郭利娜，朱　玉，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

枯草芽孢桿菌發(fā)酵小米糠對(duì)其抗氧化肽含量與抗氧化活性的影響

郭利娜，朱玉，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為提高小米糠的附加值，本實(shí)驗(yàn)以多個(gè)枯草芽孢桿菌為起始菌株，透明圈直徑與菌 落直徑之比（H C值）為初篩指標(biāo)，通 過(guò)酪蛋白平板培養(yǎng)法進(jìn)行高產(chǎn) 蛋白酶菌株的初步篩 選。將初篩所獲得菌株在小米糠 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)其發(fā)酵上清液的總蛋白酶活力、多肽含量及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步篩選出最適菌株。用此菌株對(duì)小米糠進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)其最適發(fā)酵時(shí)間及上清液的抗 氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：NattoD-3為最佳發(fā)酵菌株，其產(chǎn)蛋白酶活力為90.22 IU/mL，發(fā)酵小米糠72 h時(shí)所獲得發(fā)酵上清液4 種體外抗氧化活性相對(duì)最高，分別為T(mén)-AOC值38.04 U/mL、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率75.37%、總還原力0.18及Fe2+螯合能力44.34%，最終發(fā)酵上清液的多肽含量為4.28 mg/mL，纖溶酶活力為522.64 IU/mL。

枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；小米糠；抗氧化肽

谷子是中國(guó)傳統(tǒng)的谷物，每年產(chǎn)量約450 萬(wàn)t。小米糠占谷子總量的6%～8%，每年將產(chǎn)生小米谷糠40 萬(wàn)t左右，是一種產(chǎn)量較大的可再生利用資源［1-2］。研究顯示，小米糠蛋白含量和消化率均高于小米蛋白。小米糠蛋白中的8 種必需氨基酸的氨基酸評(píng)分和化學(xué)評(píng)分（分值都大于1，達(dá)到全價(jià)蛋白 的標(biāo)準(zhǔn)，且小米糠中的氨基酸組成更接近聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）聯(lián)合食品標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃推薦的標(biāo)準(zhǔn)模式，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值堪比牛奶和雞蛋［3］。

利用微生物對(duì)食物蛋白進(jìn)行發(fā)酵水解提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，一直是食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。許多微生物具有酶的抗氧化機(jī)制，發(fā)酵后可將蛋白水解成多肽或氨基酸，可提高其生物活性及其抗氧化特性［4-5］。Chung等［6］報(bào)道，經(jīng)Bacillus subtilis IMR-NK1發(fā)酵過(guò)的紅豆制品呈現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。Zhu Yunping等［7］使用 Bacillus subtilis B2發(fā)酵豆腐渣蛋白，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中的多肽含量有了很大的提高，并且發(fā)酵產(chǎn)物的自由基清除活力和抗氧化活性比原來(lái)的豆腐渣蛋白有了顯著的提高。祁紅兵等［8］利用微生物對(duì)米糠進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其上清液的抗氧化能力有顯著提高。Amadou等［9］利用乳酸菌發(fā)酵小米，并對(duì)其發(fā)酵物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為600 D左右的多肽的抗氧化能力較好?？莶菅挎邨U菌是一種產(chǎn)蛋白酶、α-淀粉酶活力較高的菌種，如果能用于小米糠發(fā)酵，將有利于小米糠資源的可再生利用，同時(shí)提高其附加價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以多個(gè)枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，以透明圈直徑與菌落直徑之比（HC值）為指標(biāo)，初步篩選出產(chǎn)蛋白酶活力高的菌株。然后以多肽含量、蛋白酶活力及總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）為復(fù)篩指標(biāo)，對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩，從而獲得對(duì)小米糠發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力、多肽含量及T-AOC較高的菌株。國(guó)內(nèi)外至今尚未有關(guān)于使用Bacillus subtilis對(duì)小米糠進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵并研究其多肽和抗氧化活性變化的報(bào)道。本研究是目前深度開(kāi)發(fā)利用小米糠蛋白的一個(gè)新的發(fā)展方向，對(duì)于提高小米糠的利用價(jià)值具有一定的理論指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料、菌株與培養(yǎng)基

小米糠 山西沁水縣，蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、水分、灰分、纖維素、多酚、植酸含量分別為10.02%、6.15%、10.02%、9.11%、6.71%、54.16%、0.89%、2.04%。

27 株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂18.0 g/L、pH 7.0。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15 g/L。酪蛋白平板：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2，脫脂奶粉1.5%?；A(chǔ)培養(yǎng)基：脫脂小米糠6 g、葡萄糖0.1 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水100 mL置于250 mL的三角瓶，自然pH值，115 ℃條件下滅菌20 min。

Gly-Gly-Tyr-Arg、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲洛嗪 美國(guó)Sigma公司；T-AOC 南京建成科技有限公司；培養(yǎng)基成分均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

AY120電子天平、UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本Shimadzu公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；Anke DL-5-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HYG-G型三層搖床 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3方法

1.3.1菌株發(fā)酵培養(yǎng)

將安瓿管中的菌種接入裝有100 mL NA培養(yǎng)基的三角瓶中，棉塞封口，置于空氣搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，使菌種轉(zhuǎn)接活化。

1.3.2菌種初篩

分批取活化好的菌株進(jìn)行酪蛋白平板涂布，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。通過(guò)測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算HC值（透明圈直徑與菌落直徑之比）。選出HC值較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。接種至斜面培養(yǎng)基上保存，數(shù)據(jù)測(cè)3 次取平均值。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)

將初篩得到的菌種在NA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，然后接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于空氣搖床中，在180 r/min、30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，進(jìn)行液體發(fā)酵，結(jié)束后取發(fā)酵液進(jìn)行處理分析。

1.3.4發(fā)酵上清液制備

發(fā)酵培養(yǎng)到48 h后，將各菌株發(fā)酵液在100 ℃條件下滅菌10 min，于4 000 r/min離心20 min，取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾過(guò)液即為發(fā)酵上清液。

1.3.5發(fā)酵液蛋白酶活力測(cè)定

不同菌株接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，離心取上清液。上清液中酶活力的測(cè)定以2%酪蛋白為底物，采用Folin-酚法進(jìn)行測(cè)定［10］。酶活力單位定義為40 ℃條件下，pH值為7.5，以每分鐘1 mL酶溶液水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位（IU）。

酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL，各加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL，F(xiàn)olin-酚試劑使用液1.00 mL，然后置于（40±2） ℃水浴中顯色20 min，取出，用分光光度計(jì)于680 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度（A）值。以吸光度A680nm為縱坐標(biāo)，酪氨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 8x（R2=0.999 1）。

1.3.6小米糠發(fā)酵上清液中多肽含量的測(cè)定

取發(fā)酵上清液3 mL，加入3 mL 10 g/100 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置30 min，5 000 r/min離心20 min，取1 mL上述溶液置于試管中，加入雙縮脲試劑4 mL，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置30 min，取上清液于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A540nm值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得出樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度，計(jì)算出發(fā)酵上清液中的多肽含量［11］。

多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取不同體積的Gly-Gly-Tyr-Arg標(biāo)準(zhǔn)溶液其單位為mg/mL，按照上述方法測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.045 9x+0.008 0（R2 = 0.999 9）。

1.3.7總抗氧化活力測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)［12］采用總抗氧化活性試劑盒對(duì)小米糠發(fā)酵上清液的總抗氧化活力進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3 次?？寡趸镔|(zhì)能將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+能使菲啉類(lèi)物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，在520 nm波長(zhǎng)處通過(guò)比色測(cè)出其抗氧化能力的高低?？偪寡趸盍Χx為在37 ℃條件下，每分鐘每毫升抗氧化物質(zhì)使反應(yīng)體系的A520nm值每增加0.01，為一個(gè)總抗氧化活力單位（U）。

式中：X為總抗氧化活力/（U/mL）；A1為測(cè)定樣的A520nm值；A0為對(duì)照樣的A520nm值；V為反應(yīng)液總體積/mL；V0為取樣量/mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.8DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Saiga等［13］的方法。樣品組是小米糠發(fā)酵上清液用蒸餾水稀釋6 倍后，與等體積的0.2 mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解）混合；對(duì)照組是稀釋6 倍后的發(fā)酵液與95%乙醇等體積混合；空白組是95%乙醇與等體積的0.2 mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解）混合。各組混合物搖勻，在遮光和室溫條件下反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處定A517nm值。小米糠發(fā)酵上清液對(duì)DPPH自由基清除能力計(jì)算公式如下。

式中：X為小米糠發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除率/%；As是稀釋后發(fā)酵液的A517nm值；Ac是對(duì)照組的A517nm值；Ab是空白組的A517nm值。

1.3.9Fe2+螯合能力測(cè)定

［14］方法并進(jìn)行一定的改進(jìn)。3 mL發(fā)酵上清液和50 μL 2 mmol/L FeCl2溶液混合，加入750 μL的蒸餾水，再加入200 μL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液。充分混合后，在室溫下反應(yīng)10 min，之后在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A562nm值?？瞻捉M是以3 mL蒸餾水代替發(fā)酵上清液與上述反應(yīng)液混合，以蒸餾水調(diào)零。發(fā)酵上清液Fe2+螯合能力的計(jì)算公式如下。

式中：X為發(fā)酵上清液的Fe2+螯合能力/%；A0為空白組A562nm值；A1為發(fā)酵上清液A562nm值。

1.3.10發(fā)酵上清液總還原能力的測(cè)定

參照Kaur等［15］的方法。將2 mL的發(fā)酵上清液和5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）混合，然后加入5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合物在50 ℃保溫20 min。加入5 mL 10 g/100 mL TCA溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液和1 mL蒸餾水混合，再加入0.5 mL 0.1 g/100 mL FeCl3溶液，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A700nm值，吸光度越高說(shuō)明樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.11纖溶酶活力測(cè)定

利用所篩選菌株對(duì)小米糠進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵后，5 000 r/min離心25 min，取上清液，測(cè)定纖溶酶酶活力。纖溶酶的活力測(cè)定采用瓊脂糖-纖維平板法［16］。將10 μL樣品液點(diǎn)樣在瓊脂糖纖維平板表面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中保溫18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定溶解圈的直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小米糠發(fā)酵上清液中纖溶酶的活力。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株初篩

圖1　不同菌株產(chǎn)蛋白水解透明圈HC值Fig.1　HC values of protein hydrolysis transparent circles produced with different strains

由于枯草芽孢桿菌能夠分泌蛋白酶，在酪蛋白平板上可產(chǎn)生透明的蛋白水解圈，可通過(guò)HC值初步確定菌株產(chǎn)蛋白酶活力的強(qiáng)弱，從而獲得目的菌株。根據(jù)圖1中各菌株之間HC值的差異顯著性分析，選取HC值較大的10 種菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，分別為NattoD-3、fmbj-6、BSns、BSnd-2、NattoD-2、BSnj-1、BSnjp-1、BSnw-1、BSnm-2和BSns-3，其水解圈HC值達(dá)到4.3左右。

2.2菌株復(fù)篩

2.2.1不同菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的發(fā)酵酶活力

圖2　不同菌株發(fā)酵上清液中蛋白酶活力Fig.2　Protease activity of fermentation supernatant with different strains

枯草芽孢桿菌具有產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力［17］，而蛋白酶可以水解蛋白產(chǎn)生具有活性的短肽物質(zhì)或游離氨基酸。因此，蛋白酶活力可作為復(fù)篩的一種指標(biāo)。由圖2可知，NattoD-3在以上發(fā)酵菌種中產(chǎn)蛋白酶活力最高，與其他菌株相比差異顯著（P＜0.05），酶活力達(dá)到90.22 IU/mL。納豆芽孢桿菌本身可產(chǎn)納豆激酶，是蛋白酶一種，這可能是此菌株蛋白酶活高的主要原因［18］。

2.2.2不同菌株發(fā)酵產(chǎn)T-AOC能力及多肽含量比較

圖3　不同菌株發(fā)酵上清液中的T-AOC值和多肽含量Fig.3　T-AOC values and polypeptide contents of fermentation products with different strains

由圖3可知，NattoD-3菌株發(fā)酵上清液的T-AOC值及多肽含量顯著高于其他9 株菌株的及無(wú)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（P＜0.05），其中NattoD-3發(fā)酵上清液的T-AOC值為36.13 U/mL，多肽含量為3.50 mg/mL。說(shuō)明利用NattoD-3發(fā)酵的方式來(lái)提高小米谷糠中的總抗氧化活力及多肽是有意義的。所以選用此菌株進(jìn)行下一步研究。

圖4　T-AOC值與多肽含量擬合圖（a）和蛋白酶活力與T-AOC值擬合圖（b）bFig.4　Fitting curves of T-AOC value against polypeptide content （a） and protease activity against T-AOC value （b）

2.2.3NattoD-3發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力、T-AOC及多肽含量之間的關(guān)系在復(fù)篩的過(guò)程中，測(cè)定發(fā)酵上清液中的蛋白酶活力、多肽含量以及T-AOC值，通過(guò)線性擬合分析3 個(gè)指數(shù)之間的關(guān)系。由圖4可知，多肽含量與T-AOC成顯著線性相關(guān)（R2=0.964），相關(guān)系數(shù)為0.982，成正相關(guān)（P＜0.05）；蛋白酶活力與T-AOC也成顯著線性相關(guān)（R2=0.989），相關(guān)系數(shù)為0.995，成正相關(guān)（P＜0.05）。綜合分析說(shuō)明，蛋白酶活力、多肽含量和T-AOC之間密切相關(guān)。

2.3NattoD-3發(fā)酵小米糠產(chǎn)上清液4 種體外抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)及發(fā)酵時(shí)間的確定

2.3.1不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵上清液T-AOC能力及多肽含量的變化

圖5　不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵上清液T-AOC值及多肽含量Fig.5　T-AOC values and polypeptide contents of fermentation supernatants with different fermentation time

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽含量和總還原能力不斷增高，在72 h達(dá)到最大值，與其他發(fā)酵時(shí)間下上清液的多肽含量和T-AOC相比，差異顯著（P＜0.05），其值分別是4.28 mg/mL和38.04 U/mL，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株分泌蛋白酶的量不斷增加，使大的蛋白質(zhì)水解成有活性的多肽物，但在72 h后一些有活性的多肽繼續(xù)被酶水解成游離氨基酸［19］，使多肽含量下降，同時(shí)T-AOC值也呈下降趨勢(shì)。

2.3.2不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵上清液DPPH自由基清除能力的變化

圖6　不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵上清液DPPH自由基的清除能力Fig.6　DPPH radical scavenging capacity of fermentation supernatants at different fermentation times

由圖6可知，發(fā)酵上清液對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，小米糠發(fā)酵上清液對(duì)DPPH自由基的清除能力為75.37%，達(dá)到最高值，之后開(kāi)始下降。DPPH自由基的清除能力降低的原因可能是多肽類(lèi)物質(zhì)包含電子供體和能使自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)終止的氨基酸如Cys、Met、Trp、Tyr和Phe暴露于反應(yīng)環(huán)境中。如含有含硫氨基酸（Cys和Met）殘基的多肽具有親核作用；側(cè)鏈基團(tuán)有Trp、Tyr和Phe的多肽具有供氫能力［20］。發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使有活性的多肽物質(zhì)被水解，所以發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者過(guò)短都會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)物的供氫和供電子能力，影響發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除效果，進(jìn)而使發(fā)酵上清液的抗氧化活性呈現(xiàn)較低狀態(tài)［21］。

2.3.3不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵上清液總還原能力的變化

圖7　不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵上清液總還原力Fig.7　Reducing power of fermentation supernatants at different fermentation times

研究發(fā)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的抗氧化性能與它們的還原能力有著直接的關(guān)系。還原力的分析通常被用來(lái)評(píng)價(jià)天然抗氧化物提供氫原子或者提供電子的能力［22］。如圖7所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵上清液的總還原力先上升后下降，且在72 h后達(dá)到最高（0.18），說(shuō)明發(fā)酵上清液是一種較好的電子供體，通過(guò)自身的氧化使氧化物質(zhì)得到還原，且與DPPH自由基的清除能力趨勢(shì)相符。

2.3.4不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵上清液Fe2+的螯合能力變化

圖8　不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵上清液Fe22++的螯合力Fig.8　Fe2+chelating capacity of fermentation supernatanta at different fermentation times

由圖8可知，在0～120 h范圍內(nèi)，發(fā)酵上清液對(duì)Fe2+的螯合能力隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，72 h達(dá)到最高（44.34%），之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)?？赡苡捎陔S著發(fā)酵時(shí)間的增加，一些大的蛋白被酶水解，使一些酸性和堿性氨基酸暴露，其在側(cè)鏈部位的羧基與氨基能與Fe2+螯合。Saiga等［13］報(bào)道酸性和堿性氨基酸對(duì)Fe2+和Cu2+的螯合能力有重要作用。酸性氨基酸（Glu和Asp）和堿性氨基酸（Lys和Arg）大量暴露于環(huán)境中對(duì)Fe2+的螯合能力增加有重要作用。Chen等［23］在研究中分離到含組氨酸殘基的抗氧化活性肽，并指出其抗氧化活性與肽鏈中組氨酸殘基中的咪唑基螯合金屬離子的能力有關(guān)。

2.3.5篩選到的納豆芽孢桿菌的纖溶酶活力

納豆芽孢桿菌是可食用菌，此菌種在發(fā)酵過(guò)程中高產(chǎn)纖溶酶，有溶血栓等作用［24］。由于篩選到的高產(chǎn)蛋白酶菌株是一種納豆菌NattoD-3，應(yīng)具有產(chǎn)纖溶酶活性。因此，本研究中對(duì)所篩選菌株發(fā)酵小米糠上清液中的纖溶酶活力進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h，此時(shí)發(fā)酵上清液中的纖溶酶活力為522.64 IU/mL，與李妍等［24］報(bào)道的利用納豆芽孢桿菌產(chǎn)纖溶酶的酶活力（511 IU/mL）相當(dāng)。

3　結(jié) 論

以多個(gè)枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，酪蛋白平板蛋白酶圈（HC值）為初篩指標(biāo)，篩選出10 種具有較高產(chǎn)蛋白酶活力的菌株；以T-AOC、蛋白酶活力及多肽含量為復(fù)篩指標(biāo)，在小米糠基礎(chǔ)培養(yǎng)基上篩選出一種高產(chǎn)蛋白酶活力的菌株NattoD-3；利用NattoD-3對(duì)小米糠基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)其發(fā)酵上清液的4 種體外抗氧化能力隨發(fā)酵時(shí)間的變化進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h，此時(shí)小米糠發(fā)酵上清液的T-AOC值、DPPH自由基清除率、總還原力和Fe2+螯合能力分別為38.04 U/mL、75.37%、0.18和44.34%，多肽含量為4.28 mg/mL。纖溶酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液中具有較高的纖溶酶活力（522.64 IU/mL）。此研究結(jié)果表明，利用本實(shí)驗(yàn)中所篩選的菌株對(duì)小米糠進(jìn)行發(fā)酵，不僅可獲得具有抗氧化活性的多肽，還可以獲得具有溶血栓作用的纖溶酶，這對(duì)于提高小米糠的附加值具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

［1］ DEVITTORI C， GUMY D， KUSY A， et al. Supercritical fluid extraction of oil from millet bran［J］. Journal of the American Oil Chemists' Society， 2000， 77（6）： 573-579.

［2］ 恩和， 龐之洪， 熊本海. 粟谷糠類(lèi)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較分析［J］.中國(guó)飼料， 2008， 18（2）： 39-41.

［3］ 許潔. 小米糠谷糠蛋白的提取及其保健功能的研究［D］. 太原： 山西大學(xué)， 2012.

［4］ MARCZAK E D， USUI H， FUJITA H， et al. New antihypertensive peptides isolated from rapeseed［J］. Peptides， 2003， 24（6）： 791-798.

［5］ CUMBY N， ZHONG Ying， NACZK M， et al. Anti-oxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates［J］. Food Chemistry， 2008， 109（1）： 144-148.

［6］ CHUNG Y C， CHANG C T， CHAO W W， et al. Antioxidativeactivity and safety of the 50 ethanolic extract from red bean fermented by Bacillus subtilis IMR-NK1［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2002， 50（8）： 2454-2458.

［7］ ZHU Yunping， FAN Junfeng， CHENG Yongqiang， et al. Improvement of the antioxidant activity of Chinese traditional fermented okara（Meitauza） using Bacillus subtilis B2［J］. Food Control， 2008， 19（7）：654-661.

［8］ 祁紅兵， 陳均， 何佳， 等. 納豆芽孢桿菌發(fā)酵米糠上清液的抗氧化功能研究［J］. 食品科學(xué)， 2008， 29（3）： 293-297.

［9］ AMADOU I， LE Guowei， AMZA T， et al. Purification and characterization of foxtail millet-derived peptides with antioxidant and antimicrobial activities［J］. Food R esearch International， 2013， 51（1）：422-428.

［10］ QB/T 1803—1993 工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法［S］.

［11］ 魯偉， 任國(guó)譜， 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的測(cè)定方法［J］. 食品科學(xué)， 2005， 26（7）： 169-171.

［12］ NIU Liya， JIANG Shaotong， PAN Lijun. Preparation and evaluation of antioxidant activities of peptides obtained from defatted wheat germ by fermentation［J］. Journal of Food Science and Technology， 2013，50（1）： 53-61.

［13］ SAIGA A， TANABE S， NISHIMURA T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003，51（12）： 3661-3667.

［14］ DINIS T C， MADEIRA V M， ALMERIDA L M. Action of phenolic derivatives （acetoaminophen， salycilate and 5-aminosalycilate） as inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavenges［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1994， 315（1）：161-169.

［15］ KAUR R， ARORA S， SINGH B. Antioxidant activity of the phenol rich fractions of leaves of Chukrasia tabularis A. Juss［J］. Bioresource Technology， 2008， 99（16）： 7692-7698.

［16］ 呂鳳霞， 陸兆新， 別小妹， 等. Bacillus subtilis C-DES36纖溶酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究［J］. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2005， 21（12）： 175-178.

［17］ WONNOP V， SOOTTAWAT B， WANCHERN P， et al. Accelerated proteolysis of soy proteins during fermentation of Thua-nao inoculated with Bacillus subtilis［J］. Journal of Food Biochemistry，2005， 29： 349-366.

［18］ 潘進(jìn)權(quán). 納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶工藝優(yōu)化［J］. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011， 26（9）： 33-37.

［19］ 余勃， 陸兆新. 發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆多肽的研究［J］. 食品科學(xué)， 2007，28（2）： 189-192.

［20］ ZHU Lijuan， CHEN Jie， TANG Xueyan， et al. Reducing， radical scavenging， and chelation properties of in vitro digests of alcalasetreated zein hydrolysate［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（8）： 2714-2721.

［21］ 何榮海， 劉磊， 蔣邊， 等. 枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕制備抗氧化肽［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2013， 13（12）： 12-19.

［22］ THANA P， MACHMUDAH S， GOTO M， et al. Response surface methodology to supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis［J］. Bioresource Technology， 2008，99（8）： 3110-3115.

［23］ CHEN H M， MURAMOTO K， YAMAUCHI F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean beta-conglycinin［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1995， 43（3）： 574-578.

［24］ 李妍， 吳慶紅， 陳義倫， 等. 一株納豆芽孢桿菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)， 2013， 34（3）： 179-183.

Effect of Fermentation by Bacillus subtilis on Antioxidant Peptide Content and Antioxidant Activity of Millet Bran

GUO Lina， ZHU Yu， DIAO Mingming， LU Zhaoxin， L? Fengxia， ZHAO Haizhen*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

In order to fi nd the most suitable strain for the production of antioxidant peptides and plasmin from millet bran，initial screening of 27 Bacillus subtilis stains for the ratio of transparent circle diameter to bacterial colony diameter （HC value） was performed on casein agar plates and further screening of the selected strains based on total proteinase activity，peptide conten t and total antioxidant capacity （T-AOC） of fermentation supernatants was conducted using the basal medium containing millet bran. This study also investigated the optimal fermentation time for antioxidant activities of fermentation supernatants using the selected optimal strain. Results showed that NattoD-3 was found to be the optimal strain for the fermentation of millet bran， yielding a protease activity of 90.22 IU/mL. The optimal fermentation time was 72 h， and the resulting T-AOC， DPPH radical scavenging activity， reducing power and Fe2+chelating ability of millet bran fermentation supernatant were 38.04 U/mL， 75.37%， 0.18 and 44.34%， respectively. The peptide content in the fermentation supernatant reached 4.28 mg/mL with plasmin activity of 522.64 IU/mL.

Bacillus subtilis； fermentation； millet bran； antioxidant peptide

TS209

A

1002-6630（2015）13-0196-06

10.7506/spkx1002-6630-201513036

2014-08-08

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目（kyz201118）

郭利娜（1990—），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：2012108005@njau.edu.cn

趙海珍（1975—），女，副教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn