李成龍，袁　軍，劉淑貞，周才瓊*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 40071 5）

米粉及食鹽添加量對(duì)發(fā)酵酸肉蛋白質(zhì)降解及γ-氨基丁酸形成的影響

李成龍，袁軍，劉淑貞，周才瓊*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 40071 5）

以新鮮豬瘦肉為原料，研究米粉及食鹽添加量對(duì)發(fā)酵60 d成品酸肉蛋白質(zhì)降解及γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）含量的影響，并利用響應(yīng)面法對(duì)酸肉發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化以獲取高GABA含量的酸肉。結(jié)果表明：米粉和食鹽添加量可影響蛋白質(zhì)降解及GABA的形成，制備高GABA含量酸肉的最佳發(fā)酵工藝條件為米粉添加量12.73%、食鹽添加量4.74%、發(fā)酵溫度16.50 ℃。此時(shí)發(fā)酵60 d的成品酸肉中GABA含量最高為282.36 mg/100 g。

發(fā)酵酸肉；發(fā)酵條件；蛋白質(zhì)降解；響應(yīng)面法；γ-氨基丁酸

酸肉主要流行于貴州、四川、重慶、湖南等少數(shù)民族地區(qū)和漢族與少數(shù)民族雜居地區(qū)，是一種自然乳酸發(fā)酵的特色豬肉制品，至今已有兩千多年的歷史。相關(guān)研究表明［1-7］，經(jīng)腌制發(fā)酵后的酸肉由于微生物生長(zhǎng)繁殖，其蛋白質(zhì)、總糖、脂肪、多肽氮及有機(jī)酸等含量變化，氨基酸組成改變，除了形成酸肉特有的清香、酯香和醬香風(fēng)味外，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也發(fā)生了深刻變化。有報(bào)道從乳酸發(fā)酵產(chǎn)品中分離出可產(chǎn)生γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）的乳酸菌［8-10］，作為現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中重要的功能成分之一，GABA具有多種生物學(xué)功能，如抗高血壓活性、免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和抗氧化活性等［11］。考慮酸肉厭氧發(fā)酵特點(diǎn)及發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌大量生長(zhǎng)繁殖，以及GABA富集的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬研究米粉添加量和食鹽添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉成品蛋白質(zhì)降解及GABA形成的影響，為傳統(tǒng)酸肉的功能化開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。

1　材料與方法

1.1材料

新鮮豬瘦肉、大米 市售；大米粉，粳米淘洗后炒至微黃后磨成粉，過(guò)20 目篩。

1.2試劑

NaCl、無(wú)水乙醇、次氯酸鈉均為分析純 成都市科龍化工試劑廠；K2SO4、CuSO4、苯酚、硼酸等均為分析純 重慶川東化工有限公司；GABA標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。

1.3儀器與設(shè)備

722型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Avant J-3DI型離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；101-1A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KjelFlex-360全自動(dòng)凱氏定氮儀 北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司沈陽(yáng)分公司。

1.4方法

1.4.1酸肉腌制工藝流程

原料肉→清洗→切成厚度約4 mm片狀→加調(diào)味料（鹽、米粉等）→揉制裝壇→一定溫度下密封發(fā)酵60 d→成品

1.4.2不同食鹽添加量對(duì)發(fā)酵60 d成品酸肉的影響

以米粉添加量12%、食鹽添加量分別為1%、2%、3%、4.5%、6%和8%的條件下進(jìn)行揉制裝壇，置于15 ℃條件下密封發(fā)酵60 d。

1.4.3不同米粉添加量對(duì)發(fā)酵60 d成品酸肉的影響

以食鹽添加量4.5%，米粉添加量分別為2%、4%、8%、12%、16%和20%的條件下進(jìn)行揉制裝壇，置于15 ℃條件下密封發(fā)酵60 d。

1.4.4響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)1.4.2、1.4.3節(jié)試驗(yàn)結(jié)果選出食鹽添加量和米粉添加量，并參考文獻(xiàn)［12］選擇發(fā)酵溫度作為主要影響因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)［13］。

1.4.5分析方法

1.4.5.1測(cè)試樣品前處理

取發(fā)酵60 d的酸肉，刷掉表面黏附的米粉、剔除可見(jiàn)的脂肪和筋膜。

1.4.5.2粗蛋白和游離氨基酸含量測(cè)定

粗蛋白含量：按照GB/T 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；游離氨基酸含量：采用GB/T 8314—2002《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》中的茚三酮比色法測(cè)定。

1.4.5.3肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、非蛋白氮和多肽氮

采用張亞軍等［14］的方法：微量凱氏定氮法。

1.4.5.4GABA含量的測(cè)定［15］

精確稱(chēng)取5.000 0 g切碎樣品，磨細(xì)勻漿，置于150 mL圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液20 mL，然后置于88 ℃水浴回流萃取2 h后過(guò)濾，濾渣用10 mL 60%乙醇溶液分2 次洗滌，然后將3 次濾液合并于離心管中，3 000 r/min離心20 min，將離心管中上清液轉(zhuǎn)入小燒杯內(nèi)，置沸水浴蒸干，用8 mL蒸餾水充分溶解蒸干后的殘?jiān)⑥D(zhuǎn)入離心管，3 000 r/min離心20 min，取上清液備用。吸取處理后的樣液0.5 mL于試管中，加入濃度為0.2 mol/L的硼酸緩沖液1.0 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚1.0 mL，混勻后加入0.6 mL次氯酸鈉溶液（有效氯≥5.1%），振蕩。于沸水浴中加熱10 min置于冰浴中20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)色后，加入2.0 mL 60%的乙醇，于吸收波長(zhǎng)645 nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)GABA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到GABA的回歸方程Y=1.999 6X+0.063 7（R2=0.994 4），從而計(jì)算得到GABA含量。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Design Expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用Excel軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1不同食鹽添加量和米粉添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉GABA含量的影響

2.1.1不同食鹽添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉GABA含量的影響

圖1　不同食鹽添加量處理對(duì)發(fā)酵酸肉GABA含量的影響Fig.1　Impact of salt concentration on GABA amount in fermented pork

豬瘦肉按照1.4.2節(jié)的方法分別添加12%的米粉和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的食鹽后在15 ℃條件下密封發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵60 d成品酸肉GABA含量，結(jié)果如圖1。GABA含量隨食鹽添加量的增加呈先增后降趨勢(shì)，在277.84～282.30 mg/100 g之間，食鹽添加量為4.5%時(shí)GABA含量最高，顯著高于其他各處理組（P＜0.05）。這可能與微生物的生長(zhǎng)繁殖和蛋白質(zhì)的降解有關(guān)，GABA是由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生的，在食鹽添加量低時(shí)，食鹽添加量的增加，破壞原料肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白酶更易作用于蛋白，加快蛋白質(zhì)的降解，游離氨基酸增加，但食鹽添加量過(guò)高則抑制了蛋白分解酶和微生物的活性，影響乳酸菌谷氨酸脫羧酶的產(chǎn)生。

2.1.2不同米粉添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉GABA含量的影響

豬瘦肉按照1.4.3節(jié)的方法分別添加4.5%的食鹽和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的米粉后在15 ℃條件下密封發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵60 d成品酸肉中GABA含量，結(jié)果如圖2。GABA含量隨米粉添加量的增加呈先增后降趨勢(shì)，在277.50～282.30 mg/100 g之間，米粉添加量為12%時(shí)酸肉GABA含量最高，顯著高于米粉添加量分別為2%、4%、8%的處理（P＜0.05），與米粉添加量為16%時(shí)酸肉中GABA含量之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）?？赡芪⑸飳?duì)于作為碳源的米粉存在飽和現(xiàn)象，外源米粉的添加量超過(guò)一定比例時(shí)，發(fā)酵酸肉原料中蛋白質(zhì)含量下降較多，導(dǎo)致產(chǎn)品中GABA含量開(kāi)始下降。

圖2　不同米粉添加量處理對(duì)發(fā)酵酸肉GABA含量的影響Fig.2　Impact of rice flour amount on GABA amount in fermented pork

2.2不同食鹽添加量和米粉添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉蛋白質(zhì)降解的影響

2.2.1不同食鹽添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉蛋白質(zhì)及降解的影響

豬瘦肉按照1.4.2節(jié)的方法分別添加12%的米粉和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的食鹽后在15 ℃條件下密封發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵60 d成品酸肉蛋白質(zhì)及降解產(chǎn)物含量變化，結(jié)果見(jiàn)表1，酸肉各蛋白含量均有所下降，而蛋白降解產(chǎn)物則有升高趨勢(shì)，在食鹽添加量4.5%時(shí)蛋白質(zhì)含量降到最低。各蛋白和蛋白降解產(chǎn)物變化與GABA含量變化顯著相關(guān)（P＜0.05），其中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量最高分別下降了2.07 g/100 g和2.28 g/100 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了0.61、0.41 g/100 g和0.41 g/100 g?？紤]發(fā)酵中酸肉含水量的變化，以100 g干基計(jì)，則肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量最高分別下降了5.28 g和5.54 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了0.94、0.79 g和0.90 g。

表1　不同食鹽添加量對(duì)發(fā)酵酸肉蛋白質(zhì)降解的影響Table1　Impact of salt concentration on protein degradation in fermented pork g/100 g

2.2.2不同米粉添加量對(duì)發(fā)酵60 d酸肉蛋白質(zhì)降解的影響

豬瘦肉按1.4.3節(jié)方法分別添加4.5%的食鹽和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的米粉后在15 ℃條件下密封發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵60 d成品酸肉中蛋白質(zhì)及降解產(chǎn)物。結(jié)果見(jiàn)表2，酸肉各蛋白質(zhì)含量均有所下降，而蛋白降解產(chǎn)物則有升高趨勢(shì)，在米粉添加量12%時(shí)蛋白質(zhì)降解達(dá)到最大。各蛋白和蛋白降解產(chǎn)物變化與GABA含量變化顯著相關(guān)（P＜0.05），其中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白含量最高分別下降了3.06 g和3.08 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了0.97、0.40 g和0.51 g。考慮到發(fā)酵中酸肉含水量的差異，以100 g干基計(jì)，則肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量最高分別下降了9.10 g和10.39 g，非蛋白氮、多肽氮和游離氨基酸最高分別增加了1.38、0.63 g和0.89 g。酸肉發(fā)酵中蛋白質(zhì)的降低主要來(lái)自肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解，多肽氮、非蛋白氮和游離氨基酸的增加對(duì)發(fā)酵酸肉形成特有的風(fēng)味或特定功能成分如GABA有利。

表2　不同米粉添加量處理對(duì)發(fā)酵酸肉蛋白質(zhì)降解的影響Table2　Impact of rice flour content on protein degradation in fermented pork g/100 g

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化對(duì)發(fā)酵酸肉GABA富集的影響

以上述單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇米粉添加量、食鹽添加量、發(fā)酵溫度進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以發(fā)酵60 d成品酸肉中GABA含量為指標(biāo)，通過(guò)Design Expert7.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)發(fā)酵條件對(duì)GABA含量的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，回歸分析見(jiàn)表4。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table3　Response surface experimental design and results

經(jīng)分析得到發(fā)酵條件與GABA含量之間的二次多項(xiàng)式模型為：Y=282.37+0.30A+0.26B+0.33C-0.088AB+ 0.21AC+0.14BC-1.03A2-1.13B2-1.21C2。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4。該模型P=0.000 1＜0.01，說(shuō)明方差模型差異顯著；模型失擬項(xiàng)P=0.064 3＞0.05，即模型失擬項(xiàng)差異不顯著，模型選擇合適［16-17］。模型決定系數(shù)R2=0.972 3，即由3 個(gè)影響因素引起GABA含量的變異為97.23%，說(shuō)明此模型相關(guān)性良好，可用此方程對(duì)不同發(fā)酵條件下酸肉中GABA含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表4可知，因素A、B、C對(duì)酸肉中GABA含量影響顯著（P＜0.05），AB、AC、BC對(duì)酸肉中GABA含量影響不顯著（P＞0.05），A2、B2、C2對(duì)酸肉中GABA含量的影響極顯著（P＜0.01）。

表4　以GABA含量為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table4　Analysis of variance of regression model with GABA amount as response value

當(dāng)發(fā)酵溫度為15 ℃時(shí)，米粉添加量和食鹽添加量交互作用對(duì)GABA含量的影響如圖3。從響應(yīng)面曲線可知，米粉添加量和食鹽添加量對(duì)酸肉GABA含量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨米粉添加量和食鹽添加量增加，GABA含量呈先增后減趨勢(shì)，在米粉添加量12%左右，食鹽添加量4.5%左右時(shí)，GABA含量達(dá)最大值。

圖3　米粉添加量和食鹽添加量交互作用對(duì)GABA含量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3　Response surface and contour plots for the effect of rice flour and salt content on GABA amount

當(dāng)食鹽添加量為4.5%時(shí)，米粉添加量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)GABA含量的影響如圖4。米粉添加量和發(fā)酵溫度對(duì)酸肉中GABA含量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨米粉添加量的增加和發(fā)酵溫度升高，GABA含量呈先增后減的趨勢(shì)，米粉添加量在12%左右，發(fā)酵溫度15 ℃左右時(shí)，GABA含量達(dá)最大值。

圖4　米粉添加量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)GABA含量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4　Response surface and contour plots for the effect of rice flour amount and fermentation temperature on GABA amount

當(dāng)米粉添加量為12%時(shí)，食鹽添加量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)GABA含量的影響如圖5。食鹽添加量和發(fā)酵溫度對(duì)酸肉中GABA含量影響的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨食鹽添加量和發(fā)酵溫度升高，GABA含量呈先增后減趨勢(shì)，食鹽添加量在4.5%左右，發(fā)酵溫度15 ℃左右時(shí)，GABA含量達(dá)最大值。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert軟件獲得了發(fā)酵60 d成品酸肉GABA含量最高時(shí)各因素最佳條件為：米粉添加量12.73%、食鹽添加量4.74%、發(fā)酵溫度16.50 ℃。在此條件下，GABA含量預(yù)測(cè)值282.44 mg/100 g。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，在此工藝條件下測(cè)定發(fā)酵60 d酸肉GABA含量為282.36 mg/100 g，與預(yù)測(cè)值接近。表明優(yōu)化得到的富集工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，模型合適有效，有實(shí)踐參考價(jià)值。

圖5　食鹽添加量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)GABA含量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5　Response surface and contour plots for the effect of salt amount and fermentation temperature on GABA amount

3　討論與結(jié)論

渝黔地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉為自然乳酸發(fā)酵食品，有大量微生物特別是乳酸菌的生長(zhǎng)，乳酸菌優(yōu)勢(shì)菌群主要是片球菌屬（Pediococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）［5］。相關(guān)研究顯示乳酸菌、酵母菌和微球菌等可分泌胞外酶［18-19］，微生物胞外蛋白酶可降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生活性肽類(lèi)及游離氨基酸［20］，在蛋白質(zhì)降解中也可形成一定的揮發(fā)性鹽基氮，已有報(bào)道顯示發(fā)酵60 d的酸肉瘦肉的揮發(fā)性鹽基氮為19.56 mg/100 g［6］，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的二級(jí)鮮度15～25 mg/100 g。酸肉發(fā)酵中米粉添加量、食鹽添加量及發(fā)酵溫度都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的降解和GABA的形成。米粉為乳酸菌等微生物的生長(zhǎng)及分解活動(dòng)提供碳源，隨碳源增加，微生物活動(dòng)增加，微生物胞外蛋白酶導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、非蛋白氮增加和GABA形成；當(dāng)碳源飽和時(shí)其影響變小。食鹽添加量變化會(huì)影響乳酸菌生長(zhǎng)，從而影響谷氨酸轉(zhuǎn)化成GABA。

GABA是由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用下產(chǎn)生，谷氨酸由蛋白質(zhì)和多肽降解而來(lái)，酸肉中乳酸菌生長(zhǎng)產(chǎn)生胞外酶如谷氨酸脫羧酶可作用于谷氨酸產(chǎn)生GABA，推測(cè)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)食鹽可破壞原料肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使蛋白酶更易作用于蛋白，利于谷氨酸產(chǎn)生，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)食鹽對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有一定抑制，影響乳酸菌胞外酶的生產(chǎn)。食鹽不僅對(duì)谷氨酸脫羧酶有弱抑制作用，還能增加谷氨酸脫羧酶的膠體體系穩(wěn)定性，二者共同作用降低谷氨酸脫羧酶活性，不利于GABA積累［21］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明米粉添加量、食鹽添加量和發(fā)酵溫度均對(duì)發(fā)酵60 d酸肉中GABA含量有顯著影響（P＜0.05），酸肉發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為米粉添加量12.73%、食鹽添加量4.74%、發(fā)酵溫度16.50 ℃時(shí)，發(fā)酵60 d的成品酸肉中GABA含量最高。

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Impact of Amounts of Rice Flour and Salt Added to Fermented Pork on Protein Degradation and γ-Amino Butyric Acid （GABA） Formation

LI Chenglong， YUAN Jun， LIU Shuzhen， ZHOU Caiqiong*
（Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Center， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400715， China）

The fermentation process of fresh lean pork with added rice fl our and salt to produce sour pork was optimized for higher content of γ-amino butyric acid （GABA） by response surface methodology. The effect of different amounts of rice fl our and salt on protein degradation and GABA content after 60 days of fermentation was assessed. Results indicated that the amounts of rice fl our amount and salt could affect the formation of GABA and protein degradation. The optimum fermentation conditions for sour pork were addition of 12.73% of rice fl our and 4.74% of salt and fermentation at 16.50 ℃. Under these optimized conditions， the maximum content of GABA was 282.36 mg/100 g.

fermented pork； fermentation conditions； protein degradation； response surface methodology； γ-amino butyric acid （GABA）

TS251.1

A

1002-6630（2015）13-0202-05

10.7506/spkx1002-6630-201513037

2014-09-01

李成龍（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：654196032@qq.com

周才瓊（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)化學(xué)。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn