曹培鑫，馬　濤，楊凱迪，劉延琳，2，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌　712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌　712100）

我國葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母的檢測(cè)和鑒定

曹培鑫1，馬濤1，楊凱迪1，劉延琳1，2，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌712100）

為快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母的存在情況，本研究比較了酒香酵母鑒別培養(yǎng)基（Dekkera bruxellensis differential medium，DBDM）和WLN（wallersteins laboratory nurtrient）培養(yǎng)基分離檢測(cè)布魯塞爾酒香酵母的效果，并利用特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增法對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的分離檢測(cè)效果作了進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明，上述兩種培養(yǎng)基均能對(duì)葡萄酒中的布魯塞爾酒香酵母進(jìn)行分離鑒別，而DBDM培養(yǎng)基較少出現(xiàn)假陽性菌落，具有更好的選擇性，結(jié)合特異PCR擴(kuò)增可準(zhǔn)確鑒定布魯塞爾酒香酵母。此外，利用DBDM培養(yǎng)基結(jié)合特異PCR擴(kuò)增法對(duì)國內(nèi)5 個(gè)主要葡萄酒產(chǎn)區(qū)的酒樣進(jìn)行布魯塞爾酒香酵母感染情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河北、山東和吉林的葡萄酒中存在布魯塞爾酒香酵母感染的情況，尤其是在橡木桶中陳釀的葡萄酒。因此，國內(nèi)葡萄酒行業(yè)應(yīng)對(duì)酒香酵母感染問題足夠重視。

葡萄酒；布魯塞爾酒香酵母；鑒別培養(yǎng)基；檢測(cè)鑒定

酒香酵母屬（Brettanomyces/Dekkera）于1904年被首次提出，最先是在啤酒中發(fā)現(xiàn)的，后來不斷在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)。目前公認(rèn)的分類中，酒香酵母屬有以下5 個(gè)種：Brettanomyces custersianus、Brettanomyces naardenensis、Brettanomyces nanus、Dekkera anomalus以及Dekkera bruxellensis。關(guān)于酒香酵母屬的名稱，經(jīng)常會(huì)有Brettanomyces和Dekkera兩種方法表示，最新的分類命名法對(duì)Dekkera anomalu和Dekkera b ruxellensis兩種能夠產(chǎn)生孢子的酒香酵母用Dekkera表示，其他3 種不能產(chǎn)生孢子的用Brettanomyces表示［1］。由于其分類命名的變更，很多報(bào)道中依然采用了Brettanomyces的形式。本實(shí)驗(yàn)全部采用最新的命名方式，即以Dekkera bruxellensis來表示布魯塞爾酒香酵母。

Dekkera bruxellensis是葡萄酒中最常發(fā)現(xiàn) 的酒香酵母，存在于葡萄和葡萄酒、釀酒設(shè)備以及橡木桶中。其會(huì)利用葡萄酒中固有的對(duì)羥基肉桂酸，如阿魏酸和對(duì)香豆酸等，在羥基肉桂酸脫羧酶作用下產(chǎn)生4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，進(jìn)一步在乙烯基還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚等對(duì)葡萄酒風(fēng)味影響極大的代謝產(chǎn)物［2-3］。目前在世界各地的葡萄酒產(chǎn)區(qū)中都分離檢測(cè)到Dekkera bruxellensis的存在［4-10］。酒香酵母在葡萄酒中存在時(shí)，合適的 條件下會(huì)給葡萄酒帶來煙熏、香料以及動(dòng)物香 等香氣，增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，然而如果任由其在葡萄酒中存在不加處理，其產(chǎn)生的過高濃度的4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚會(huì)帶來創(chuàng)可貼、鼠尿、馬汗等不良風(fēng)味，使葡萄酒的質(zhì)量受到影響，引起消費(fèi)者的抗拒，從而造成酒廠的經(jīng)濟(jì)損失［11-12］。酒香酵母相對(duì)于釀酒酵母對(duì)SO2以及酒精的耐受性更強(qiáng)，通常的葡萄酒處理手段很難完全將其除去，因此，對(duì)葡萄酒中酒香酵母的檢測(cè)極為重要。目前對(duì)葡萄酒中Dekkera bruxellensis的檢測(cè)，傳統(tǒng)方法是利用鑒別培養(yǎng)基分離檢測(cè)，常用的鑒別培養(yǎng)基是添加放線菌酮的WLN（wallersteins laboratory nurtrient）培養(yǎng)基［7］和DBDM（Dekkera bruxellensis differential medium）培養(yǎng)基［13］。Dekkera bruxellensis在葡萄酒中有時(shí)會(huì)呈現(xiàn)一種存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)（viable but not culturable，VBNC）［14-16］，在此狀態(tài)下其生理代謝仍會(huì)進(jìn)行，但處于一種不生長(zhǎng)繁殖的狀態(tài)，直接涂布平板其不能生長(zhǎng)，出現(xiàn)假陰性的檢測(cè)結(jié)果，因此，在涂布平板檢測(cè)時(shí)需要對(duì)酒樣進(jìn)行預(yù)處理，使其脫離VBNC狀態(tài)。形態(tài)觀察并不能夠準(zhǔn)確鑒定，需要結(jié)合其他手段進(jìn)行鑒定。因此，對(duì)酒香酵母的分子鑒定和檢測(cè)技術(shù)也有越來越多的研究，包括早期的26S rRNA基因D1～D2區(qū)測(cè)序［17］，對(duì)5.8S-ITS-18S區(qū)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析［18］，這兩種方法需要對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序或者酶切分析，操作相對(duì)復(fù)雜且用時(shí)較長(zhǎng)，而針對(duì)Dekkera bruxellensis設(shè)計(jì)的特異性PCR擴(kuò)增鑒定［4，19-20］可以較快地完成鑒定。另外還有熒光原位交技術(shù)［21］、巢式PCR［10］以及實(shí)時(shí)定量PCR［5，7，22］等技術(shù)也逐漸用于對(duì)Dekkera bruxellensis的檢測(cè)和鑒定，但對(duì)設(shè)備條件要求較高。

相比于國際葡萄酒行業(yè)對(duì)Dekkera bruxellensis在葡萄酒發(fā)酵和貯存過程中發(fā)揮的作用和可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注，國內(nèi)葡萄酒行業(yè)對(duì)其還沒有足夠的重視，對(duì)于葡萄酒中Dekkera bruxellensis快速檢測(cè)方法的開發(fā)以及其防范和治理等，都需要深入的研究。針對(duì)這一現(xiàn)狀，本研究比較WLN和DBDM培養(yǎng)基分離檢測(cè)Dekkera bruxellensis的效果，并利用特異PCR擴(kuò)增法對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的分離檢測(cè)效果作了進(jìn)一步驗(yàn)證。并選用分離鑒別Dekkera bruxellensis效果較好的DBDM培養(yǎng)基結(jié)合特異PCR擴(kuò)增法對(duì)我國不同產(chǎn)區(qū)的酒樣進(jìn)行Dekkera bruxellensis的分離檢測(cè)，調(diào)查我國葡萄酒中該酵母的感染情況。本研究為Dekkera bruxellensis的分離鑒定以及檢測(cè)提供技術(shù)支撐，并為我國葡萄酒行業(yè)酒香酵母的存在情況提供理論依據(jù)，對(duì)國內(nèi)Dekkera bruxellensis的進(jìn)一步研究將發(fā)揮重要作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1酒樣來源

從國內(nèi)主要的葡萄酒產(chǎn)區(qū)采集葡萄酒樣品，取樣為酒精發(fā)酵剛結(jié)束的發(fā)酵罐中的葡萄酒和正在儲(chǔ)酒池、儲(chǔ)酒罐以及橡木桶中陳釀的葡萄酒，陳釀的葡萄酒選擇不同年份、品種以及不同儲(chǔ)酒容器進(jìn)行取樣，盡量從容器底部取樣，每個(gè)葡萄酒樣品取樣量為500 mL，其他信息見表1。

表1　本研究所用葡萄酒樣品來源Table 1 Wine samples from different areas in China used in this study

1.1.2對(duì)照菌株

實(shí)驗(yàn)中所用菌株如表2所示，UCD系列菌株為加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校的菌株保藏中心（Culture Collection，University of California，Davis）提供的Dekkera bruxellensis標(biāo)準(zhǔn)菌株。其余為本實(shí)驗(yàn)室分離篩選鑒定并保藏的菌株。

表2　不同種屬酵母菌株Table 2 Yeast strains belonging to different genera

1.1.3培養(yǎng)基和試劑

YPD液體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

DBDM培養(yǎng)基［13］：無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）6.7 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)6%、氯霉素10 mg/L、放線菌酮10 mg/L、對(duì)香豆酸10 mg/L、溴甲酚綠22 mg/L、瓊脂20 mg/L，山梨酸調(diào)pH值至5.4，瓊脂高溫滅菌，其他過濾除菌。

WLN培養(yǎng)基［23］：葡萄糖50 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉4 g/L、KH2PO40.55 g/L、KCl 0.425 g/L、CaCl20.125 g/L、MgSO40.125 g/L、FeCl30.025 g/L、MnSO40.025 g/L、溴甲酚綠22 mg/L、瓊脂20 g/L，調(diào)pH值至6.2。另外添加50 mg/L放線菌酮。

PCR試劑：10×PCR buffer，2.5 mmol/L dNTP，25 mmol/L MgCl2，5 U/μL Taq Polymerase，均購自寶生物公司。引物濃度為10 μmol/L，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1酒樣預(yù)處理

由于SO2以及酒精的脅迫，Dekkera bruxellensis在葡萄酒中可能會(huì)以存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)存在，直接涂布不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因此先對(duì)酒樣進(jìn)行預(yù)處理，將1 mL酒樣接在5 mL YPD液體培養(yǎng)基（含10 mg/L放線菌酮，以抑制其他酵母的生長(zhǎng)）中，28 ℃條件下靜置活化24～48 h。

1.2.2兩種鑒別培養(yǎng)基比較

以河北的9 個(gè)酒樣（酒樣編號(hào)為CC1～CC9）涂布兩種鑒別培養(yǎng)基，比較其分離檢測(cè)效果。取100 μL原酒樣品和經(jīng)預(yù)處理活化后的酒樣，分別涂布WLN和DBDM培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)7～20 d，觀察菌落形成情況。

1.2.3DNA的提取

采用石英砂破壁提取法［24］。YEPD平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d；1.5 mL離心管，用滅過菌的牙簽挑取0.3 g菌體，加入3/10總體系體積的石英砂，加200 μL酵母裂解液，在勻漿機(jī)振蕩，每2 min取下?lián)u30 s，共循環(huán)4 次；65 ℃水浴10 min。之后加入等體積（200 μL）5 mol/L CH3COOK，混勻，冰浴8 min；13 300 r/min離心5 min，吸350 μL上清液至新的離心管中；加入0.1 倍體積（35 μL）3 mol/L CH3COONa，加入0.6 倍體積異丙醇（200 μL），混勻，后冰浴8 min，13 300 r/min離心5 min后收集沉淀；200 μL TE溶解，加入RNase 3 μL，65 ℃水浴10 min；加入200 μL氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），抽提一次，12 000 r/min離心10 min；小心取上清液150 μL至新的離心管中，加入0.1 倍體積（20 μL）3 mol/L CH3COONa及2.5 倍體積（375 μL）無水乙醇，混勻后13 300 r/min離心8 min，收集沉淀DNA；500 μL 70%乙醇洗滌沉淀，13 300 r/min離心8 min收集沉淀，吹干后加50 μL TE溶解，-20 ℃保藏（長(zhǎng)期保存）。

1.2.4特異引物PCR擴(kuò)增鑒定

利用Cecchini等［4］以Dekkera bruxellensis ITS1～I(xiàn)TS2區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)，DekITS（5'-GACACGTGGAATAAGCAAGG-3'）和BruxITR（5'-ATTATCCCCTCACTCCCCTC-3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為308 bp。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR buffer，1.0 μL dNTP，引物各0.5 μL，1.5 μL MgCl2，0.25 μL Taq Polymerase，1 μL DNA模板，17.95 μL ddH2O，總體積25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環(huán)36 次；70 ℃保溫10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（100 V，1 h），后置于凝膠成像儀內(nèi)拍照觀察。

1.2.526S rRNA基因D1～D2區(qū)測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)特異PCR擴(kuò)增為陽性的菌落進(jìn)一步進(jìn)行26S rRNA基因D1～D2區(qū)測(cè)序，驗(yàn)證其為Dekkera bruxellensis。使用通用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）進(jìn)行26S rRNA基因D1/D2區(qū)的擴(kuò)增［17］，PCR反應(yīng)體系：5.0 μL 10×PCR buffer，1.6 μL dNTP，引物各1 μL，3.0 μL MgCl2，0.5 μL Taq Polymerase，1 μL DNA模板，36.9 μL ddH2O，總體積50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，循環(huán)36 次；72 ℃保溫8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序分析。

1.2.6不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中酒香酵母的分離檢測(cè)

采用分離檢測(cè)效果較好的鑒別培養(yǎng)基結(jié)合特異PCR擴(kuò)增對(duì)其他地區(qū)的酒樣進(jìn)行Dekkera bruxellensis分離檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1兩種鑒別培養(yǎng)基的比較

表3　鑒別培養(yǎng)基上菌落形成情況Table 3　Colony formation on differential media

9 個(gè)酒樣活化前后分別在WLN培養(yǎng)基和DBDM培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布檢測(cè)，菌落形成情況見表3。在WLN培養(yǎng)基上，未經(jīng)活化的酒樣有6 個(gè)樣品出現(xiàn)菌落，經(jīng)YPD活化后，原本沒有菌落形成的CC6酒樣也有菌落形成，共7 個(gè)酒樣檢測(cè)到菌落形成。在WLN培養(yǎng)基上，共出現(xiàn)了4 種不同形態(tài)的菌落：ⅠW，奶油狀，白色圓形突起，開始白色，后來稍帶藍(lán)綠色；ⅡW，奶油狀，深綠色，扁平圓形菌落；ⅢW，不規(guī)則較大菌落，扁平，表面有褶皺，藍(lán)綠色；ⅣW，油狀，稍突起，黃綠色圓形菌落（圖1）。未經(jīng)活化的酒樣有5 個(gè)樣品在DBDM培養(yǎng)基上形成菌落，活化后，原本沒有菌落形成的CC6酒樣有菌落形成。DBDM培養(yǎng)基上有兩種形態(tài)的菌落，ⅠD，奶油狀，純白色圓形突起；ⅡD，奶油狀，黃綠色圓形菌落。與Dekkera bruxellensis標(biāo)準(zhǔn)菌株形態(tài)對(duì)比，初步斷定ⅠW和ⅠD菌株為Dekkera bruxellensis。

圖1　鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1　Colony types on differential media

Benito等［25］比較鑒別培養(yǎng)基不同選擇因子的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)放線菌酮是最強(qiáng)的選擇因子，但并不能完全抑制其他酵母的生長(zhǎng)，需要結(jié)合山梨酸、酒精等次級(jí)選擇因子才能更具選擇性。Morneau等［23］比較15 種不同酵母菌在WLN和DBDM培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在WLN培養(yǎng)基中放線菌酮達(dá)到100 mg/L時(shí)，除了Dekkera bruxellensis還有3 種酵母能夠生長(zhǎng)，而在DBDM培養(yǎng)基上則只有Dekkera bruxellensis能夠生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)各酒樣菌落分布如表4所示，結(jié)果與之前的這些結(jié)論基本一致。WLN培養(yǎng)基成分營養(yǎng)豐富，雖然其添加了更高質(zhì)量濃度的放線菌酮以抑制其他酵母的生長(zhǎng)，但由于選擇因素單一，部分其他酵母對(duì)放線菌酮存在抗性，出現(xiàn)多種形態(tài)的菌落，對(duì)分離檢測(cè)結(jié)果的觀察造成影響；而DBDM培養(yǎng)基除了有相對(duì)較低質(zhì)量濃度的放線菌酮作為主要選擇因子，還有山梨酸和酒精作為次級(jí)選擇因子，并且不含有葡萄糖等常規(guī)性碳源，其選擇能力較高，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)其他菌落較少。相比于WLN培養(yǎng)基，DBDM培養(yǎng)基是更為理想的分離檢測(cè)Dekkera bruxellensis的鑒別培養(yǎng)基。

表4　每個(gè)酒樣在鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Table 4 Strain types from each wine sample on differential media

2.2PCR特異性擴(kuò)增和26S rRNA基因D1～D2區(qū)測(cè)序鑒定

選擇培養(yǎng)基雖然能夠在形態(tài)上對(duì)菌落進(jìn)行初步判定，但由于培養(yǎng)條件、菌株差異等因素，會(huì)使菌落在不同培養(yǎng)時(shí)期甚至同一時(shí)期內(nèi)菌種內(nèi)不同菌株的形態(tài)表現(xiàn)不同，因此，只根據(jù)菌落形態(tài)難以準(zhǔn)確對(duì)Dekkera bruxellensis進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，需要結(jié)合其他方法進(jìn)一步鑒定。

2.2.1PCR特異性擴(kuò)增鑒定

Cecchini等［4］利用17 種酵母菌和6 種細(xì)菌驗(yàn)證了該引物的特異性，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步用對(duì)實(shí)驗(yàn)室之前研究發(fā)現(xiàn)的葡萄和葡萄酒中最為常見的8 種酵母以及3 株Dekkera bruxellensis標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證其特異性，結(jié)果如圖2所示，只有Dekkera bruxellensis的3 株菌有目的片段，其余酵母均未擴(kuò)增出條帶，結(jié)合實(shí)驗(yàn)和Cecchini等［4］報(bào)道可以確定該引物對(duì)特異性良好。

對(duì)WLN培養(yǎng)基上4 種形態(tài)的菌落和DBDM培養(yǎng)基上2 種形態(tài)的菌落進(jìn)行特異引物PCR擴(kuò)增鑒定，其結(jié)果如圖2所示，只有符合Dekkera bruxellensis形態(tài)特征的ⅠW和ⅠD型菌落擴(kuò)增出與目的片段大小相符的條帶，其他形態(tài)的菌落均未有條帶，因此可以判斷ⅠW和ⅠD形態(tài)的菌落為Dekkera bruxellensis。為進(jìn)一步驗(yàn)證，分別從CC1、CC2、CC5、CC8、CC9挑選一株該形態(tài)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，如圖3所示，均有目的擴(kuò)增片段。表明DBMD培養(yǎng)基和WLN培養(yǎng)基能夠較為準(zhǔn)確地對(duì)葡萄酒中的Dekkera bruxellensis進(jìn)行檢測(cè)；這5 個(gè)酒樣中均存在Dekkera bruxellensis。

圖2　不同酵母PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　PCR amplification of different yeast species

圖3　實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3　PCR amplification of strains isolated from wine samples

2.2.226S rRNA基因D1～D2區(qū)測(cè)序

為進(jìn)一步驗(yàn)證，分別從5 個(gè)酒樣的WLN和DBDM培養(yǎng)基上選取一株特異PCR擴(kuò)增陽性的菌株，進(jìn)行26S rRNA基因D1～D2區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)得的序列在國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表5，表明其確實(shí)為Dekkera bruxellensis。

表5　被測(cè)菌株26S rRNA基因D1～D2區(qū)與相關(guān)菌株序列相似性Table 5 The identity of 26S rRNA gene D1/D2 fragment between the sequenced strains and related strains

26S rRNA基因D1～D2區(qū)測(cè)序結(jié)果表明，鑒別培養(yǎng)基結(jié)合PCR特異性擴(kuò)增可以準(zhǔn)確地對(duì)Dekkera bruxellensis進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，可以替代操作相對(duì)復(fù)雜、用時(shí)較長(zhǎng)的26S rRNA基因D1～D2測(cè)序和5.8S-ITS-18S rRNA基因的PCR-RFLP方法。

2.3不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中酒香酵母的分離檢測(cè)

利用上述分離檢測(cè)效果較好的DBDM培養(yǎng)基，對(duì)另外4 個(gè)地區(qū)的酒樣進(jìn)行分離檢測(cè)，并對(duì)篩選得到的菌落進(jìn)一步進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增鑒定。綜合檢測(cè)結(jié)果見表6，在研究的5 個(gè)地區(qū)中，山東、河北和吉林的酒樣中存在酒香酵母，分別有6、5、3 個(gè)酒樣被感染，山東與吉林9 個(gè)酒樣的PCR特異擴(kuò)增結(jié)果見圖4。內(nèi)蒙古的35 個(gè)酒樣中均未檢測(cè)到Dekkera bruxellensis的存在，酒樣采集相對(duì)豐富，可以確認(rèn)沒有感染；而寧夏的酒樣雖然此實(shí)驗(yàn)中沒有分離到Dekkera bruxellensis，但由于樣品量少，且酒樣都是來自于較少出現(xiàn)Dekkera bruxellensis的發(fā)酵罐，難以說明其不存在感染。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存在Dekkera bruxellensis的酒樣均為陳釀期間的葡萄酒，尤其是橡木桶，這與之前報(bào)道的酒香酵母大多存在于陳釀期間結(jié)果一致，原因是酒香酵母生長(zhǎng)相對(duì)較慢，抗逆性強(qiáng)，在陳釀期間沒有其他酵母的競(jìng)爭(zhēng)以及其可以利用橡木桶的纖維二糖作為碳源，在此時(shí)期內(nèi)會(huì)慢慢繁殖［26］；部分研究人員也在葡萄和發(fā)酵結(jié)束的葡萄酒中分離到Dekkera bruxellensis［1］，但此實(shí)驗(yàn)中在剛發(fā)酵完的葡萄酒中沒有分離檢測(cè)到其存在，可能并不存在或者是由于其數(shù)量較少?zèng)]有分離到。

Table 6　Contamination of Dekkera bruxellensisnsis in wines from different areas表6　不同地區(qū)葡萄酒中Dekkera bruxellensis感染情況

圖4　山東和吉林酒樣分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4　PCR amplification of strains isolated from wine samples produced in Shandong and Jilin

3　結(jié) 論

WLN培養(yǎng)基和DBDM培養(yǎng)基均能對(duì)葡萄酒中的布魯塞爾酒香酵母進(jìn)行初步分離和鑒定，根據(jù)葡萄酒樣品在兩種培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)，可以初步判斷葡萄酒中是否存在布魯塞爾酒香酵母。與WLN培養(yǎng)基相比，DBDM培養(yǎng)基有更好的選擇性，較少出現(xiàn)假陽性菌落，分離檢測(cè)效果相對(duì)較好，結(jié)合特異引物PCR能夠準(zhǔn)確地對(duì)Dekkera bruxellensis進(jìn)行鑒定。

在調(diào)查的5 個(gè)國內(nèi)主要葡萄酒產(chǎn)區(qū)的葡萄酒樣品中，河北、山東和吉林產(chǎn)區(qū)的葡萄酒均檢測(cè)到Dekkera bruxellensis的存在，尤其是陳釀在橡木桶中的葡萄酒，調(diào)查中發(fā)現(xiàn)感染Dekkera bruxellensis的酒樣大部分為在橡木桶中陳釀的葡萄酒。國內(nèi)葡萄酒行業(yè)應(yīng)對(duì)酒香酵母感染問題足夠重視，以避免其可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)。

［1］OELOFSE A， PRETORIUS I， du TOIT M. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking： a synoptic review［J］. South African Journal for Enology and Viticulture， 2008， 19（2）： 128-144.

［2］CHATONNET P， DUBOURDIE D， BOIDRON J N， et al. The origin of ethylphenols in wines［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1992， 60（2）： 165-178.

［3］CHATONNET P， VIALA C， DUBOURDIEU D. Influence of polyphenolic components of red wines on the microbial synthesis of volatile phenols［J］. American Journal of Enology and Viticulture，1997， 48（4）： 443-448.

［4］CECCHINI F， IACUMIN L， FONTANOT M， et al. Dot blot and PCR for Brettanomyces bruxellensis detection in red wine［J］. Food Control，2013， 34（1）： 40-46.

［5］TOFALO R， SCHIRONE M， CORSETTI A， et al. Detection of Brettanomyces spp. in red wines using real-time PCR［J］. Journal of Food Science， 2012， 77（9）： M545- M549.

［6］PUIG A， BERTRAN E， FRANQUET R， et al. Brettanomyces bruxellensis prevalence in wines produced and marketed in Spain［J］. Annals of Microbiology， 2011， 61（1）： 145-151.

［7］TESSONNIERE H， VIDAL S， BARNAVON L， et al. Design and performance testing of a real-time PCR assay for sensitive and reliable direct quantification of Brettanomyces in wine［J］. International Journal of Food Microbiology， 2009， 129（3）： 237-243.

［8］AGNOLUCCI M， VIGENTINI I， CAPURSO G， et al. Genetic diversity and physiological traits of Brettanomyces bruxellensis strains isolated from Tuscan Sangiovese wines［J］. International Journal of Food Microbiology， 2009， 130（3）： 238-244.

［9］RODER C， KONIG H， FROHLICH J. Species-specific identification of Dekkera/Brettanomyces yeasts by fluorescently labeled DNA probes targeting the 26S rRNA［J］. FEMS Yeast Research， 2007， 7（6）： 1013-1026.

［10］ IBEAS J I， LOZANO I， PERDIGONES F， et al. Detection of Dekkera-Brettanomyces strains in sherry by a nested PCR method［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1996， 62（3）： 998-1003.

［11］ SU.REZ R， SU.REZ-LEPE J A， MORATA A， et al. The production of ethylphenols in wine by yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera： a review［J］. Food Chemistry， 2007， 102（1）： 10-21.

［12］ 游雪燕， 莊海寧， 馮濤. 葡萄酒中Brettanomyces酒香酵母屬不良風(fēng)味的研究進(jìn)展［J］. 中國釀造， 2012， 31（12）： 9-12.

［13］ RODRIGUES F， GONCALVES G， PEREIRA-da-SILVA SMALFEITO-FERREIRA M， et al. Development and use of a new medium to detect yeasts of the genera Dekkera/Brettanomyces［J］. Journal of Applied Microbiology， 2001， 90（4）： 588-599.

［14］ AGNOLUCCI M， REA F， SBRANA C， et al. Sulphur dioxide affects culturability and volatile phenol production by Brettanomyces/Dekkera bruxellensis［J］. International Journal of Food Microbiology， 2010，143（1/2）： 76-80.

［15］ SERPAGGI V， REMIZE F， RECORBET G， et al. Characterization of the “viable but nonculturable” （VBNC） state in the wine spoilage yeast Brettanomyces［J］. Food Microbiology， 2012， 30（2）： 438-447.

［16］ ZUEHLKE J M， EDWARDS C G. Impact of sulfur dioxide and temperature on culturability and viability of Brettanomyces bruxellensis in wine［J］. Journal of Food Protection， 2013， 76（12）：2024-2030.

［17］ KURTZMAN C P， ROBNETT C J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit （26S）ribosomal DNA partial sequences［J］. Antonie van Leeuwenhoek，1998， 73（4）： 331-371.

［18］ ESTEVE-ZARZOSO B， BELLOCH C， URUBURU F， et al. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers［J］. International Journal of Systematic Bacteriology， 1999， 49（1）： 329-337.

［19］ COCOLIN L， RANTSIOU K， IACUMIN L， et al. Molecular detection and identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（3）： 1347-1355.

［20］ CONTRERAS A， SALINAS F， GANGA A， et al. Polymerase chain reaction confirmatory method for microbiological detection of Brettanomyces bruxellensis in wines［J］. Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology， 2008， 16（4）： 308-319.

［21］ STENDER H， KURTZMAN C， HYLDIG-NIELSEN J J， et al. Identification of Dekkera bruxellensis （Brettanomyces） from wine by fluorescence in situ hybridization using peptide nucleic acid probes［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2001， 67（2）： 938-941.

［22］ ANDORRA I， ESTEVE-ZARZOSO B， GUILLAMON J M， et al. Determination of viable wine yeast using DNA binding dyes and quantitative PCR［J］. International Journal of Food Microbiology，2010， 144（2）： 257-262.

［23］ MORNEAU A D， ZUEHLKE J M， EDWARDS C G. Comparison of media formulations used to selectively cultivate Dekkera/ Brettanomyces［J］. Letters in Applied Microbiology， 2011， 53（4）： 460-465.

［24］ 周小玲， 沈微， 饒志明， 等. 一種快速提取真菌染色體 DNA 的方法［J］.微生物學(xué)通報(bào)， 2004， 31（4）： 89-92.

［25］ BENITO S， PALOMERO F， MORATA A， et al. Identifying yeats belonging to the Brettanomyces/Dekkera genera through the use of selective-differential media［J］. African Journal of Microbiology Research， 2012， 34（6）： 6348-6357.

［26］ WEDRAL D， SHEWFELT R， FRANK J. The challenge of Brettanomyces in wine［J］. LWT-Food Science and Technology， 2010，43（10）： 1474-1479.

Detection and Identification of Dekkera bruxellensis in Chinese Wines

CAO Peixin1， MA Tao1， YANG Kaidi1， LIU Yanlin1，2，*
（1. College of Enology， Northwest A&F University， Yangling712100， China；2. Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture， Yangling712100， China）

Dekkera bruxellensis is one of the major spoilage microorganisms in wines. In order to detect Dekkera bruxellensis in wines rapidly and accurately， the separation and detection efficiency of Dekkera bruxellensis using differential medium （DBDM） and Wallerstein nutrient （WLN） medium were compared. A specific polymerase chain reaction （PCR）assay was also used to further testify the results. The results showed that both DBDM and WLN could be useful to detect Dekkera bruxellensis in wines， while DBDM was more selective to identify Dekkera bruxellensis accurately when combined with the specific PCR. The application of DBDM combined with the specific PCR to investigate the infection of Dekkera bruxellensis in wines from five major producing regions in China showed that among the investigated regions， Dekkera bruxellensis spoilage was found in wines from three regions including Hebei， Shandong and Jilin， especially in the wines aged in oak barrels. Therefore， the Chinese wine industry should pay much attention to the issue of Dekkera bruxellensis spoilage.

wine； Dekkera bruxellensis； differential medium； detection and identification

TS261.1

A

1002-6630（2015）23-0172-06

10.7506/spkx1002-6630-201523032

2015-01-19

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（重點(diǎn)項(xiàng)目）（Z109021201）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-30-jg-3）

曹培鑫（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸丫莆⑸?。E-mail：736008703@qq.com

劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸丫萍搬劸莆⑸?。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn