王　梓，惠伯棣*，宮　平

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京　100191）

培養(yǎng)基初始pH值和照射光波長對杜氏藻中類胡蘿卜素含量的影響

王梓，惠伯棣*，宮平

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京100191）

研究杜氏藻在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程中初始pH值和照射光波長對其體內(nèi)類胡蘿卜素（β-胡蘿卜素和葉黃素）積累的影響。在實(shí)驗(yàn)中，配制不同初始pH值的培養(yǎng)基，用其培養(yǎng)105 d，測定培養(yǎng)液中藻細(xì)胞數(shù)和β-胡蘿卜素及葉黃素的含量。用pH 7的培養(yǎng)基，在白光（全波）、紅光（630 nm）和藍(lán)光（430 nm）照射下培養(yǎng)藻40 d，測定培養(yǎng)液中藻細(xì)胞數(shù)和β-胡蘿卜素、葉黃素的含量。結(jié)果表明：1）杜氏藻本身具有調(diào)節(jié)環(huán)境pH值向中性發(fā)生變化的能力。培養(yǎng)105 d后，不同初始pH值范圍的培養(yǎng)液（pH 10～13、pH 1～3和pH 4～9）中藻養(yǎng)殖密度依次增加。初始pH 4時(shí)，培養(yǎng)液中藻細(xì)胞數(shù)量可達(dá)1 851 個(gè)/mL，達(dá)到最大值；初始pH值范圍為7～9時(shí)，培養(yǎng)液中β-胡蘿卜素（0.489～0.561 μg/mL）和葉黃素（0.610～0.700 μg/mL）積累量較高；初始pH值范圍為11～13時(shí)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素（0.603～0.730 ng）和葉黃素（0.897～0.979 ng）積累量較高。2）杜氏藻養(yǎng)殖密度在全波光、紅光（630 nm）和藍(lán)光（430 nm）條件下均可增加。紅光和藍(lán)光均可誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞中β-胡蘿卜素和葉黃素積累量增加，藍(lán)光效果最佳，單個(gè)細(xì)胞中葉黃素含量達(dá)到0.524 ng，β-胡蘿卜素含量達(dá)到0.589 ng。

杜氏藻；類胡蘿卜素；葉黃素；β-胡蘿卜素

綠藻門，杜氏藻屬（Dunaliella）中的嗜鹽單細(xì)胞藻類可以生長在高鹽度的海水、鹽田和內(nèi)陸鹽湖之中。該屬根據(jù)其形態(tài)和生理特征可鑒定出至少23 個(gè)種［1-2］，但根據(jù)對其18S rRNA基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、DNA序列比較以及限制性片段的研究結(jié)果，這個(gè)屬中能鑒定出的藻種數(shù)量要少于23 個(gè)［3］。Dunaliella salina是其中的一個(gè)種，稱為杜氏藻，又名鹽藻。

為了適應(yīng)高鹽環(huán)境，Dunaliella salina體內(nèi)能夠積累一定濃度的次生代謝產(chǎn)物：類胡蘿卜素（carotenoid）和甘油。在其體內(nèi)積累的類胡蘿卜素中，β-胡蘿卜素和葉黃素所占數(shù)量最多。二者的分子結(jié)構(gòu)見圖1。β-胡蘿卜素的半系統(tǒng)名稱為β，β-胡蘿卜素（β，β-carotene），習(xí)慣名稱為β-胡蘿卜素（β-carotene）。由于其在人體的小腸中可被水解成視黃醇（retinol），β-胡蘿卜素又被認(rèn)為是VA源。加之其整體分子優(yōu)秀的抗氧化能力，β-胡蘿卜素已被認(rèn)為是我國消費(fèi)者日常膳食中重要的營養(yǎng)素和健康功能因子。鑒于杜氏藻體內(nèi)積累有豐富的β-胡蘿卜素，其已被用于制備天然β-胡蘿卜素。到目前為止，我國是世界上杜氏藻源β-胡蘿卜素的最大消費(fèi)國，并已在內(nèi)蒙和甘肅建成兩個(gè)杜氏藻養(yǎng)殖生產(chǎn)基地。但其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場的需求。在今后相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)，發(fā)展我國的杜氏藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)都具有很強(qiáng)的迫切性。因此，研究影響其生長的環(huán)境因素、優(yōu)化養(yǎng)殖技術(shù)、提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量具有很現(xiàn)實(shí)的意義。

圖1　1　β，β-胡蘿卜素（a）和葉黃素（b）的分子結(jié)構(gòu)Fig.1　Molecular structures of β，β-carotene （a） and lutein （b）

杜氏藻個(gè)體的生長經(jīng)歷了比較復(fù)雜的生命周期，可進(jìn)行營養(yǎng)和有性生殖［4-6］。關(guān)于杜氏藻生長條件的研究分為露天養(yǎng)殖和室內(nèi)養(yǎng)殖。國外研究表明：在露天養(yǎng)殖條件下，杜氏藻生長的最優(yōu)生長鹽質(zhì)量濃度為100～150 g/L，甚至可達(dá)到190 g/L［7-8］；天然生長的杜氏藻可在135 g/L的質(zhì)量濃度下生長［9］，密度可達(dá)4×104個(gè)/mL［10］，藻的群落結(jié)構(gòu)變化與鹽度、光強(qiáng)度、水溫以及pH值的變化相關(guān)。在人工培養(yǎng)條件下，杜氏藻可在60～230 g/L的NaCl溶液中和pH 6～9的范圍內(nèi)生長，鈣、鎂離子在高質(zhì)量濃度下亦可抑制其生長；在質(zhì)量濃度20～80 g/L的NaCl溶液中杜氏藻生長較快［11］，當(dāng)鹽質(zhì)量濃度高于150 g/L后，生長緩慢［8］。同時(shí)，杜氏藻人工培養(yǎng)的最佳鹽質(zhì)量濃度可能隨種、亞種而變化，有些為60 g/L，有些為120 g/L左右［6］。這說明可生長杜氏藻的露天鹽田和鹽湖的實(shí)際鹽質(zhì)量濃度總是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)室條件下杜氏藻的最佳生長鹽質(zhì)量濃度。這反映了一個(gè)事實(shí)：杜氏藻選擇的生長環(huán)境不一定是最佳生長環(huán)境。但在這個(gè)環(huán)境中，杜氏藻可能最具生存競爭能力。相對而言，國內(nèi)研究更多集中于室內(nèi)養(yǎng)殖，研究內(nèi)容除了在碳源、氮源、維生素和金屬離子等營養(yǎng)物質(zhì)量上進(jìn)行調(diào)整之外，還進(jìn)行了鹽度、光照、溫度、pH值等方面進(jìn)行的探索。焉翠蔚等［12］研究了不同質(zhì)量濃度NaCl對杜氏藻生長的影響，結(jié)論是杜氏藻生長的最適鹽質(zhì)量濃度為140 g/L。韋芳三等［13］的研究表明：在鹽質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)，杜氏藻體內(nèi)能夠積累最高的脂肪量。王富平等［14］的研究表明：較低質(zhì)量濃度鹽有利于杜氏藻細(xì)胞的生長，而較高質(zhì)量濃度鹽有利于積累較高的類胡蘿卜素。秦彩云等［15］的研究表明：杜氏藻在白、紅、黃、藍(lán)光下均能生長，并在10 d時(shí)達(dá)到最大養(yǎng)殖密度，且紅光條件下的細(xì)胞密度最大。鄭亞君等［16］研究不同溫度對鹽生杜氏藻生長及脂肪酸組成的影響，隨著培養(yǎng)溫度的升高和光照強(qiáng)度的增加，藻株內(nèi)飽和脂肪酸所占百分比例增加，多不飽和脂肪酸所占百分比例減小。pH值變化研究方面，除用緩沖鹽控制培養(yǎng)環(huán)境pH值外［17］，還有人嘗試通過充入CO2氣體的方式控制培養(yǎng)體系的pH值［18］。這些方面的研究主要集中在物理?xiàng)l件對細(xì)胞生長方面的影響上，與體內(nèi)類胡蘿卜素的積累的相關(guān)性不足。

本研究探索培養(yǎng)液pH值和不同照射光波長對實(shí)驗(yàn)室條件下養(yǎng)殖杜氏藻中類胡蘿卜素積累量的影響，為提高杜氏藻養(yǎng)殖中β-胡蘿卜素的含量摸索出可行的方法與技術(shù)。

1　材料與方法

1.1藻種與試劑

杜氏藻藻種購自上海光語生物科技有限公司。根據(jù)其形態(tài)學(xué)和生理特征，經(jīng)18S rRNA基因分析，鑒定為Dunaliella salina。

Na2SiO3·9H2O、乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA）、FeCl3、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2MoO4·2H2O、MnCl2·4H2O、CuSO4、NaNO3、甲醇、HCl、NaOH均為分析純試劑北京化學(xué)試劑公司；VB1、VB12、生物素為藥品級（純度≥97%）市售；海水鹽Formular Distributor公司；乙腈、乙酸乙酯均為色譜純重慶迪馬工業(yè)有限責(zé)任公司；β-胡蘿卜素及參比樣品（C/N：22040-1G-F；紫外檢測純度≥97%）美國Sigma公司；葉黃素（高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測純度≥99%）浙江新昌制藥廠。

1.2儀器與設(shè)備

HPLC（由PU-2080和UV-2075組成）儀、白色（全波，25 W）、藍(lán)色（430 nm，25 W）、紅色（630 nm，25 W）水草燈日本Jasco公司；DiamonsilTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）迪馬公司；ST-80C型照度計(jì)北京師范大學(xué)光電儀器廠；DM500型顯微鏡德國Leica公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)液母液配制

用蒸餾水配制母液A（NaNO3：75 g/L）、B（NaH2PO4· 2H2O：5 g/L）、C（Na2SiO3·9H2O：20 g/L）、D（Na2EDTA：4.36 g/L）、E（FeCl3·6H2O：3.16 g/L）、F（CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O分別為：0.01、0.023、0.012、0.18、0.07 g/L）和G（VB1、VB12、生物素分別為：0.01、0.05×10-3、0.05×10-3g/L）備用。根據(jù)如前所述文獻(xiàn)報(bào)道［8-10，12］，在本研究中配制人工海水的海鹽質(zhì)量濃度為160 g/L。將配制的人工海水和A、B、C、D、E、F液在121 ℃條件下滅菌20 min。用5 mL的一次性針頭吸取G母液，過0.22 μm濾膜，收集濾液。

1.3.2杜氏藻的培養(yǎng)及密度測定

在pH值實(shí)驗(yàn)中，采用血球板計(jì)數(shù)法測定藻種每毫升培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞數(shù)量（即藻養(yǎng)殖密度，單位：個(gè)/mL）。依次加0.2 mL的A、B、C、D、E、F、G母液于0.2 L的人工海水中，配成工作液。取3 mL工作液于10 mL試管中，用HCl和NaOH分別調(diào)每個(gè)試管中工作液的pH值，第1管調(diào)為pH 1，至第13管調(diào)為pH 13，合計(jì)13 管，為第1組。共做4 組，合計(jì)52 管。每管按V（藻種液）∶V（工作液）=1∶1接種。培養(yǎng)條件：溫度為23 ℃；白光水草燈照射；光照時(shí)間為每日14 h；光照度：4 000 lx。每天定時(shí)振搖試管2～3 次，使藻種保持良好懸浮狀態(tài)并與空氣充分接觸。分別于15、45、75、105 d計(jì)數(shù)1、2、3、4組中每管中的藻養(yǎng)殖密度。測定培養(yǎng)105 d藻液的pH值和培養(yǎng)液中β-胡蘿卜素和葉黃素的含量。

在不同照射光波長實(shí)驗(yàn)中，采用血球板計(jì)數(shù)法測定藻種每毫升培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞數(shù)量（即藻養(yǎng)殖密度）。依次加0.5 mL的A、B、C、D、E、F、G母液于0.5 L的人工海水中，配成工作液。取50 mL工作液于250 mL錐形瓶中，合計(jì)6 瓶，分3 組，每組2 瓶，分別用紅光、藍(lán)光、白光光源照射培養(yǎng)。每瓶按V（藻種液）∶V（工作液）=1∶1接種。培養(yǎng)條件：溫度為23 ℃；光照時(shí)間為每日14 h；光照度：4 000 lx。每天定時(shí)搖瓶2～3 次，使藻種保持良好懸浮狀態(tài)并與空氣充分接觸。分別于20、40 d計(jì)數(shù)每瓶中的藻養(yǎng)殖密度。測定40 d培養(yǎng)液中β-胡蘿卜素和葉黃素的含量。

1.3.3培養(yǎng)液中類胡蘿卜素的萃取

取3 mL培養(yǎng)液于10 mL離心管中，2 000 r/min離心3 min，棄去上清。向管中沉淀加入1 mL甲醇，超聲30 s，渦旋振蕩30 s，2 000 r/min離心1 min，收集甲醇萃取液，向黃色沉淀中加入1 mL乙酸乙酯，超聲30 s，渦旋振蕩30 s，2 000 r/min離心1 min，沉淀為白色，收集萃取液，與甲醇萃取液合并，濾液用甲醇定容至5 mL，過0.45 μm濾膜，供C18-HPLC分析。

1.3.4類胡蘿卜素組分的C18-HPLC檢測

HPLC條件：色譜柱為C18DiamonsilTM（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-水（9∶1，V/V），流動(dòng)相B為乙酸乙酯，流速為1 mL/min；檢測波長為450 nm；進(jìn)樣量為20 μL；梯度：在20 min內(nèi)，流動(dòng)相B由0%上升至100%（線性）。根據(jù)與β-胡蘿卜素和葉黃素參比樣品的保留時(shí)間和光譜特征的比較，對樣品中β-胡蘿卜素和葉黃素組分定性。用葉黃素和β-胡蘿卜素參比樣品分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每根曲線由6 個(gè)點(diǎn)組成（包括原點(diǎn)），R2＞0.992 0。外標(biāo)法定量樣品中β-胡蘿卜素和葉黃素組分。

1.3.5藻細(xì)胞中類胡蘿卜素含量的計(jì)算

藻細(xì)胞中各類胡蘿卜素組分（β-胡蘿卜素和葉黃素）的含量計(jì)算見下式。

式中：x為每個(gè)藻細(xì)胞中類胡蘿卜素組分的含量/（ng/個(gè)）；a為培養(yǎng)液類胡蘿卜素組分含量/（μg/mL）；b為每毫升培養(yǎng)液中藻細(xì)胞數(shù)量，即藻養(yǎng)殖密度/（個(gè)/mL）。

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，取平行數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果。藻計(jì)數(shù)和類胡蘿卜素含量分析數(shù)據(jù)的相對誤差均小于7%。

2　結(jié)果與分析

2.1 杜氏藻中類胡蘿卜素的C18-HPLC分離

圖2　杜氏藻萃取物的CC1188-HHPPLLCC圖Fig.2　C18-HPLC chromatogram of extracts from Dunaliella salina

圖2是一個(gè)典型的光合生物體脂溶性萃取物的C18-HPLC圖。主要脂溶性色素包括：葉綠素c、葉綠素d、葉黃素、β-胡蘿卜素等［19］。通過與β-胡蘿卜素和葉黃素參比樣品的保留時(shí)間和光譜特征比較，鑒定色譜圖上峰I和Ⅱ分別為葉黃素和β-胡蘿卜素。其中，β-胡蘿卜素作為葉黃素合成的前體而存在［20］。

2.2杜氏藻對環(huán)境pH值的調(diào)節(jié)能力

圖3　培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液pH值的變化Fig.3　Variation in medium pH during culture

由圖3可知，盡管培養(yǎng)液的初始pH值不同（從1～13），經(jīng)過105 d的藻培養(yǎng)，所有培養(yǎng)液的pH值均發(fā)生變化，趨向中性。初始pH值為1和2的培養(yǎng)液變成2；初始pH值為3和4的培養(yǎng)液變?yōu)?；初始pH值為5和6的培養(yǎng)液變?yōu)?；初始pH值為7～9的培養(yǎng)液最終變?yōu)?；初始pH值為10～13的培養(yǎng)液最終變?yōu)?。這是一個(gè)可能引起興趣的現(xiàn)象，合理的解釋是：杜氏藻作為一種生物，可以自身合成一些物質(zhì)，并釋放到體外，調(diào)節(jié)環(huán)境的pH值，使環(huán)境發(fā)生有利于自己生存的變化。這一現(xiàn)象也可以解釋為酸性和堿性環(huán)境對于杜氏藻來說屬于逆境。這些逆境條件可以刺激杜氏藻體內(nèi)的次生代謝系統(tǒng)合成某些次生代謝產(chǎn)物，用以調(diào)節(jié)環(huán)境pH值，使之向?qū)ψ陨砩嬗欣姆较蜃兓．?dāng)然，這些解釋需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

目前，我國的主要杜氏藻養(yǎng)殖基地均位于內(nèi)陸鹽湖上。這些湖泊的pH值均偏堿性。在本研究中觀察到的現(xiàn)象提示：在這些鹽湖中大量生長的杜氏藻可能對湖水的pH值有一定的調(diào)節(jié)作用。這一作用需要引起應(yīng)有的關(guān)注，并做進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

2.3培養(yǎng)基初始pH值對藻養(yǎng)殖密度的影響

圖4　培養(yǎng)基初始pH值對藻養(yǎng)殖密度的影響Fig.4　Effect of initial medium pH on Dunaliella salina culture density

圖4為不同初始pH值的培養(yǎng)基對藻養(yǎng)殖密度的影響。從三者的比較可以看出：杜氏藻在初始中性（pH 4～9）條件下培養(yǎng)時(shí)，其養(yǎng)殖密度的增加是最大的。相對比較起來，其養(yǎng)殖密度在初始酸性（pH 1～3）條件下的增長幅度較其在初始堿性（pH 10～13）條件下的增長幅度要大。當(dāng)初始pH值為2和10時(shí)，杜氏藻的養(yǎng)殖密度增幅極小，基本上處于生長停滯的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：初始pH值為2和10的環(huán)境可抑制杜氏藻的生長。其代謝方面的特點(diǎn)有待于進(jìn)一步探索。當(dāng)初始pH值為4時(shí)，杜氏藻培養(yǎng)液中的養(yǎng)殖密度達(dá)到1 851 個(gè)/mL，增幅最大，超過了其在初始pH值為7時(shí)的增幅。這也是一個(gè)值得深入研究的現(xiàn)象。本研究中觀察到：當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為14時(shí)，在顯微鏡下觀察，杜氏藻細(xì)胞全部死亡，這一現(xiàn)象表明：杜氏藻存活的pH值上限為13。

如前所述，在我國，無論是在沿海的鹽田，還是在內(nèi)陸的鹽湖環(huán)境中，高鹽堿性的條件比較常見，高鹽酸性條件少見。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如果在杜氏藻的養(yǎng)殖生產(chǎn)中調(diào)整接種時(shí)的初始pH值為4，可以獲得較大的藻養(yǎng)殖密度。這一結(jié)論有待于大規(guī)模養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

圖5　培養(yǎng)105 d后的藻養(yǎng)殖密度Fig.5　Dunaliella salina culture density after 105-day culture

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為4～9時(shí)，經(jīng)過105 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)液中藻的養(yǎng)殖密度較高，其中初始pH 4時(shí)，培養(yǎng)液中藻的養(yǎng)殖密度最高；當(dāng)初始pH值為1和3時(shí)，培養(yǎng)液中藻的養(yǎng)殖密度其次；初始pH值為2和10時(shí)，藻生長極緩慢，養(yǎng)殖密度基本沒有增加；當(dāng)初始pH值為11～13時(shí)，培養(yǎng)液中藻的養(yǎng)殖密度較低。

2.4不同初始pH值培養(yǎng)105 d后培養(yǎng)液中的類胡蘿卜素含量

圖6　不同初始pH值培養(yǎng)105 d后培養(yǎng)液中的類胡蘿卜素含量Fig.6　Carotenoid content in culture liquid after 105 days of culture

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7～9時(shí)，經(jīng)過105 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)液中β-胡蘿卜素和葉黃素的含量較高，β-胡蘿卜素含量達(dá)到0.489～0.561 μg/mL，葉黃素含量達(dá)到0.610～0.700 μg/mL。其中，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7時(shí)，培養(yǎng)液中的葉黃素和β-胡蘿卜素的含量最高，這很可能是由于在此條件下藻養(yǎng)殖密度較高造成的。與之相比，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為4時(shí)，培養(yǎng)液中藻養(yǎng)殖密度最大，但葉黃素和β-胡蘿卜素含量并不高。這一現(xiàn)象表明，培養(yǎng)基初始pH值為4時(shí)，杜氏藻細(xì)胞中類胡蘿卜素的合成水平較低。

2.5不同初始pH值培養(yǎng)105 d后藻細(xì)胞中的類胡蘿卜素含量

由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為11～13時(shí)，經(jīng)過105 d的培養(yǎng)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，β-胡蘿卜素含量達(dá)到0.603～0.730 ng，葉黃素含量達(dá)到0.897～0.979 ng。這說明初始培養(yǎng)條件為強(qiáng)堿性時(shí)，杜氏藻體內(nèi)的類胡蘿卜素合成可達(dá)到較高水平。

這一觀察結(jié)果可為生產(chǎn)實(shí)踐提供有價(jià)值的改進(jìn)思路。例如：培養(yǎng)基初始pH值為4時(shí)，培養(yǎng)液中的藻養(yǎng)殖密度可達(dá)到最高。培養(yǎng)基初始pH值為11～13時(shí)，杜氏藻養(yǎng)殖體內(nèi)類胡蘿卜素合成水平可達(dá)到最大水平。

圖7　不同初始pH值培養(yǎng)105 d后單個(gè)細(xì)胞中的類胡蘿卜素含量Fig.7　Carotenoid amount in single cells after 105-day culture

2.6不同照射光波長對藻養(yǎng)殖密度的影響

圖8　不同照射光波長對藻養(yǎng)殖密度的影響Fig.8　Effect of illumination wavelength on Dunaliella salina culture density

由圖8可知，杜氏藻養(yǎng)殖密度在430 nm（藍(lán)光）、630 nm（紅光）和全波長光（白光）的照射下均增加，且增加幅度接近，白光照射的效果略好。培養(yǎng)40 d后，白光、紅光、藍(lán)光照射的藻養(yǎng)殖密度分別為1 205、1 008、1 043 個(gè)/mL。

2.7不同光照培養(yǎng)40 d后培養(yǎng)液中類胡蘿卜素的含量

圖9　不同光照下培養(yǎng)40 d后培養(yǎng)液中的類胡蘿卜素含量Fig.9　Carotenoid contents in culture liquid after 40-day culture under illumination at different wavelengths

由圖9可知，藍(lán)光和紅光照射均可增加培養(yǎng)液中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量。其中藍(lán)光效果更顯著。

2.8不同光照培養(yǎng)40 d后杜氏藻單個(gè)細(xì)胞中類胡蘿卜素的含量

由圖10可知，與白光照射相比，藍(lán)光和紅光照射均可明顯增加杜氏藻單個(gè)細(xì)胞中的葉黃素和β-胡蘿卜素的含量。其中藍(lán)光效果更顯著，單個(gè)細(xì)胞中葉黃素含量達(dá)到0.524 ng，β-胡蘿卜素含量達(dá)到0.589 ng。培養(yǎng)40 d后培養(yǎng)液中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量增加可能是由于藻細(xì)胞中二者積累量增加所致。

圖10　不同光照下培養(yǎng)40 d后單個(gè)細(xì)胞中類胡蘿卜素的含量Fig.10　Carotenoid amount from single cells after 40-day culture at different wavelength lights

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同波長的照射光對杜氏藻的養(yǎng)殖密度影響并不大。但無論是長波長光還是短波長光（如紅光或藍(lán)光）均可增加藻細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素的積累水平，其中短波長光的效果更為明顯。在藻的養(yǎng)殖過程中調(diào)節(jié)環(huán)境pH值、進(jìn)行雙波長光照等設(shè)想可以用以增加類胡蘿卜素類物質(zhì)在藻細(xì)胞中的積累。這些設(shè)想在經(jīng)過大規(guī)模生產(chǎn)實(shí)踐的檢驗(yàn)后，對生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)具有一定的實(shí)用意義。

人們對杜氏藻感興趣主要是由于其可以自身合成并積累豐富的β-胡蘿卜素。這使得杜氏藻具有被應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)的價(jià)值。第一個(gè)使用杜氏藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素的試點(diǎn)工廠成立于1966年，由前蘇聯(lián)建設(shè)。從此圍繞這種嗜鹽微生物，一項(xiàng)成功的高科技產(chǎn)業(yè)逐步發(fā)展成型。目前，這一技術(shù)已發(fā)展成在精細(xì)條件控制下的高密度集約化養(yǎng)殖技術(shù)。同時(shí)，國內(nèi)對杜氏藻中類胡蘿卜素類物質(zhì)相關(guān)合成酶的表達(dá)研究也已展開［21］，這有助于從分子層面解釋培養(yǎng)條件對杜氏藻中類胡蘿卜素類物質(zhì)代謝的影響。

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Effects of Culture Medium pH and Illumination Wavelength on Carotenoid Content of Dunaliella salina

WANG Zi， HUI Bodi*， GONG Ping
（College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing100191， China）

This study aims to explore the effects of initial pH of culture medium and different illumination wavelengths on the contents of carotenoids including β-carotene and lutein from Dunaliella salina during culture. In experiments， media with different pH values were prepared and used to culture Dunaliella salina for 105 days. Under the illumination of white（full wavelengths）， red （630 nm） and blue light （430 nm）， medium with pH 7 was applied to culture Dunaliella salina for 40 days. Dunaliella salina culture density was then determined while β-carotene and lutein contents were assessed from culture liquid. Data obtained from the experiments suggested that： 1） Dunaliella salina was able to adjust the environmental pH to neutral. After 105-day culture， an increased Dunaliella salina culture density was observed from culture liquids with original pH 10-13， pH 1-3 and pH 4-9 while the maximum Dunaliella salina culture density was counted at pH 4 （1 851 cell counts/mL）. Higher β-carotene （0.489-0.561 μg/mL） and lutein （0.610-0.700 μg/mL） contents were observed from culture liquids with original medium pH 7-9， while higher β-carotene （0.603-0.730 ng） and lutein （0.897-0.979 ng） contents were seen from single cells with original medium pH 11-13； 2） Dunaliella salina culture density could increase under illumination at the full-range wavelength， red （630 nm） and blue light （430 nm） after 40- day culture. Both red and blue lights were able to induce increased contents of β-carotene （0.589 ng） and lutein （0.524 ng） from single cells while blue light was the most effective.

Dunaliella salina； carotenoid； lutein； β-carotene

TS202.3

A

1002-6630（2015）23-0183-06

10.7506/spkx1002-6630-201523034

2015-01-14

北京聯(lián)合大學(xué)2015年“啟明星”大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（201511417SJ061）

王梓（1993—），女，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：530767155@qq.com

惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)轭惡}卜素化學(xué)及生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn