馬沁沁，付　雨，孫　群，*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都　610064；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都　610101）

食源性乳桿菌中耐藥基因的轉(zhuǎn)移研究

馬沁沁1，2，付雨1，孫群1，*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610064；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都610101）

為評(píng)估食品中乳桿菌（Lactobacillus spp.）耐藥基因轉(zhuǎn)移所引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)耐藥乳桿菌菌株進(jìn)行了紅霉素、萬(wàn)古霉素和氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）中檢測(cè)到紅霉素耐藥基因msrC，萬(wàn)古霉素和氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因檢測(cè)結(jié)果為陰性。以供體菌和受體菌菌液體積比為10∶1，通過(guò)濾膜雜交法，進(jìn)行乳桿菌耐藥基因msrC對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的體外轉(zhuǎn)移，但僅獲得1 個(gè)接合子菌落；乳桿菌對(duì)糞腸球菌（Enterococcus faecalis）msrC基因體外轉(zhuǎn)移頻率約為2.2×10-2，與敏感菌相比，接合子生長(zhǎng)速率減緩。在無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）裸鼠腸道內(nèi)進(jìn)行的L. delbrueckii對(duì)E. faecalis的msrC基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移中未檢測(cè)到接合子。結(jié)果表明，乳桿菌攜帶的可轉(zhuǎn)移耐藥基因在腸道內(nèi)傳遞至致病菌或機(jī)會(huì)致病菌的機(jī)率很小，且接合子生長(zhǎng)比敏感菌緩慢，在抗生素選擇壓降低或消失的條件下易被淘汰。因此，目前食源性乳桿菌中耐藥基因可能引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)較小。

耐藥性；乳桿菌；基因轉(zhuǎn)移；接合子；食品安全

自抗生素臨床應(yīng)用以來(lái)，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播就成為威脅公眾健康的主要因素之一。細(xì)菌的抗生素耐藥性分為固有耐藥和獲得性耐藥。獲得性耐藥是通過(guò)細(xì)菌的突變或通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal genetransfer，HGT）獲得外源耐藥遺傳因子而產(chǎn)生，可以在細(xì)菌間傳播［1］。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）提出具有固有耐藥或由染色體突變獲得耐藥性的菌株可以用作飼料添加劑，而攜帶可轉(zhuǎn)移耐藥基因的菌株發(fā)生耐藥基因橫向轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)最大，不應(yīng)被引入食物鏈［2］。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）被廣泛用于食品生產(chǎn)，一直被認(rèn)為是對(duì)人體沒(méi)有危害的天然發(fā)酵劑和益生菌，能夠平衡腸道菌群，對(duì)人體健康有益［3］。但最近發(fā)現(xiàn)LAB攜帶多種抗生素耐藥基因，可能作為抗生素耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)［4-5］，在一定條件下通過(guò)HGT轉(zhuǎn)移至致病菌或機(jī)會(huì)致病菌。目前關(guān)于乳桿菌（Lactobacillus spp.）耐藥基因轉(zhuǎn)移的報(bào)道有限，且不同研究中，結(jié)果不盡相同。后基因組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)在人腸道的天然微生物群落和致病菌之間的基因轉(zhuǎn)移可能存在某種屏障［6］。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）攜帶的紅霉素耐藥基因ermB對(duì)糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的轉(zhuǎn)移頻率在無(wú)菌小鼠體內(nèi)比在體外提高了3～4 個(gè)數(shù)量級(jí)［7］，而羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的四環(huán)素耐藥基因tetW在人腸道內(nèi)并未與腸球菌（Enterococcus spp.）、雙歧桿菌（Bifi dobacteria spp.）、乳桿菌發(fā)生水平轉(zhuǎn)移［8］。

本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)分離自四川地區(qū)人腸道及發(fā)酵食品的52 株乳桿菌中，60%以上的菌株分別對(duì)紅霉素、萬(wàn)古霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥，且受試菌株對(duì)上述抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibition concentration，MIC）分布均呈現(xiàn)雙峰或多峰分布，因此耐藥菌株的耐藥性很可能是獲得性耐藥［3，9］。本研究擬對(duì)耐藥乳桿菌菌株是否攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行乳桿菌對(duì)腸道致病菌和機(jī)會(huì)致病菌的耐藥基因體外及體內(nèi)轉(zhuǎn)移研究，為食品中乳桿菌耐藥性可能引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院保存的分離自健康人腸道及四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離自酸奶及四川泡菜的乳桿菌菌株共52 株；對(duì)紅霉素敏感的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213及E. faecalis ATCC 29212，購(gòu)自北京中原公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）BALB/c裸鼠由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠平均年齡2 個(gè)月。

1.1.3試劑

細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒及2×Taq Plus PCR MasterMix北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒美國(guó)Axygen公司；膠回收試劑盒美國(guó)Omega公司；PCR引物英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；紅霉素美國(guó)Sigma-Aldrich公司；MRS瓊脂及MRS肉湯培養(yǎng)基廣州環(huán)凱生物制品有限公司；糞腸球菌瓊脂及甘露醇-氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；濾膜及濾頭上海新亞凈化器件廠。

1.2儀器與設(shè)備

PTC-200型PCR儀、DYY-Ⅱ恒壓恒流電泳儀、凝膠成像儀美國(guó)Bio-Rad公司；生物安全柜青島海爾集團(tuán)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1耐藥基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)

提取耐藥乳桿菌菌株基因組DNA，PCR檢測(cè)紅霉素、萬(wàn)古霉素及氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因。PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，45～62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 次循環(huán)；72 ℃ 10 min。對(duì)目的條帶用膠回收試劑盒回收，送上海美吉生物科技有限公司測(cè)序。

表1　抗生素耐藥基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers chosen for detection of antimicrobial resistance determinants

續(xù)表1

1.3.2質(zhì)粒中紅霉素耐藥基因的檢測(cè)及體外基因轉(zhuǎn)移

提取紅霉素耐藥乳桿菌菌株質(zhì)粒DNA，以此為模板，分別擴(kuò)增mefA/E基因和msrC基因。

分離自酸奶的德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）M1號(hào)菌株為供體，對(duì)紅霉素敏感的E. faecalis ATCC 29212和S. aureus ATCC 29213為受體，供體菌和受體菌菌液體積比為10∶1，以濾膜雜交法［3］進(jìn)行耐藥基因體外轉(zhuǎn)移，重復(fù)3 次。

1.3.3接合子的鑒定

挑取ATCC 29213接合子（29213C）及3 個(gè)ATCC 29212接合子（29212C）單菌落接種于含有5 μg/mL紅霉素的BHI肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48～72 h后提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測(cè)msrC基因。

1.3.4接合子MIC的測(cè)定

采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）公布的瓊脂稀釋法測(cè)定接合子的MIC值［14］。

1.3.5體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移

將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組3 只小鼠，均為雄性小鼠。

根據(jù)酸奶中乳桿菌的濃度［15］及泡菜汁中乳桿菌的濃度［16-17］，以及實(shí)驗(yàn)用裸鼠與我國(guó)18～69 歲健康漢族成年人平均體質(zhì)量比［18］，確定M1和E. faecalis ATCC 29212的灌喂量［7，19］。

向?qū)嶒?yàn)組小鼠灌喂109CFU/d ATCC 29212，喂食3 d后向?qū)嶒?yàn)組小鼠灌喂108CFU/d M1號(hào)菌株和109CFU/d ATCC 29212，喂食3 d。向?qū)φ战M小鼠灌喂109CFU/d ATCC 29212，喂食6 d。向空白組小鼠灌喂滅菌生理鹽水6 d。

取小鼠腸道剪碎，加入適量無(wú)菌生理鹽水研磨，研磨后將研磨液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，渦旋1 min。取研磨液進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組研磨液及稀釋液100 μL分別涂布于含5 μg/mL紅霉素的糞腸球菌瓊脂和MRS瓊脂，將空白組研磨液及稀釋液涂布于不含抗生素的糞腸球菌瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24～72 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1乳桿菌耐藥基因的擴(kuò)增

在受試菌株中未得到12 個(gè)已知萬(wàn)古霉素耐藥基因及10 個(gè)已知氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因陽(yáng)性片段。對(duì)紅霉素耐藥基因的擴(kuò)增中，在8 株紅霉素耐藥的L. plantarum中檢測(cè)到mefA/E基因；分別有2 株L. delbrueckii、1 株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、1 株嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）以及22 株L. plantarum攜帶msrC基因（圖1）。在紅霉素耐藥菌株的質(zhì)粒中均檢測(cè)到相應(yīng)紅霉素耐藥基因。

圖1　部分乳桿菌菌株質(zhì)粒mefAmefA/E及msrCmsrC基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR of mefA/E and msrC gene from plasmids in partial selected Lactobacillus strains

2.2M1與受體菌的耐藥基因體外轉(zhuǎn)移

經(jīng)鑒定，L. delbrueckii M1號(hào)菌株質(zhì)粒攜帶msrC基因，以M1為供體與S. aureus ATCC 29213雜交的3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，只有1 次實(shí)驗(yàn)一組平行的10-4稀釋液于48 h后有一個(gè)可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，直徑約1 mm。其余樣品及對(duì)照組均無(wú)菌落生長(zhǎng)。M1與E. faecalis ATCC 29212的接合子在72 h后出現(xiàn)可見(jiàn)菌落，平均轉(zhuǎn)移頻率為2.2×10-2。敏感受體菌ATCC 29212和ATCC 29213在培養(yǎng)18～24 h后菌落可見(jiàn)。

2.3接合子的鑒定

通過(guò)PCR檢測(cè)，接合子29212C和29213C的質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增到msrC基因，而從陰性對(duì)照ATCC 29212和ATCC 29213的質(zhì)粒DNA未擴(kuò)增到陽(yáng)性條帶（圖2），表明msrC基因通過(guò)濾膜雜交成功轉(zhuǎn)移至受體菌ATCC 29213和ATCC 29212。

圖2　接合子mmssrrCC基因的PCRR鑒定結(jié)果Fig.2　msrC gene in the exconjugants identified by PCR

2.4接合子MIC的測(cè)定結(jié)果

29212C和29213C對(duì)紅霉素的MIC值為8 μg/mL，高于非接合子的正常MIC值（ATCC 29213為0.25～1 μg/mL，ATCC 29212為1～4 μg/mL），并達(dá)到CLSI提出的折點(diǎn)（8 μg/mL），說(shuō)明ATCC 29212和ATCC 29213通過(guò)濾膜雜交，從M1獲得紅霉素耐藥基因msrC，并產(chǎn)生了對(duì)紅霉素的耐藥性。

2.5體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移

在SPF裸鼠體內(nèi)進(jìn)行的M1對(duì)E. faecalis ATCC 29212的耐藥基因轉(zhuǎn)移中，實(shí)驗(yàn)組未檢出ATCC 29212接合子。對(duì)照組及空白組均無(wú)菌落生長(zhǎng)。

3　討 論

本研究在L. plantarum、L. acidophilus和L. delbrueckii中檢測(cè)到msrC基因。Portillo［20］和Werner［21］等發(fā)現(xiàn)部分對(duì)紅霉素敏感的E. faecalis菌株也攜帶msrC基因，而Singh等［22］卻發(fā)現(xiàn)msrC基因的突變會(huì)導(dǎo)致E. faecalis菌株對(duì)紅霉素的MIC明顯降低。因此，msrC基因是否引起紅霉素耐藥，仍存爭(zhēng)議。本研究中，敏感受體菌獲得msrC基因后均產(chǎn)生了紅霉素耐藥性，表明msrC對(duì)紅霉素耐藥性確有貢獻(xiàn)。受試乳桿菌中未檢測(cè)到已知的萬(wàn)古霉素及氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因，與其他研究結(jié)果相同［9-10］，其耐藥機(jī)制需進(jìn)一步探討。

可轉(zhuǎn)移的抗生素耐藥基因大都位于質(zhì)粒和整合接合因子（integrative and conjugative elements，ICEs），而質(zhì)粒和ICEs主要通過(guò)接合的方式發(fā)生HGT［23］，因此目前耐藥基因體外轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)通常采用濾膜雜交法［3，7，24］。不同的供受體菌株的體外基因轉(zhuǎn)移情況不同，四環(huán)素耐藥基因能從屎腸球菌（Enterococcus faecium）水平轉(zhuǎn)移至乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）［25］，從乳桿菌轉(zhuǎn)移至L. lactis和E. faecalis，但從乳桿菌到S. aureus的體外轉(zhuǎn)移卻未能實(shí)現(xiàn)［24］。本研究中乳桿菌對(duì)S. aureus的紅霉素耐藥基因體外轉(zhuǎn)移獲得成功，但僅有1 個(gè)接合子生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移頻率為1.1×10-9，與乳桿菌在紅霉素選擇壓下產(chǎn)生獲得性耐藥的突變頻率（＜10-11～10-5）相當(dāng)［26］。M1與E. faecalis ATCC 29212的濾膜雜交實(shí)驗(yàn)中，平均轉(zhuǎn)移頻率為2.2×10-2。Gevers等［24］得到乳桿菌四環(huán)素耐藥基因tetM對(duì)E. faecalis的體外轉(zhuǎn)移頻率為10-4～10-6，而L. plantarum攜帶的紅霉素耐藥基因ermB對(duì)E. faecalis的體外轉(zhuǎn)移頻率為5.7×10-8［7］。供受體菌株的種類(lèi)和接合子培養(yǎng)時(shí)間可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)移頻率有影響。

值得注意的是，S. aureus接合子和E. faecalis接合子出現(xiàn)可見(jiàn)菌落的時(shí)間比敏感菌滯后約24～48 h，表明受體菌在獲得外源紅霉素耐藥基因msrC后，付出了生長(zhǎng)速率降低的適應(yīng)性代價(jià)。若其在腸道內(nèi)與敏感菌共存，當(dāng)抗生素選擇壓降低或消失時(shí)，易在與敏感菌的競(jìng)爭(zhēng)中被淘汰［27］。

已有關(guān)于乳桿菌耐藥基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的研究結(jié)果不一，且乳桿菌和受體菌的灌喂量與我國(guó)成年人日常攝食的習(xí)慣不符［7-8］。本研究根據(jù)自然條件下我國(guó)成年人每天可能攝食乳桿菌的最大量，確定供體菌M1及受體菌E. faecalis ATCC 29212對(duì)裸鼠的灌喂量比例為1∶10，未檢出接合子，而實(shí)際每日的乳桿菌攝入量還可能低于此劑量。在本研究基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的條件下，乳桿菌攜帶的可轉(zhuǎn)移紅霉素耐藥基因msrC未轉(zhuǎn)移至E. faecalis，據(jù)此可推斷我國(guó)健康成年人通過(guò)日常攝入乳桿菌而將其攜帶的紅霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移給腸道致病菌和機(jī)會(huì)致病菌的風(fēng)險(xiǎn)很低。因此，本研究結(jié)果表明按照中國(guó)人食用乳桿菌的習(xí)慣，發(fā)酵食品中添加的乳桿菌即便攜帶耐藥基因，在腸道內(nèi)水平轉(zhuǎn)移至腸道致病菌及機(jī)會(huì)致病菌的風(fēng)險(xiǎn)也很小，且獲得外源耐藥基因的菌株生長(zhǎng)能力降低，競(jìng)爭(zhēng)力減弱，易被淘汰。因此發(fā)酵食品中乳桿菌攜帶的耐藥基因可能導(dǎo)致的食品安全風(fēng)險(xiǎn)較低。

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Antimicrobial Resistant Gene Transfer of Foodborne Lactobacilli

MA Qinqin1，2，F(xiàn)U Yu1， SUN Qun1，*
（1. Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment， Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University，Chengdu610064， China； 2. College of Life Sciences， Sichuan Normal University， Chengdu610101， China）

To assess the risk of antimicrobial resistant gene transfer from foodborne Lactobacillus strains to human pathogens or opportunistic pathogens， we performed the detection of the resistant genes of erythromycin， vancomycin and fluoroquinolones in resistant Lactobacillus strains. Erythromycin resistant gene msrC was shown in the plasmids of Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus delbrueckii， while negative results were obtained for vancomycin and fluoroquinol ones. Filter mating was carried out at a donor/recipient ratio of 10：1 with Staphylococcus aureus and E. faecalis as the recipients and L. delbrueckii the donors， respectively. In L. delbrueckii and S. aureus mating pair， only one exconjugant was obtained， and the average gene transfer frequency of L. delbrueckii to E. faecalis was 2.2 × 10-2， indicating that the mobile resistant gene from lactobacilli could disseminate to pathogens. The growth rate of exconjugants was lower than the control， so exconjugants might be washed out more easily than their susceptible counterpart when antimicrobial selective pressure was absent. The transfer of msrC from L. delbrueckii to E. faecalis was not observed in gnotobiotic rats. Accordingly， lactobacilli widely used in foods now may not increase the antimicrobial resistance in pathogens， thus threatening public health severely.

antimicrobial resistance； Lactobacillus； gene transfer； exconjugant； food safety

Q939.99

A

1002-6630（2015）23-0167-05

10.7506/spkx1002-6630-201523031

2015-01-26

科技部國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)（2011DFR31220；2015DFR31060）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（14ZC1482）；四川師范大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目（10QNL02）

馬沁沁（1978—），女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。E-mail：qqma@sicnu.edu.cn

孫群（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：qunsun@scu.edu.cn