呂　潔，梁　燕*，趙菁菁，張　顏，常培培，秦　蕾，李云洲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌　712100）

LYC-B基因沉默對(duì)紫色番茄果實(shí)主要色素及揮發(fā)性物質(zhì)的影響

呂潔，梁燕*，趙菁菁，張顏，常培培，秦蕾，李云洲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌712100）

利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)，抑制紫色番茄果實(shí)成熟過(guò)程中番茄紅素β-環(huán)化酶（LYC-B）基因的表達(dá)，并分析番茄果實(shí)中主要色素及揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量變化。結(jié)果表明：LYC-B基因沉默可提高紫色番茄果實(shí)中番茄紅素的含量；頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)到6-甲基-5-庚烯-2-酮等類胡蘿卜素相關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)的含量增加，反-2-辛烯醛、己醇、反-2-庚烯醛、水楊酸甲 酯和順-3-己烯醇等主要揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量增加。因此，LYC-B基因沉默可以增加番茄紅素及部分主要揮發(fā)性物質(zhì)的含量，影響番茄果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味品質(zhì)。

番茄；LYC-B基因沉默；番茄紅素；揮發(fā)性物質(zhì)

番茄（Solanum lycopersicum L.）具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如類胡蘿卜素、維生素、氨基酸等，并因其風(fēng)味多樣而深受消費(fèi)者青睞。類胡蘿卜素是植物天然色素的總稱，在預(yù)防人類疾病和維持健康方面有重要作用［1］。類胡蘿卜素也是一些重要揮發(fā)性物質(zhì)的前體，這些物質(zhì)為番茄果實(shí)提供特殊的香氣，決定著番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)［2］。類胡蘿卜素降解途徑是形成番茄果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的最重要途徑［3］，其含量直接影響著類胡蘿卜素衍生揮發(fā)性物質(zhì)的釋放［4］，例如6-甲基-5-庚烯-2-酮、牻牛兒基丙酮、β-紫羅蘭酮及相關(guān)成分均來(lái)自類胡蘿卜素的氧化分解［2］。番茄紅素作為主要的類胡蘿卜素，對(duì)番茄果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)形成具有重要的貢獻(xiàn)［5］。Fay等［6］發(fā)現(xiàn)番茄紅素特效裂解過(guò)氧化酶BoLCD可以裂解番茄紅素形成6-甲基-5-庚烯-2-酮，可提高番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。

番茄紅素β-環(huán)化酶（LYC-B）基因是類胡蘿卜素代謝中番茄紅素向下游轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因［7］，可以催化番茄紅素分子的兩個(gè)末端形成β-環(huán)，即形成β-胡蘿卜素。徐加新等［8］研究表明，反義LYC-B基因可以提高番茄果實(shí)中番茄紅素的含量。目前對(duì)LYC-B基因與其他色素及揮發(fā)性物質(zhì)的關(guān)系研究較少。

紫色番茄作為新興的番茄品種，具有極強(qiáng)的抗氧化性等營(yíng)養(yǎng)保健功能，風(fēng)味獨(dú)特［9］。本實(shí)驗(yàn)室常培培等［10］對(duì)其果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)全面的分析鑒定，本實(shí)驗(yàn)將在此基礎(chǔ)上，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)［11-12］，探究類胡蘿卜素代謝途徑中關(guān)鍵酶基因LYC-B與紫色番茄果實(shí)中主要色素及揮發(fā)性物質(zhì)間的關(guān)系，為番茄品質(zhì)性狀研究與改良提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

供試紫色番茄品種為黑櫻桃（保存單位編號(hào)：CI5004），果皮無(wú)色，果肉紫紅色，由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄育種課題組提供。2014年3月底定植于園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)塑料大棚內(nèi)，當(dāng)植株第三花序第一、二朵花開(kāi)放時(shí)掛牌標(biāo)記開(kāi)花期。在果實(shí)綠熟期［13］（開(kāi)花后30 d，此時(shí)果實(shí)充分長(zhǎng)大，果色綠色，肉質(zhì)堅(jiān)硬）采收果實(shí)，離體條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

農(nóng)桿菌GV3101、pTRV1、pTRV2和pTRV2：PDS等由園藝學(xué)院番茄育種課題組保存提供。

內(nèi)切酶、連接酶Fermentas公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒大連寶生物工程公司；2-壬酮（色譜純）上海邁瑞爾公司；氯化鈉（分析純）、番茄紅素標(biāo)品（色譜純）北京中科儀友化工技術(shù)研究院。

1.2儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀美國(guó)Bio-Rad公司；LC-20A高效液相色譜日本島津公司；ISQ氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用儀（Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；HP-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 .m）、恒溫磁力攪拌器美國(guó)Troemner公司；100 μm PDMS固相微萃取頭、SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄美國(guó)Supelco公司；勻漿機(jī)美的集團(tuán)。

1.3方法

1.3.1VIGS病毒載體pTRV2：LYC-B的構(gòu)建

VIGS誘導(dǎo)基因沉默是指攜帶目的基因片段的pTRV2與pTRV1混合后浸染植物后，可誘導(dǎo)植物內(nèi)源目的基因沉默。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上登錄的番茄紅素β-環(huán)化酶（登錄號(hào)為X86452.1）序列，選取3'端375 bp特異性較強(qiáng)的片段，添加BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，共392 bp，設(shè)計(jì)引物為L(zhǎng)YC-B F：5'-CGC GGA TCC CAT CAC TCG TAG CTC GTC-3'；LYC-B R：5'-GCT CTA GAT ATC CAT ACC GAA GCA GA-3'。載體構(gòu)建過(guò)程參照李翠［14］的方法。

1.3.2VIGS誘導(dǎo)番茄果實(shí)LYC-B基因沉默

處理設(shè)置：以注射pTRV2：LYC-B菌液的果實(shí)為沉默LYC-B基因的處理，pTRV2：00為陰性對(duì)照，pTRV2：PDS為陽(yáng)性對(duì)照，未注射菌液為空白對(duì)照。

番茄果實(shí)注射浸染：參照Orzaez等［15］的方法對(duì)果實(shí)進(jìn)行注射處理。將含有pTRV2：LYC-B、pTRV2：00和pTRV2：PDS質(zhì)粒的菌液分別在LB篩選培養(yǎng)基中振蕩過(guò)夜，取培養(yǎng)產(chǎn)物以1∶25的比例稀釋于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm為0.5～0.8。培養(yǎng)產(chǎn)物離心后，使用懸浮培養(yǎng)基MgCl2+MES（10 mmol/L，pH 5.5）等體積懸浮菌體，再次離心后，重懸菌體并調(diào)節(jié)OD600nm為1.0。同樣方法準(zhǔn)備pTRV1菌液，室溫下放置3 h后，將pTRV1分別與pTRV2：LYC-B、pTRV2：00和pTRV2：PDS菌液混合注射離體果實(shí)。使用1 mL注射器從果頂注射果實(shí)，當(dāng)有菌液從萼片處溢出時(shí)，停止注射，用吸水紙擦干溢出的菌液。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每次20 個(gè)果實(shí)。注射后的果實(shí)放置在人工氣候箱中，溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度70%，光周期為16 h晝長(zhǎng)及8 h夜長(zhǎng)。

取樣分析：八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene desaturase，PDS）是VIGS誘導(dǎo)中的報(bào)告基因，抑制PDS基因表達(dá)會(huì)使果實(shí)不能正常轉(zhuǎn)色，果實(shí)表面出現(xiàn)綠色區(qū)域或黃色區(qū)域［12］。在注射果實(shí)2 周后，PDS基因陽(yáng)性對(duì)照組果實(shí)的沉默面積不再發(fā)生變化時(shí)，PDS基因沉默效率達(dá)到最高［11］，此時(shí)其他處理中相應(yīng)基因的沉默效率也達(dá)到最高。參照PDS基因沉默的部位，提取其他處理果實(shí)相同部位的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，EF1α為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，檢測(cè)沉默部位LYC-B基因的表達(dá)量。分別將各處理中LYC-B基因表達(dá)量低的部位用勻漿機(jī)打成勻漿，液氮冷凍后保存在-80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。

1.3.3指標(biāo)測(cè)定

參照劉沐霖等［16］采用高效液相色譜法，測(cè)定VIGS誘導(dǎo)果實(shí)番茄紅素及β-胡蘿卜素的含量。

參照Viljanen［17］、常培培［10］等采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定VIGS誘導(dǎo)果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)。

樣品制備：稱取VIGS處理后果肉勻漿約14 g，加入3 g氯化鈉，于40 mL頂空瓶中。將頂空瓶置于50 ℃恒溫磁力攪拌器上，平衡10 min，頂空吸附40 min，進(jìn)樣口處解吸3 min，進(jìn)行GC-MS分析。每個(gè)處理重復(fù)3 次取平均值。

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX 彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 .m），進(jìn)樣口250 ℃；升溫程序?yàn)?0 ℃保持2.5 min，10 ℃/min升至110 ℃，然后以3.0 ℃/min升溫至180 ℃，15.0 ℃/min 升溫至230 ℃維持3 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron ionization，EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；SM離子掃描，質(zhì)量掃描范圍為m/z 35～500。

1.4數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖；用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Tukey's顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1VIGS病毒載體pTRV2：LYC-B的構(gòu)建

采取黑櫻桃番茄幼苗新葉，使用TRIZOL試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用引物L(fēng)YC-B F和LYC-B R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期的392 bp的特異序列（圖1A）。該片段與pMD-18T載體連接，測(cè)序驗(yàn)證后，與TRV2病毒載體連接，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證。

由圖1B、1C可知，菌液PCR擴(kuò)增和雙酶切均得到392 bp的片段，與克隆的LYC-B片段大小相符，表明成功構(gòu)建了VIGS病毒pTRV2：LYC-B載體，并獲得了含有pTRV2：LYC-B質(zhì)粒的陽(yáng)性單克隆農(nóng)桿菌。

圖1　重組質(zhì)粒pTRVV22：LLYYCC--BB的克隆及鑒定Fig.1　Cloneing and identification of pTRV2：LYC-B recombinant cloning vector

2.2VIGS誘導(dǎo)番茄果實(shí)LYC-B基因沉默

綠熟期離體番茄果實(shí)注射菌液2 周后，陽(yáng)性對(duì)照組的果實(shí)出現(xiàn)PDS基因沉默癥狀，果實(shí)表面出現(xiàn)黃綠色區(qū)域（圖2D），說(shuō)明此時(shí)的VIGS誘導(dǎo)效果最大［12］。通過(guò)觀察果實(shí)顏色變化情況發(fā)現(xiàn)，LYC-B基因沉默處理，陰性對(duì)照以及空白對(duì)照的果實(shí)外觀沒(méi)有明顯區(qū)別，都轉(zhuǎn)色均勻（圖2B、2C、2E）。

圖2　VIGS誘導(dǎo)番茄果實(shí)顏色變化Fig.2　Color change of tomato fruits induced by VIGS

圖3　VIGS果實(shí)中LYC-BLYC-B基因表達(dá)分析Fig.3　Transcript levels of LYC-B gene in gene-silenced tomato fruits

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LYC-B基因的表達(dá)量。如圖3所示，LYC-B基因沉默處理果實(shí)中，LYC-B的轉(zhuǎn)錄水平比陰性對(duì)照組降低了約75%。結(jié)果表明，雖然用肉眼觀察不到果實(shí)顏色明顯的變化，但是VIGS誘導(dǎo)極顯著降低了果實(shí)內(nèi)源LYC-B基因的表達(dá)量，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的表達(dá)量無(wú)顯著差異。

2.3LYC-B基因沉默對(duì)番茄果實(shí)番茄紅素和β-胡蘿卜素含量的影響

利用高效液相色譜法檢測(cè)沉默果實(shí)和對(duì)照處理中番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量。由圖4可知，各處理組之間番茄紅素含量差異顯著，LYC-B基因沉默的果實(shí)中番茄紅素含量最高，為12.27 mg/100 g，顯著高于兩個(gè)對(duì)照組（陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組），與陰性對(duì)照組相比增加了14.03%，與空白對(duì)照組相比增加了29.15%。LYC-B基因沉默的果實(shí)中β-胡蘿卜素含量顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組二者之間差異不顯著。說(shuō)明LYC-B基因沉默提高了果實(shí)中番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量。

圖 44 　LLYYCC--BB基因沉默對(duì)番茄果實(shí)番茄紅素（AA）　和β--胡蘿卜素含量（BB）的影響Fig.4　Contents of lycopene （A） and β-carotene （B） in LYC-B gene silenced tomato fruits

2.4LYC-B基因沉默對(duì)番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響

利用HS-SPME-GC-MS方法檢測(cè)沉默果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的變化情況。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Xcalibur軟件處理，與圖譜庫(kù)（NIST2011）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行匹配［18-20］，共檢測(cè)到了52 種正反匹配度大于800的化合物。運(yùn)用峰面積歸一法，求得各物質(zhì)的相對(duì)含量，并按照化合物官能團(tuán)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分類［21］，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　LYC-B基因沉默番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of volatile compounds in LYC-B genesilenced tomato fruits

續(xù)表1

2.4.1LYC-B基因沉默對(duì)番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類的影響

由表1可知，所有處理中共檢測(cè)到52 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類10 種、醛類18 種、酮類6 種、烴類5 種、酯類3 種和其他類10 種。

在LYC-B基因沉默的處理組中，檢測(cè)到37 種物質(zhì)，與陰性對(duì)照組相比，醇類、酮類、烴類和其他類的個(gè)數(shù)均增加了1 種，醛類增加了2 種，酯類減少了1 種。檢測(cè)到了苯乙醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、萘和反-檸檬醛等陰性對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到的物質(zhì)，沒(méi)有檢出2-己烯醛和庚醛等陰性對(duì)照組中存在的物質(zhì)。結(jié)果表明，LYC-B基因沉默增加了揮發(fā)性物質(zhì)的種類，改變了揮發(fā)性物質(zhì)的組成。

陰性對(duì)照組中酮類和酯類的個(gè)數(shù)均比空白對(duì)照組多2 種，醛類數(shù)量比空白對(duì)照減少4 種，二者間醇類、烴類和其他類數(shù)量差別不大，揮發(fā)性物質(zhì)總數(shù)一致。

2.4.2LYC-B基因沉默對(duì)番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的影響

圖5　5　LYC-BLYC-B基因沉默番茄果實(shí)各類揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.5　Relative contents of volatile compounds in LYC-B gene-silenced tomato fruits

由圖5可知，LYC-B基因沉默處理組與陰性對(duì)照組相比，酮類相對(duì)含量（15.34%）增加了37.7%（陰性對(duì)照組為11.14%），其他類相對(duì)含量（4.76%）增加了27.6%（陰性對(duì)照組為3.73%），而醇類、醛類、烴類和酯類相對(duì)含量均沒(méi)有顯著變化。結(jié)果表明，LYC-B基因沉默顯著增加了酮類物質(zhì)和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量，對(duì)剩余物質(zhì)含量影響不大。

陰性對(duì)照組中醇類、酯類和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量高于空白對(duì)照組，醛類相對(duì)含量低于空白對(duì)照組，酮類和烴類的相對(duì)含量與空白對(duì)照組間差異不顯著（圖5）。由此可見(jiàn)，注射空載體的菌液對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的含量造成了影響，推測(cè)可能是由于注射過(guò)程對(duì)果實(shí)造成了傷害或病毒空載體本身的作用，從而導(dǎo)致了揮發(fā)性物質(zhì)的變化。

此外，根據(jù)番茄風(fēng)味特征性物質(zhì)以及對(duì)番茄風(fēng)味品質(zhì)貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)［3，17，20］，對(duì)LYC-B基因沉默后番茄主要揮發(fā)性物質(zhì)變化情況進(jìn)行了分析（表1，圖6）。在LYC-B基因沉默后，某些主要揮發(fā)性物質(zhì)含量發(fā)生了明顯變化，如反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯、反-2-辛烯醛、己醇和順-3-己烯醇等的含量顯著增加，其中，與陰性對(duì)照相比，反-2-庚烯醛的含量增加了2.48 倍，增幅最大；水楊酸甲酯增加了43.51%；6-甲基-5-庚烯-2-酮含量提高了41.40%；反-2-辛烯醛增加了14.16%；己醇和順-3-己烯醇分別增加了約7%。結(jié)果表明LYC-B基因沉默顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）增加了部分主要揮發(fā)性物質(zhì)的含量，促進(jìn)了揮發(fā)性物質(zhì)的釋放。

圖6　6　LYC-BLYC-B基因沉默番茄果實(shí)主要揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.6　Relative contents of the major volatile compounds in LYC-B gene-silenced tomato fruits

3　討 論

LYC-B基因表達(dá)的下調(diào)可阻礙番茄紅素向具環(huán)類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化，使番茄紅素的分解受阻，從而提高番茄果實(shí)中番茄紅素的含量，改善番茄果實(shí)的品質(zhì)［22］。在本研究中，利用VIGS技術(shù)誘導(dǎo)紫色番茄果實(shí)中LYC-B基因沉默后，LYC-B基因的表達(dá)量降低了75%（圖3），且LYC-B基因沉默后，果實(shí)中番茄紅素的含量為12.27 mg/100 g，顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（圖4），這與前人研究結(jié)果類似［8，23］。另外，沉默LYC-B基因后β-胡蘿卜素的含量也高于兩個(gè)對(duì)照組（圖4），這與前人［24］采用農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化LYC-B反義基因使得轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中β-胡蘿卜素含量降低的結(jié)果有所不同。推測(cè)可能是由于本實(shí)驗(yàn)是在果實(shí)綠熟期沉默LYC-B基因，果實(shí)早期發(fā)育過(guò)程中形成的殘余的LYC-B基因可以低水平的編碼番茄紅素β-環(huán)化酶，使部分番茄紅素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素，可能導(dǎo)致β-胡蘿卜素的含量高于對(duì)照。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比番茄紅素含量增加，β-胡蘿卜素含量差異不顯著。這可能是因?yàn)轭惡}卜素代謝是植物體內(nèi)一個(gè)主要而復(fù)雜的次生代謝系統(tǒng)，不僅僅與植物的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味相關(guān)，可能與植物的應(yīng)激反應(yīng)也有關(guān)系，病毒載體的進(jìn)入以及注射很可能啟動(dòng)了應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)，引起色素含量發(fā)生變化，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

在番茄中，已經(jīng)鑒定出超過(guò)400 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中僅有16 種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)番茄風(fēng)味具有重要意義［2］。本研究在紫色番茄中檢測(cè)出了順-3-己烯醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯、1-戊烯-3-酮、反-2-庚烯醛、反-2-己烯醛、己醛、2-苯基乙醇、苯乙醛、2-異丁基噻唑等10 種物質(zhì)，其他如順-3-己烯醛、β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等物質(zhì)沒(méi)有檢測(cè)到（表1），常培培等［10］在紫色品種中檢測(cè)到的香葉基丙酮、棕櫚酸乙酯在本研究中也沒(méi)有檢測(cè)出，這可能是由于栽培條件以及離體研究對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的種類產(chǎn)生了影響［25-26］。

番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)中包含一些特殊氣味物質(zhì)，能增加果實(shí)的清香氣味，提高果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)［27］，如本研究中檢測(cè)到LYC-B基因沉默后含量增加的物質(zhì)：6-甲基-5-庚烯-2-酮、反-2-辛烯醛、己醇、反-2-庚烯醛、水楊酸甲酯、順-3-己烯醇等，LYC-B基因沉默后出現(xiàn)的特有物質(zhì)6-甲基-5-庚烯-2-醇和反-檸檬醛。6-甲基-5-庚烯-2-酮和6-甲基-5-庚烯-2-醇的前體物質(zhì)是番茄紅素，當(dāng)番茄紅素的含量升高時(shí)，二者的釋放量也相應(yīng)的增加［5］；反-檸檬醛是類胡蘿卜素裂解的產(chǎn)物，是合成紫羅蘭酮及大馬酮等物質(zhì)的原料，呈檸檬香味［28］；反-2-辛烯醛能提高果實(shí)的青葉香氣，己醇能釋放果香味。關(guān)于番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)與品質(zhì)性狀相關(guān)性分析的研究表明［29］，反-2-辛烯醛與番茄紅素的相關(guān)性達(dá)到了0.931，反-2-辛烯醛與己醇成顯著正相關(guān)；反-2-庚烯醛與番茄甜味物質(zhì)有關(guān)，呈現(xiàn)脂肪氣味、青草香；水楊酸甲酯，又稱冬青油，有獨(dú)特的氣味；順-3-己烯醇具有類似異戊醇的香味，呈現(xiàn)新鮮的青葉香氣［30］。本研究利用VIGS技術(shù)將LYC-B基因沉默后，番茄果實(shí)中的這些特殊氣味物質(zhì)的含量普遍增加（表1，圖6），影響了番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。

4　結(jié) 論

利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)成功抑制了LYC-B基因的表達(dá)量，LYC-B基因沉默一方面可通過(guò)抑制番茄紅素的環(huán)化來(lái)增加紫色番茄果實(shí)中番茄紅素的含量，提高番茄果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)；另一方面可通過(guò)增加以類胡蘿卜素為前體的揮發(fā)性物質(zhì)6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇和反-檸檬醛的釋放為番茄果實(shí)提供獨(dú)特的香氣成分，通過(guò)增加反-2-辛烯醛、己醇等番茄紅素相關(guān)物質(zhì)以及反-2-庚烯醛、水楊酸甲酯、順-3-己烯醇等番茄主要揮發(fā)性物質(zhì)的含量影響番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。但LYC-B基因如何對(duì)這些揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，以及這些揮發(fā)性物質(zhì)如何相互作用于風(fēng)味品質(zhì)目前尚不得而知，需要進(jìn)一步地探討和驗(yàn)證?？傊?，LYC-B基因既影響番茄果實(shí)的類胡蘿卜素代謝，又影響揮發(fā)性物質(zhì)的形成，類胡蘿卜素代謝與揮發(fā)性物質(zhì)形成密切相關(guān)。

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Effect of LYC-B Gene Silencing on Major Pigments and Volatile Compounds in Purple Tomato Fruits

L. Jie， LIANG Yan*， ZHAO Jingjing， ZHANG Yan， CHANG Peipei， QIN Lei， LI Yunzhou
（College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling712100， China）

In the current study， the expression of lycopene beta-cyclase （LYC-B） gene was inhibited during ripening through virus-induced silencing （VIGS） technique and the corresponding impact on major pigments and volatile compounds in purple tomato fruits was analyzed. The results showed that LYC-B gene silencing could increase the content of lycopene in purple tomato fruits. Tomato volatile compounds detected by headspace solid phase micro-extraction （HS-SPME） coupled with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） revealed that LYC-B gene silencing could increase the content of 6-methyl-5-hepten-2-one， which is derived from carotenoids. The release of （E）-2-octenal， hexanol， （E）-2-heptenal， methyl salicylate and （Z）-3-hexen-1-ol was also increased. In addition， LYC-B gene silencing could increase the contents of lycopene and some major volatile compounds， thus improving the nutritional and flavor quality of tomato fruits.

tomato； LYC-B gene silencing； lycopene； volatile compounds

S641.2

A

1002-6630（2015）23-0221-07

10.7506/spkx1002-6630-201523041

2015-01-31

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2011KTCL02-03）；西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)科技推廣基金項(xiàng)目（TGZX2012-02）

呂潔（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉压麑?shí)品質(zhì)性狀。E-mail：lvjielj@163.com

梁燕（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榉堰z傳育種與蔬菜種質(zhì)資源。E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn