室溫放置10 min后，于12000 rpm下離心15 min，取沉淀加入1 ml 75%酒精清洗，詳細步驟按RNA提取試劑盒說明操作。提好的總RNA溶解于20 μl的TE緩沖液并貯存于-20℃冰箱中備用。

2.3RT-PCR

PCR反應總體積為20 μl。其中提取蜜蜂的總RNA為模板，以Takara反轉錄試劑盒進行反轉錄，2×Taq Mix（天根，北京）及引物“TGG TCA GCT CCC ACT ACC TTA AAC”和“GCA ACA AGA AGA AAC GTA AAC CAC”產生677 bp的片段［14］。擴增反應體系為：cDNA模板為1 μl，上、下游引物各1 μl，反應緩沖液10 μl，無菌水7 μl。反應條件為：94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共33個循環(huán)，72℃再延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 mg/ml溴化乙錠）進行檢測鑒定。陽性鑒定子通過測序PCR產物獲得其基因序列。進化樹分析采用在線生物分析工具進行。

3　結果

3.1BQCV基因擴增產物鑒定

BQCV基因PCR擴增產物經凝膠電泳分析，在700bp左右可見清晰特異性條帶，大小與預期相符，如圖1。

圖1　BQCV電泳鑒定圖（M：100bp DNA Marker；1：BQCV目標產物）

3.2BQCV進化樹分析

利用系統(tǒng)進化樹在線構建工具（http：//www. phylogeny.fr/simple_phylogeny.cgi？workflow_id=4010ce38 ce27ca7b88986ab861c50ea8&tab_index=6&go_next=1# anchor），采用最大相似然法，對已克隆并測序的BQCV遼寧株與來自NCBI數據庫的其他已報道BQCV毒株構建進化樹。結果顯示，BQCV遼寧株與吉林株、韓國株在同一族，表明其進化關系最為相近，屬于典型的亞洲型毒株。

圖2　BQCV部分序列的進化樹構建。黑點代表本研究擴增得到的BQCV部分序列

4　討論

本檢測首次報道了遼寧地區(qū)蜜蜂感染黑蜂王臺病。雖然目前檢測到BQCV存在于遼寧的大部分蜂群中，但并不代表之前未有感染?？赡苁怯捎谥暗臋z測手段有限，也有可能是BQCV大部分處于隱性感染狀態(tài)，而未被激活。本研究檢測到了BQCV，并且可能是導致蜂群大量死亡的重要原因之一，但還不清楚什么原因導致BQCV的增殖或成為顯性感染，原因仍需進一步探討。

本研究不僅檢測BQCV可能是影響遼寧地區(qū)蜜蜂健康新的威脅，而且也為BQCV的快速檢測提供了可借鑒的方法。尤其是對于隱性感染的病毒性疾病診斷可快速、有效的鑒定，為有效控制遼寧地區(qū)病毒病的發(fā)生、傳播提供指導。

［1］李明，馬鳴瀟，張軼博，等.遼寧地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的RT-PCR檢測.畜牧獸醫(yī)科技信息，2008，12：26-27.

［2］Bailey L，Woods RD.Three previously undescribed viruses from the honey bee.Journal of General Virology，1974，25：175-186.

［3］Benjeddou M，Leat N，Allsopp M，et al.Detection of acute of bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR.Appl Environ Microb，2001，5：2384-2387.

［4］Bailey L.The infection of the ventriculus of the adult honeybee by Nosema apis.Parasitology，1955，1：86-94.

［5］Allen M F，Ball B V.The incidence and world distribution of honey bee viruses.Bee world，1996，77：141-162.

［6］Kang Y B，Kim D S，Jang D H.Experimental studies on the pathogenicity and developmental stages of Nosema apis.Korean J Vet Res，1976，16：180-184.

［7］Ball B V，Allen M F.The prevalence of pathogens in honey bee（Apis mellifera）colonies infested with the parasitic mite Varroa Jacobsoni.Ann Appl Biol，1988，113：237-244.

［8］Leat N，Ball B，Govan V，Davison S.Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus，a picorna-like virus of honey bees.J Gen Virol，2000，81：2111-2119.

［9］Li J L，Qin H R，Wu J，et al.The prevalence of parasite and pathogens in Asian honeybees Apis cerana in China.PLoS One，2012，11：e47955.

［10］Ai H X，Yan X，Han R C.Occurrence and prevalence of seven bee viruses in Apis mellifera and Apis cerana apiaries in China. Journal of Invertebrate Pathology，2012，109：160-164.

［11］Zhang X，He S Y，Evans J D，et al.New evidence that deformed wing virus and black queen cell virus are multi-host pathogens.Journal of Invertebrate Pathology，2012，109：156-159.

［12］楊倩，張健，宋戰(zhàn)昀，等.蜜蜂黑蜂王臺病研究進展.病毒學報，2015，3：318-325.

［13］楊倩，張健，宋戰(zhàn)昀，等.黑蜂王臺病毒中國BQCV-JL1株的分離鑒定及全基因組序列分析.病毒學報，2015，3：114-123.

［14］Chunsheng Hou，Hadassah Rivkin，Yossi Slabe，et al.Dynamics of the Presence of Israeli Acute Paralysis Virus in Honey Bee Colonies with Colony Collapse Disorder.Viruses，2014，6：2012-2027.

國家蜂產業(yè)技術體系專項經費（CARS-45-SYZ 3）

袁春穎（1981-），女，高級畜牧師，從事養(yǎng)蜂生產技術研究及推廣工作，E-mail：chunying0914@163.com

刁青云，女，研究員，從事蜜蜂病害研究工作，E-mail：dqyun1@126.com