文|本刊編輯部

新生代飼用酶實(shí)現(xiàn)“三贏”

文|本刊編輯部

在飼料添加劑中，酶制劑是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的天然、綠色、無污染、無殘留的生物制品。飼料用酶分子改良技術(shù)的研究與相關(guān)產(chǎn)品的創(chuàng)制。將更好地促進(jìn)中國農(nóng)業(yè)技術(shù)與國際接軌。

隨著現(xiàn)代化畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料中添加抗生素在抗病、促生長的同時(shí)，也帶來細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的后果。如果使用不當(dāng)，還會(huì)造成畜產(chǎn)品中的藥物殘留超標(biāo)。目前，許多國家都在努力加大飼料添加劑的管理，歐盟、日本、美國等國家相繼頒布了一系列法律，在飼料中禁止或限制使用抗生素等藥物類飼料添加劑。我國農(nóng)業(yè)部今年公布的“農(nóng)業(yè)部第2292號(hào)公告”規(guī)定：自2016年12月31日起，停止經(jīng)營、使用用于食品動(dòng)物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。

無疑，天然、綠色、無污染、無殘留成為全世界畜牧業(yè)發(fā)展的主題。

穩(wěn)定性差是飼料酶制劑工業(yè)化中的一大難題

自從1975年美國飼料工業(yè)首次把酶制劑作為添加劑應(yīng)用于配合飼料中并取得顯著效果后，飼用酶制劑日益受到世界養(yǎng)殖業(yè)的重視。

國內(nèi)外學(xué)者研究和企業(yè)應(yīng)用表明，酶制劑用于飼料，可以擴(kuò)大飼料原料的來源，提高飼料原料的營養(yǎng)價(jià)值，調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫力，提高動(dòng)物的免疫功能。通過降解單胃動(dòng)物幾乎不能利用的一些多糖，從而提高了日糧的代謝能值，對(duì)粗蛋白的消化率亦有較明顯的提高。

目前國內(nèi)外很多企業(yè)實(shí)現(xiàn)了飼料酶制劑的工業(yè)化，獲得了較高酶活力的菌株，但在粗放的工業(yè)條件下（如高溫、高壓、重金屬離子、氧化劑和極端pH值等），天然酶常會(huì)遭到破壞，使酶的生產(chǎn)和使用受到極大限制。當(dāng)前工業(yè)上直接利用酶制劑時(shí)還存在一些缺點(diǎn)，如穩(wěn)定性差、使用率低、不能在有機(jī)溶劑中使用、壽命不長等，造成了使用酶的成本升高。其中，酶的穩(wěn)定性是現(xiàn)階段酶應(yīng)用中的一大難題。

主攻性能和成本的開拓性研究

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所姚斌研究團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的863計(jì)劃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域高技術(shù)項(xiàng)目“飼用酶的分子改良與產(chǎn)品創(chuàng)制”課題執(zhí)行3年以來，取得了重要進(jìn)展。

研究團(tuán)隊(duì)在國內(nèi)率先開展將基因工程等高新技術(shù)應(yīng)用到傳統(tǒng)飼料行業(yè)這一開拓性的研究工作中去。

針對(duì)阻礙飼料用酶規(guī)模應(yīng)用的兩大瓶頸性問題——酶的性能和生產(chǎn)成本，課題組確立了從酶的分子生物學(xué)基礎(chǔ)性科學(xué)問題入手、系統(tǒng)性解決問題的研究思路；建立了完整的酶基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)體系，打破了國際大公司的壟斷，并使我國飼料用酶迅速發(fā)展成為具有國際競(jìng)爭(zhēng)力、效益顯著的新興產(chǎn)業(yè)；確立了在學(xué)術(shù)研究和飼料高新技術(shù)實(shí)際應(yīng)用上的領(lǐng)先地位，并起到示范作用。

同時(shí)，科研團(tuán)隊(duì)還創(chuàng)建了飼料用酶及基因的高效克隆技術(shù)體系，獲得了百余個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和應(yīng)用價(jià)值的新型飼料用酶基因，突破了發(fā)達(dá)國家在飼料用酶資源方面的專利壁壘，使我國在飼料用酶基因資源的爭(zhēng)奪上處于國際制高點(diǎn)，奠定了我國飼料用酶的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)。

不僅如此，在酶的構(gòu)效機(jī)理研究方面也取得了新的突破，創(chuàng)新了酶蛋白分子改良技術(shù)體系；建立了酶蛋白分子的生物信息學(xué)分析平臺(tái)，分析酶蛋白或氨基酸的分子動(dòng)力學(xué)，能量、表面電荷和分子鍵等的動(dòng)態(tài)變化，用以對(duì)多種酶蛋白的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制等特征與其重要理化特性（溫度、pH特性及抗逆性等）之間相互關(guān)系的分子機(jī)理進(jìn)行研究；借助生物信息分析平臺(tái)，針對(duì)性地指導(dǎo)酶蛋白改良的理性設(shè)計(jì)，建立了以活性中心為核心、由面到點(diǎn)進(jìn)行酶分子突變的新技術(shù)和方法，快速實(shí)現(xiàn)酶分子的“跳躍式進(jìn)化”，獲得大量突變體；利用自主構(gòu)建的木聚糖酶融合胞外表達(dá)載體等突變文庫篩選系統(tǒng)，結(jié)合應(yīng)用微培養(yǎng)、熒光技術(shù)等高通量定向篩選技術(shù)，快速篩選獲得有效突變體。

該研究獲得了多種性質(zhì)得到改良、可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的改良酶，滿足了飼料高溫制粒和動(dòng)物消化生理的特殊要求，以及通過快速篩選技術(shù)與模擬胃腸道酶性能評(píng)估技術(shù)，快速評(píng)估酶的應(yīng)用潛力并指導(dǎo)改良酶的篩選等一整套成熟易操作的酶蛋白分子改良與篩選技術(shù)，并利用該技術(shù)進(jìn)行了葡萄糖氧化酶、真菌淀酶、脂肪酶、阿魏酸酯酶、非淀粉多糖酶等多種飼料用酶的分子改良，獲得了綜合性能優(yōu)良的改良酶資源。

課題“高油高蛋白油料水酶法提油及其蛋白資源利用關(guān)鍵技術(shù)研究”中期檢查。

通過酶基因的優(yōu)化，新促表達(dá)因子的挖掘利用，不同促表達(dá)因子的合理整合，受體菌株的改良等方法，闡明了酶表達(dá)機(jī)制上的一些關(guān)鍵問題，創(chuàng)建了表達(dá)量達(dá)到10克/升以上級(jí)的高效表達(dá)技術(shù)體系，系統(tǒng)解決了飼料用酶表達(dá)量低、生產(chǎn)成本高的問題，為飼料用酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用提供了技術(shù)保障。

通過對(duì)團(tuán)隊(duì)自己構(gòu)建工程菌株在發(fā)酵罐水平反復(fù)工藝測(cè)試與摸索，快速有效地提高了工程菌株的發(fā)酵水平。葡萄糖氧化酶、真菌淀粉酶、脂肪酶3種在工程菌中的表達(dá)量為4500U/毫升（國內(nèi)外的一般表達(dá)水平：＜500U/毫升）、3200U/毫升［國內(nèi)外的一般表達(dá)水平：2000U/克（固體發(fā)酵）］、22000U/毫升（國內(nèi)外的一般表達(dá)水平：＜10000U/毫升），表達(dá)量和催化效率遠(yuǎn)優(yōu)于國內(nèi)外其他酶制劑水平。以飼料用葡萄糖氧化酶為例，該酶可在動(dòng)物胃腸道中產(chǎn)生厭氧環(huán)境并形成具有殺菌作用的過氧化氫，殺滅有害細(xì)菌。由此，可作為抗生素的替代品應(yīng)用，減少抗生素的使用，提高飼料利用率，保障動(dòng)物產(chǎn)品安全。目前葡萄糖氧化酶因性能差、生產(chǎn)成本高的問題，還未在飼料工業(yè)中廣泛應(yīng)用。

研究團(tuán)隊(duì)從肉雞的腸道微生物中克隆篩選得到一個(gè)綜合性質(zhì)較優(yōu)良的葡萄糖氧化酶及其基因。該酶具有適合于在飼料中應(yīng)用的綜合優(yōu)良性質(zhì)：最適溫度為40℃，在20～50℃下能維持90%以上的酶活性，在酸性和中性環(huán)境中能保持較高的活性；該酶還具有極好的抗蛋白酶能力，能夠抵御胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解作用。這些特性使其適合于在肉雞、蛋雞、豬及水產(chǎn)飼料中應(yīng)用。

進(jìn)一步構(gòu)建了高效表達(dá)葡萄糖氧化酶的重組酵母，在其表達(dá)量達(dá)到12毫克/毫升發(fā)酵液，其效價(jià)達(dá)4000U/毫升，較國內(nèi)外的報(bào)道和專利水平高20倍以上。同時(shí)，建立了生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的高細(xì)胞密度發(fā)酵工藝、產(chǎn)品后加工工藝，酶在后加工過程中的回收率超過85%。該技術(shù)已完成中試和試生產(chǎn)，技術(shù)成熟，可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，整體達(dá)到國際領(lǐng)先水平。

除此之外，作為科技管理部門，中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心在飼用酶的分子改良與產(chǎn)品創(chuàng)制項(xiàng)目的實(shí)施過程中也積累了豐富的組織實(shí)施和管理經(jīng)驗(yàn)，組建了一支高素質(zhì)的團(tuán)隊(duì)，更好地保障了項(xiàng)目的先進(jìn)性和創(chuàng)新性。

“飼用酶的分子改良與產(chǎn)品創(chuàng)制”課題中期檢查。

突破壁壘，改良技術(shù)效益卓著

通過863計(jì)劃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域項(xiàng)目和其他國家課題的支持，近3年，研究團(tuán)隊(duì)建立了有效的分子設(shè)計(jì)技術(shù)和篩選技術(shù)5項(xiàng)，申請(qǐng)并獲得發(fā)明專利20余項(xiàng)，發(fā)表研究論文40余篇，獲國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)。

市場(chǎng)應(yīng)用方面，酶蛋白分子改良技術(shù)體系技術(shù)成果得到了很好的推廣應(yīng)用。經(jīng)過3年的時(shí)間，利用該技術(shù)生產(chǎn)銷售單酶及復(fù)合酶產(chǎn)品超過20萬噸，在全國30多個(gè)省區(qū)上千家飼料及養(yǎng)殖企業(yè)推廣應(yīng)用，并出口歐美等20余個(gè)國家。產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)的豬、雞、水產(chǎn)等動(dòng)物飼料，并節(jié)約飼料糧5000萬噸、磷資源1000萬噸，減少養(yǎng)殖業(yè)磷氮等有機(jī)物排放1300萬噸。

由于成功地將酶蛋白分子改良技術(shù)研究成果轉(zhuǎn)化到實(shí)際生產(chǎn)中去，目前國內(nèi)飼料用酶制劑的價(jià)格明顯降低。利用飼料用酶技術(shù)生產(chǎn)的植酸酶產(chǎn)品占據(jù)了國內(nèi)植酸酶市場(chǎng)份額的90%以上，60%以上的產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)出口，國外產(chǎn)品基本退出中國市場(chǎng)。

此外，該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，提高了養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用率，進(jìn)而每年可節(jié)約飼料原料百萬噸以上，節(jié)省飼料成本數(shù)億元，并使動(dòng)物糞便中排出的有機(jī)污染大量減少，實(shí)現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益“三贏”。