王君 曹曉鋼 李建民 王順芝

（西藏出入境檢驗檢疫局 西藏拉薩 850002）

HPLC指紋圖譜在鑒別冬蟲夏草上的應(yīng)用

王君 曹曉鋼 李建民 王順芝*

（西藏出入境檢驗檢疫局 西藏拉薩 850002）

［目的］建立冬蟲夏草HPLC指紋圖譜，為其真?zhèn)舞b別提供有效方法，并定量測定其6種共有核苷類成分（尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素）的質(zhì)量。［方法］采用HPLC，色譜柱Waters Symmetry RP-C18（250×4.6 mm，5 μm），以乙酸緩沖鹽（pH 6.5，A）-甲醇（B）為流動相，梯度洗脫，檢測波長260 nm，柱溫25℃，流速0.8 mL/min。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度計算軟件對指紋圖譜進行相似度評價、聚類分析。［結(jié)果］所建立的方法重復(fù)性和精密度良好，建立的冬蟲夏草指紋圖譜包含24個共有峰，各峰分離良好，確認(rèn)出尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素6個共有成分。考察了29批西藏冬蟲夏草，3批西藏以外地區(qū)冬蟲夏草，2批蛹蟲草，1批假蟲草的指紋圖譜與冬蟲夏草指紋對照圖譜的相似度。通過相似度分析，能很好的區(qū)分冬蟲夏草、蛹蟲草和假蟲草。［結(jié)論］所建立的方法簡單可靠，可做為冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的有效實驗方法和依據(jù)。

冬蟲夏草；高效液相色譜法；指紋圖譜；鑒別

1 前言

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌（Cordycepssinensis）寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬（Hepialus）幼蟲上形成的蟲生子囊真菌［1］。冬蟲夏草是我國特有的珍稀名貴藥材，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冬蟲夏草有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，抗腫瘤及抗氧化活性，調(diào)節(jié)腎功能，恢復(fù)肝功能，調(diào)節(jié)心血管功能等功效［2，3］。野生蟲草本身資源極其有限，加之近年來產(chǎn)地受到氣候等各方原因影響，生長環(huán)境遭嚴(yán)重破壞，冬蟲夏草產(chǎn)量逐年下降，價格逐年上漲，致使一些不法商販想盡一切辦法制假售假，以次充好，甚至用和冬蟲夏草形態(tài)相似的亞香棒蟲草、新疆蟲草、草石蠶、地蠶等來欺騙消費者，使消費者真假難辨。

中藥指紋圖譜是以中藥材群體的共有相似性為理論基礎(chǔ)，采用一定的分析手段，得到能夠標(biāo)示該中藥特性共有峰的圖譜，借以鑒別真?zhèn)?，評價藥材質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性［4，5］。為了提供鑒別冬蟲夏草的科學(xué)依據(jù)，本研究對冬蟲夏草進行了高效液相色譜指紋圖譜研究，評價了西藏冬蟲夏草、西藏周邊產(chǎn)區(qū)冬蟲夏草、蛹蟲草、假冬蟲夏草的指紋圖譜與冬蟲夏草對照圖譜的相似度，并考察了指紋圖譜相似度在鑒別冬蟲夏草上的應(yīng)用價值，以期為鑒別冬蟲夏草提供有效的實驗方法。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1儀器

電子天平：Sartorius，BT 224s；液相色譜儀：SHIMADZU，SPD-20A；超聲振蕩器：昆山市超聲振蕩儀器有限公司，KQ-300DE；臺式高速離心機：Hettich，Universal 320R；超純水系統(tǒng)：Millipore，milli-Q；pH儀：Sartorius，820；真空抽濾泵及容器。

2.1.2試劑

乙腈、甲醇：色譜純；乙酸銨、乙酸：分析純；尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院。

2.1.3試樣

本研究收集了32批樣品，其中29批為西藏冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)現(xiàn)場采購和市售樣品（21批采自西藏冬蟲夏草的主產(chǎn)區(qū)-那曲地區(qū)，3批采自林芝地區(qū)，3批采自昌都地區(qū)，2批采自日喀則地區(qū)），3批對比樣品（西藏周邊產(chǎn)區(qū)青海、四川的冬蟲夏草樣品），詳見表1。

表1　供試樣品來源列表

新鮮冬蟲夏草樣品取回，經(jīng)去除泥沙、清洗干凈后，自然風(fēng)干至水分＜10%。將風(fēng)干的供試樣品粉碎，裝入樣品密封袋中，置于冰箱保鮮室儲藏備用。

2.2方法

2.2.1指紋圖譜色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry RP-C18（250×4.6 mm，5 μm）；進樣量：10 μL；流速：0.8 mL/min；柱溫：25℃；檢測時間：45 min；檢測波長：260 nm；流動相：甲醇-0.01 mol/L乙酸銨緩沖液（pH6.5）。系統(tǒng)梯度洗脫，洗脫程序為：0-10 min，甲醇2%-5%；10-15 min，甲醇5%-8%；15-20 min，甲醇8%-10%；20-30 min，甲醇10%-15%；30-45 min，甲醇15%-20%。

2.2.2樣品制備

取樣品1 g于20 mL離心管中，加入20%甲醇水10 mL，稱重；超聲提取30 min，取出放冷，再稱重；用體積分?jǐn)?shù)為20%甲醇補足減重，搖勻，離心15 min（10000 r/min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.3混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液制備

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品尿嘧啶0.0048g，尿苷0.0560g，胸腺嘧啶0.0053 g，腺嘌呤0.0034 g，腺苷0.0700 g，蟲草素0.0027 g，共同放置于100 mL容量瓶中，用20%甲醇水定容至刻度，混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液中各物質(zhì)的濃度分別為48 μg/mL、560 μg/mL、53 μg/mL、34 μg/mL、700 μg/mL、27 μg/mL。再轉(zhuǎn)移10 mL混勻后的儲備液至100 mL容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液中各物質(zhì)的濃度分別為4.8μg/mL、56μg/mL、5.3μg/mL、3.4μg/mL、70 μg/mL、2.7 μg/mL。再將混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液依次轉(zhuǎn)移1、2、4、8、10 mL至10 mL容量瓶中，用20%甲醇水定容至刻度。

2.2.4穩(wěn)定性實驗

稱取冬蟲夏草夏草粉末1.0 g，按所確定溶劑及方法制備供試品溶液，用上述確定的色譜條件，分別于制樣后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h連續(xù)進樣檢測，以色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，計算其相對保留時間、相對峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.2.5精密度實驗

稱取冬蟲夏草夏草粉末1.0 g，按所確定溶劑及方法制備供試品溶液，用上述確定的色譜條件，連續(xù)進樣5次，以色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，計算其相對保留時間、相對峰面積和RSD。

2.2.6重現(xiàn)性實驗

稱取同一冬蟲夏草夏草粉末樣品5份，按照所確定的方法制備供試品溶液，用上述確定的色譜條件分別進樣，以色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，計算其相對保留時間、相對峰面積和RSD。

2.2.7西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜的建立

取29批西藏冬蟲夏草按確定的提取方法制備供試樣品溶液，并以確定色譜條件測定HPLC圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》中進行處理，建立西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜。

2.2.8系統(tǒng)聚類分析

聚類分析根據(jù)數(shù)學(xué)上的距離關(guān)系，對研究樣本信息進行分類，提取中藥色譜指紋圖譜的差異特征，在此次聚類分析中，應(yīng)用SPSS軟件中系統(tǒng)聚類法。先選取29批西藏冬蟲夏草HPLC指紋圖譜中分離度好，面積較大，峰面積變化明顯的若干共有峰，6批對照樣品如果在相應(yīng)的保留時間沒有色譜峰，峰面積以零表示。再將選取的各共有峰峰面積化為以對照峰峰面積為標(biāo)準(zhǔn)的相對峰面積，用SPSS中以歐氏距離平方為測度，進行聚類分析。

3 結(jié)果與討論

3.1方法穩(wěn)定性

分別在0 h、6 h、12 h、24 h和24 h進樣測得的主要色譜峰相對保留時間和峰面積無明顯變化，色譜峰相對保留時間的RSD值在0.04%-0.2%之間，色譜峰峰面積RSD值在0.7%-1.8%之間，表明方法穩(wěn)定性良好。

3.2方法精密度

連續(xù)進樣5次測得的主要色譜峰相對保留時間和峰面積無明顯變化，色譜峰相對保留時間的RSD值在0.07%-1.6%之間，色譜峰峰面積RSD值在0.4%-2.3%之間，表明方法精密度良好。

3.3方法的重現(xiàn)性

同一個樣品制備的5份供試樣品溶液進樣測得的主要色譜峰相對保留時間和峰面積無明顯變化，色譜峰相對保留時間的RSD值在0.04%-0.2%之間，色譜峰峰面積RSD值在0.7%-2.7%之間，表明方法穩(wěn)定性良好。

3.4西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜的建立

將29批西藏冬蟲夏草樣品測定的HPLC圖譜，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》中進行匹配后，10批西藏冬蟲夏草指紋圖譜峰形基本相似，呈現(xiàn)出較高的一致性和規(guī)律性，軟件提取出了24個特征共有峰，詳見圖1。

圖1　西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜

3.5西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜與29批西藏冬蟲夏草樣品指紋圖譜的相似度

西藏冬蟲夏草樣品全譜與共有模式對照譜圖的相似度在0.930-0.998之間，表現(xiàn)出很高的相似性。29批西藏冬蟲夏草樣品指紋圖譜相似度見圖2。

圖2　29批西藏冬蟲夏草指紋圖譜與西藏冬蟲夏草對照圖譜的相似度

3.6西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜與6批對比樣品指紋圖譜的相似度

西藏冬蟲夏草對照圖譜與對比樣品的HPLC圖見圖3。從圖3可以看出，西藏冬蟲夏草的指紋圖譜和四川、青海冬蟲夏草的指紋圖譜非常相似，和蛹蟲草及假蟲草的指紋圖譜差別很大，詳見表2。

圖3　西藏冬蟲夏草對照圖譜與對比樣品的HPLC圖

表2　6批對照樣品和西藏冬蟲夏草對照圖譜的相似度

西藏冬蟲夏草與青海和四川冬蟲夏草的相似度很高，均＞0.9，目前的指紋圖譜和相似度分析方法還無法區(qū)別西藏和其他產(chǎn)區(qū)冬蟲夏草。根據(jù)相似度計算軟件算法特點：峰面積比較大的色譜峰，對整體相似度的影響較大，如果樣品和對照指紋圖譜有相同的，并且含量較高的成分，那樣品和對照圖譜就會有一個較高的相似度［6，7］。西藏、青海、四川的冬蟲夏草圖譜相似度很高，成分含量上有差別。含量最高的為10、15、20號峰，3個產(chǎn)地的冬蟲夏草里都有，這3個峰占總峰面積的60%以上；但是蟲草功效中的重要成分，有很多峰面積很小，比如蟲草素在蟲草中的含量僅為0.003-0.01 mg/g［8］，但含量較小的成分對相似度計算影響很小，含量很小的這些物質(zhì)即使在圖譜中表現(xiàn)為“有”或“無”，對最終的相似度也并沒有影響，這也是用該方法容易得到較高相似度結(jié)果的原因。另有文獻報道［9］，根據(jù)指紋圖譜共有峰峰面積RSD值的顯著變化來區(qū)分不同產(chǎn)地的冬蟲夏草，但筆者認(rèn)為該文獻中取樣量太少（青海冬蟲夏草1份，西藏冬蟲夏草1份，西藏那曲冬蟲夏草1份），用1份樣品來代表一個區(qū)域，代表性遠遠不夠，因為從本研究的實驗數(shù)據(jù)來看，即使一個區(qū)域的冬蟲夏草各成分含量也未呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，而且該文獻中報道的共有峰峰面積的RSD值的變化并沒有和地域呈現(xiàn)出統(tǒng)一性。

3.7西藏冬蟲夏草聚類分析

選取12個特征共有峰，如圖4所示，各特征共有峰峰面積化為以對照峰10號峰峰面積為標(biāo)準(zhǔn)的相對峰面積，結(jié)果見表3。

圖4　西藏冬蟲夏草對照指紋圖譜

表3　35批樣品共有峰相對峰面積

（續(xù)表3）

圖5為系統(tǒng)聚類分析圖，圖5結(jié)果顯示：35批樣品被分為5群，其中32批冬蟲夏草被分為L1、L3、L4群，2批蛹蟲草被分為L2群，1批假蟲草被分為L5群。結(jié)合相似度分析及聚類分析結(jié)果，建立的指紋圖譜能夠?qū)⒍x夏草、蛹蟲草及假蟲草分別開。

圖5　系統(tǒng)聚類分析圖

西藏冬蟲夏草在品質(zhì)特征上呈現(xiàn)出一定的地域性特征，來自同一地區(qū)的樣品的同源性較高。如：西藏以外地區(qū)的3批冬蟲夏草樣品全部聚類在L4群內(nèi)，自成一群；那曲地區(qū)的21批樣品，有19批聚于L1群內(nèi)，占90%；昌都地區(qū)只采購1批樣品，被并入L1群內(nèi)；林芝地區(qū)4批樣品有3批聚于L1群內(nèi)，占75%；日喀則地區(qū)的3批樣品有2批聚于L1群內(nèi)，占66.7%；西藏地區(qū)冬蟲夏草29批有24批聚于L1群內(nèi)，4批聚于L3群類，1批聚于L4群類，總體來說符合相似度分析的結(jié)果。

3.86種共有核苷類物質(zhì)的含量分析

西藏冬蟲夏草樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜見圖6。

圖6　西藏冬蟲夏草樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

圖6顯示，6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在西藏冬蟲夏草都含有，含量各有不同。標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序依次為：尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素。

將5種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液按照已確定的色譜條件進樣，進行線性回歸，6個標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表4。

表4　6種核苷物質(zhì)的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

以樣品批次為橫坐標(biāo)，分別以表6中尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素含量為縱坐標(biāo)，繪制29批西藏冬蟲夏草6個共有峰質(zhì)量的折線圖，見圖7。

圖7　29批西藏冬蟲夏草中6種核苷類物質(zhì)含量折線圖

圖7結(jié)果顯示，29批樣品中尿嘧啶含量為0.029-0.047 mg/g，尿苷含量為1.0-2.1 mg/g，胸腺嘧啶含量為0.11-0.38 mg/g，腺嘌呤含量為0.019-0.095 mg/g，腺苷含量為0.48-0.95 mg/g，蟲草素含量為0.0027-0.013 mg/g。

4 結(jié)論

本研究建立了冬蟲夏草的HPLC指紋圖譜，同時還對主要核苷類成分進行測定，用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》提取了24個共有特征峰。通過對29批西藏冬蟲夏草、3批其他產(chǎn)地冬蟲夏草、2批蛹蟲草、1批假蟲草與冬蟲夏草指紋圖譜的相似度比較，結(jié)果顯示本研究建立的方法能區(qū)分冬蟲夏草和蛹蟲草、假蟲草，但對不同產(chǎn)地的冬蟲夏草區(qū)分度不夠；聚類分析的結(jié)果與相似度分析結(jié)構(gòu)基本一致。本研究所建方法為冬蟲夏草的真?zhèn)舞b定提供了有效的實驗方法，為冬蟲夏草的產(chǎn)地區(qū)分提供了前期技術(shù)儲備。

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Identification of Cordyceps sinensis by HPLC Fingerprint

Wang Jun，Cao Xiaogang，Li Jianmin，Wang Shunzhi*
（Tibet Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lhasa，Tibet，850002）

［Objective］To establish HPLC fingerprints for indentification of Cordyceps sinensis in Tibet.［Methods］The HPLC analysis was performed on Waters Symmetry RP-C18 column（250×4.6 mm，5 μm）and detected at 260 nm.The mobile phase was consisted of methnol and acetate buffer（pH 6.5）using a gradient elution.The column temperature was 25℃，and the flow rate was 0.8 mL/min.The similarity of fingerprints was evaluated by the fingerprint similarity calculation software，then，duster analysis was studied.［Results］The precision and repeatability of the method were good as the relative standard deviation（RSD）of intrabatch was less than 5%.The fingerprints of 29 batches of Cordyceps sinensis in Tibet，3 Cordyceps sinensis from Sichuan and Qinghai，2 Cordyceps militaris，and 1 fake Cordyceps sinensiswerecomparedincharacteristiccomponentsandsimilarity.Theresultsdemonstratedthat CordycepssinensiswasdifferentiatedfromtheCordycepsmilitarisandfakeCordycepssinensis.［Conclusion］The method was simple，feasible and reproducible，and can be offered as technical basis for the identification of Cordyceps sinensis.

Cordyceps sinensis；HPLC；Fingerprint；Identification

TS201.6

E-mai：wangjun19830103@qq.com；*通訊作者E-mail：wangsz@xzciq.gov.cn

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2012IK191）

2015-08-08