訾　艷，王常青*，陳曉萌，陳　彤，李小凡，郝志萍，于文娟

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

具有α-淀粉酶抑制活性的白蕓豆多肽的制備及其熱穩(wěn)定性研究

訾艷，王常青*，陳曉萌，陳彤，李小凡，郝志萍，于文娟

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

以白蕓豆為原料，酶法制備多肽。以α-淀粉酶抑制率為指標，比較酸性、中性和堿性蛋白酶的酶解效果。結果表明：3.350酸性蛋白酶的酶解效果最好。通過加酶量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間的單因素試驗和正交試驗，得到制備白蕓豆多肽的最佳工藝條件為：加酶量3 200 U/g、酶解pH 2.2、酶解溫度55 ℃、酶解時間60 min，此條件下白蕓豆多肽α-淀粉酶抑制率為80.82%。熱穩(wěn)定性研究表明，白蕓豆多肽的熱穩(wěn)定性高于α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor，α-AI）粗提液，該多肽在85、90 ℃條件下的α-淀粉酶抑制活性能保持更長時間。凝膠電泳分析表明白蕓豆多肽的分子質量為7.53～9.09 ku。

白蕓豆清蛋白；α-淀粉酶抑制劑；多肽；α-淀粉酶抑制活性；熱穩(wěn)定性

白蕓豆（white kidney bean），生物學名菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.），別名四季豆、白腰豆等，在我國云南、貴州、四川等省份種植面積較大。白蕓豆中蛋白質含量19.9%～20.0%，脂肪含量1.6%～2.1%，碳水化合物含量37.6%～48. 5%，并含有豐富的Ca、Fe等礦質元素及 VC、VB1、 VB2等維生素［1］。白蕓豆蛋白質的必需氨基酸組成符合聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）標準模式，是一種營養(yǎng)價值高、容易消化的優(yōu)質蛋白質資源［2］。近年來的研究表明，白蕓豆蛋白質中含有一種天然的α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor，α-AI），其分子質量約為30～40 ku［3-5］，該α-AI可以用于治療糖尿病和肥胖癥［6］等，是降糖、降脂及減肥保健食品和藥品的新型原料。但是白蕓豆中α-AI的熱穩(wěn)定性不高［7］，直接影響到其生產和應用。目前尚未見到關于制備熱穩(wěn)定性較高的白蕓豆 多肽的研究報道。本實驗以白蕓豆為原料，以α-淀粉酶抑制率為指標，首先篩選出酶解白蕓豆α-AI粗提液的最佳用酶，然后對該蛋白酶制備多肽的工藝條件進行優(yōu)化，最后比較研究α-AI粗提液和多肽的熱穩(wěn)定性，旨在為白蕓豆保健食品和藥品的開發(fā)奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

白蕓豆 云南銀健食品有限公司。

蛋白質電泳Marker 北京天恩澤基因科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、3.350酸性蛋白酶（4.5 萬U/g） 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；537酸性蛋白酶（3.9 萬U/g）、木瓜蛋白酶（117 萬U/g）、堿性蛋白酶（8.8 萬U/g）、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（18.4 萬U/g） 廣西龐博生物工程有限公司；α-淀粉酶（5 萬U/g） 合肥博美生物科技有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

DYCZ-23A型電泳儀 北京市六一儀器廠；數顯恒溫水浴提取器 國華電器有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；卷式微濾膜元件Ⅰ 中科瑞陽膜技術（北京）有限公司；卷式超濾膜元件Ⅱ 北京安德膜分離技術工程有限公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海申升科技有限公司；Thermo MR23冷凍離心機 美國熱電公司。

1.3方法

1.3.1蛋白質及多肽含量測定方法

蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的方法進行；多肽含量采用GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法測定。

1.3.2α-淀粉酶抑制率的測定方法

采用Bernfeld法［8］測定白蕓豆α-AI粗提液及多肽的α-淀粉酶抑制率。

1.3.3白蕓豆清蛋白的提取及α-AI粗提液的制備

取一定量的白蕓豆粉，按料液比1∶10（m/V）加入蒸餾水，50 ℃條件下提取3 h，離心取上清液，沉淀物按前述工藝再提取一次，合并兩次的上清液，得到白蕓豆清蛋白提取液。由于α-AI的分子質量為30～40 ku，因此將白蕓豆清蛋白提取液用0.2 μm的濾膜微濾后，再用截留分子質量為50 ku的超濾膜超濾，濾出液再用截留分子質量為10 ku的超濾膜超濾，取截留液即為α-AI粗提液［9］，并測定α-AI 粗提液的等電點［10］。

1.3.4白蕓豆多肽的制備與工藝條件優(yōu)化

于α-AI粗提液中分別加入胃蛋白酶、3.350酸性蛋白酶、537酸性蛋白酶、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，在各蛋白酶適宜條件下酶解1 h。比較不同蛋白酶酶解產物的α-淀粉酶抑制活性，以α-淀粉酶抑制率最高的酶解產物確定最佳用酶［11］。將α-AI粗提液真空濃縮至一定蛋白質含量，調節(jié)至一定pH值，加入一定量已篩選出的最佳蛋白酶，在一定溫度下酶解一定時間后滅酶，4 000 r/min離心取上清液即為白蕓豆多肽溶液［12］。

以α-淀粉酶抑制率和多肽得率為指標，分別進行加酶量（3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 U/g），酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5），酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）和酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）單因素試驗。由于本實驗旨在制備高α-淀粉酶抑制活性的白蕓豆多肽，因此在單因素試驗基礎上，以有利于提高α-淀粉酶抑制率為主要目的，兼顧多肽得率為原則，選取適宜參數范圍，擬定酶解多肽的L9（34）正交試驗，并對正交試驗結果進行驗證。

1.3.5白蕓豆α-AI粗提液和多肽的熱穩(wěn)定性研究［7］

將白蕓豆α-AI粗提液和多肽溶液分別在50、60、70、80、85、90、95 ℃水浴中保溫30 min，冷卻至室溫后測定樣品的α-淀粉酶抑制率。再將α-AI粗提液和多肽溶液在85、90 ℃水浴中分別保溫5、10、15、20、25、 30 min，冷卻至室溫后測定樣品的α-淀粉酶抑制率。

1.3.6白蕓豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子質量分析［13］

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）確定白蕓豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子質量。分離膠質量分數12%，濃縮膠質量分數5%，考馬斯亮藍R-250染色。將蛋白質標準品的相對遷移率對分子質量的對數作圖得到標準曲線，再根據標準曲線的回歸方程計算白蕓豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子質量。

1.4統(tǒng)計分析方法

每個實驗重復3 次，剔除異常值，取平均值作為結果。數據用Minitab 15軟件進行方差分析。

2　結果與分析

2.1白蕓豆α-AI粗提液的等電點測定結果

圖1　白蕓豆a-AI粗提液的等電點Fig.1　Isoelectric point of α-AI extract from white kidney bean

由圖1可知，白蕓豆α-AI粗提液在pH 4.4時，離心上清液中蛋白質含量最低，因此α-AI粗提液的等電點為pH 4.4。

2.2制備白蕓豆多肽的蛋白酶篩選結果

據文獻［14］ 報道，白蕓豆α-AI經過鏈霉蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶水解后會失去其抑制活性，而它對胃蛋白酶的水解有一定的抵抗力，即α-AI經胃蛋白酶水解后，仍能保持一定的活性。為探究白蕓豆α-AI被其他蛋白酶水解后能否保持其抑制活性，本實驗選擇酸性、中性和堿性蛋白酶對α-AI粗提液進行酶解。酶解前的α-AI粗提液的α-淀粉酶抑制率為79.27%，而胃蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率為46.94%（表1），3.350酸性蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率（74.58%）最高，537酸性蛋白酶酶解液次之。α-AI粗提液經枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解后失去了抑制活性，這與小麥α-AI具有的枯草芽孢桿菌蛋白酶/ α-淀粉酶同效抑制性不同［15］。因此，本實驗選用3.350酸性蛋白酶制備白蕓豆多肽。

表1　6 種蛋白酶酶解白蕓豆α-AI粗提液效果的對比Table1　Comparative effectiveness of six proteases in hydrolyzing white kidney bean to obtain -AI extract

2.33.350酸性蛋白酶制備白蕓豆多肽的單因素試驗結果

2.3.1加酶量對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響

圖2　加酶量對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.2　Effect of enzyme dosage on peptide yie ld and α-amylase inhibitory activity

在酶解溫度45 ℃、酶解時間1 h、酶解pH 3.0的條件下，加酶量與多肽得率和α-淀粉酶抑制率的關系見圖2。隨著加酶量不斷增大，白蕓豆多肽得率緩慢增加，這是因為隨著酶量的增加，反應速率隨之增大，當底物分子能與酶分子百分之百結合的時候，再增加酶的用量也不會對水解速率有明顯的影響［16］。而隨著加酶量增大，多肽α-淀粉酶抑制率不斷下降，當加酶量＜4 000 U/g時，多肽的α-淀粉酶抑制率處于較高水平。綜合考慮兩方面因素，選擇加酶量為3 500 U/g。

圖3　酶解pH值對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑 制率的影響Fig.3　Effect of pH on peptide yield and α-amylase inhibitory activity

2.3.2酶解pH值對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響由圖3可知，在加酶量4 000 U/g、酶解溫度45 ℃、酶解時間1 h時，隨著酶解pH值不斷增大，白蕓豆多肽得率逐漸降低。這是因為3.350酸性蛋白酶在pH值較低時酶活力較高。當pH＜3.5時，隨著pH值增大，多肽α-淀粉酶抑制率逐漸降低，pH＞3.5時，α-淀粉酶抑制率基本不變。綜合兩方面因素，選取pH 2.5為宜。

2.3.3酶解溫度對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響

圖4　酶解溫度對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on peptide yield and α-amylase inhibitory activity

在加酶量4 000 U/g、酶解pH 3.0、酶解時間1 h的條件下，酶解溫度對多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響見圖4。當酶解溫度＜50 ℃時，多肽得率隨著溫度的升高而增大，溫度為50 ℃時達到最大，當酶解溫度＞50 ℃時，多肽得率略有下降。這是因為當酶解溫度較高時，酶分子吸收了過多的能量，引起了維持酶分子結構的次級鍵解體，導致蛋白酶變性，從而使酶活性減弱或喪失［17］。此外，當酶解溫度為40 ℃時，多肽α-淀粉酶抑制率最高，隨著溫度繼續(xù)升高，α-淀粉酶抑制率略有下降。綜合考慮兩方面因素，選擇酶解溫度為50 ℃。

2.3.4酶解時間對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響

在酶解溫度45 ℃、酶解pH 3.0、加酶量4 000 U/g時，酶解時間與多肽得率和α-淀粉酶抑制率的關系見圖5。酶解時間＜2 h時，隨著時間的延長，多肽得率緩慢增大，2 h時達到最大，再延長酶解時間，多肽得率略有下降，這可能是因為多肽又被蛋白酶酶解成氨基酸，因此多肽含量有所下降。而隨著酶解時間的延長，α-淀粉酶抑制率不斷降低，這可能是因為前期酶解所得活性多肽又會被蛋白酶繼續(xù)酶解，使多肽中具有α-淀粉酶抑制作用的活性部位的特定結構遭到破壞，從而失去部分抑制活性［18］。酶解時間＜1 h時，多肽的α-淀粉酶抑制率較高。綜合考慮兩方面因素，選擇酶解時間為1 h。

圖5　酶解時間對白蕓豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.5　Effect of hydrolysis time on peptide yield and α-amylase inhibitory activity

2.4白蕓豆多肽制備正交試驗結果

綜合單因素試驗結果，以α-淀粉酶抑制率為指標，進行白蕓豆多肽制備的正交試驗，結果見表2。

表2　正交試驗設計與結果Table2　Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3　方差分析結果Table3　Analysis of variance e

由表2可知，制備白蕓豆多肽的最佳工藝組合為A1B1C3D2，即加酶量3 200 U/g、酶解pH 2.2、酶解溫度55 ℃、酶解時間60 min。在此條件下進行驗證實驗，白蕓豆多肽α-淀粉酶抑制率的平均值為80.82%，高于正交表中的其他組合，由此證明正交試驗結果可靠。各影響因素的主次順序為C＞A＞B＞D，即酶解溫度對α-淀粉酶抑制率的影響最大，加酶量和酶解pH值次之，酶解時間的影響最小。方差分析結果（表3）表明酶解溫度對白蕓豆多肽α-淀粉酶抑制率的影響顯著，其他3 個因素的影響均不顯著。

2.5白蕓豆α-AI粗提液和多肽的熱穩(wěn)定性

2.5.1α-AI 粗提液和多肽對不同溫度的熱穩(wěn)定性

圖6　6 α-AI粗提液和多肽對不同溫度的熱穩(wěn)定性Fig.6　Thermal stability of α-AI extract and polypeptide at different temperatures

由圖6可知，白蕓豆α-AI粗提液的α-淀粉酶抑制率在溫度低于80 ℃時變化不大，受溫度的影響較??；此后隨著溫度的升高，α-淀粉酶抑制率快速下降；當在溫度＞85 ℃水浴中保溫30 min后，α-AI粗提液完全喪失α-淀粉酶抑制活性，這與張曉琦等［19］的研究結果一致。白蕓豆α-AI粗提液的熱穩(wěn)定性略低于小麥［20］和蕎麥［21］α-AI的熱穩(wěn)定性。而白蕓豆多肽的α-淀粉酶抑制率在溫度＜8 0 ℃時緩慢降 低，受溫度的影響也較??；在85 ℃保溫30 min后，其α-淀粉酶抑制率僅降低7%左右；當在溫度高于90℃水浴中保溫30 min后，多肽即失去α-淀粉酶抑制活性。結果表明，盡管白蕓豆多肽初始的α-淀粉酶抑制活性略低于α-AI粗提液，但其熱穩(wěn)定性相對較好，在高溫環(huán)境下其α-淀粉酶抑制活性可保持更長時間，有利于工業(yè)化應用。

圖7　85 ℃條件下加熱時間對α-AI粗提液和多肽熱穩(wěn)定性的影響Fig.7　Effect of heating time at 85 ℃ on the stability of α-AI extract and polypeptide

2.5.2α-AI粗提液和多肽在85 ℃條件下隨時間變化的熱穩(wěn)定性由圖7可知，隨著白蕓豆α-AI粗提液在85 ℃水浴中保溫時間延長，其α-淀粉酶抑制率迅速降低，15 min后，其抑制活性完全喪失。而白蕓豆多肽在相同溫度下保溫，其α-淀粉酶抑制活性緩慢降低，30 min后僅降低7%左右。結果表明，白蕓豆多肽在85 ℃條件下的熱穩(wěn)定性明顯高于α-AI粗提液。這可能是因為α-AI粗提液的主要成分為蛋白質，而熱作用可破壞蛋白質分子的天然結構，讓本來處在蛋白質分子內部的疏水性基團暴露出來，這樣蛋白質分子間的疏水作用增強，互相聚集形成沉淀，發(fā)生不可逆的蛋白質變性，使α-AI粗提液喪失其抑制活性。而多肽由于不具有蛋白質分子的高級結構，所以在加熱時較穩(wěn)定。如大豆多肽就具有無蛋白質變性、加熱不凝固等優(yōu)良性能［22］。

2.5.3α-AI粗提液和多肽在90 ℃條件下隨時間變化的熱穩(wěn)定性

圖8　90 ℃條件下加熱時間對α-AI粗提液和多肽熱穩(wěn)定性的影響Fig.8　Effect of heating time at 90 ℃ on the stability of α-AI extract and polypeptide

由圖8可知，白蕓豆α-AI粗提液在90 ℃條件下保溫5 min后，其α-淀粉酶抑制率僅剩余33.97%，10 min后完全失去抑制活性。而白蕓豆多肽在90 ℃水浴中保溫5 min后仍具有68.12%的α-淀粉酶抑制率；隨著保溫時間延長，其α-淀粉酶抑制率逐漸降低；保溫25 min后，其抑制活性才完全失去。由此可見，白蕓豆多肽在90 ℃條件下的熱穩(wěn)定性高于α-AI粗提液。白蕓豆α-AI粗提液和多肽在90 ℃條件下的熱穩(wěn)定明顯低于其在85 ℃條件下的熱穩(wěn)定性，這可能是因為對蛋白質變性而言，溫度每升高10 ℃，反應速率增加約600 倍［22］，因此α-AI粗提液和多肽在90 ℃時變性更快，保持α-淀粉酶抑制活性的時間更短。

2.6白蕓豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子質量

電泳分析結果（圖9）表明，白蕓豆清蛋白共分離出7 條蛋白亞基條帶，α-AI粗提液有2 條蛋白亞基條帶，將各亞基的相對遷移率帶入Marker標準曲線（y=0.785x+ 3.957（R2=0.989））中，計算得出清蛋白各亞基分子質量分別為107.56、97.83、87.80、66.08、52.12、34.98、29.70 ku；α-AI粗提液中蛋白質各亞基的分子質量為34.98、29.70 ku，說明清蛋白經過兩次超濾后只保留下了兩個蛋白質組分，其中分子質量為34.98 ku的亞基條帶顏色很深，與文獻［4］中報道的白蕓豆α-AI的分子質量36.0 ku很接近，可能是α-AI。與文獻報道有一定差異的原因可能是本實驗中的白蕓豆產地和電泳條件不同所致。將多肽電泳條帶上下邊界的相對遷移率帶入標準曲線，計算出具有α-淀粉酶抑制活性的多肽分 子質量在7.53～9.09 ku范圍內。

圖9　白蕓豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的SDS-PAGE圖PAGEFig.9　SDS-PAGE of albumin， α-AI extract and polypeptide from white kidney bean

3　結 論

白蕓豆α-AI粗提液的等電點為pH 4.4。通過比較胃蛋白酶、3.350酸性蛋白酶、537酸性蛋白酶、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對白蕓豆α-AI粗提液的酶解效果，最終確定3.350酸性蛋白酶為制備高α-淀粉酶抑制活性多肽用酶。實驗結果表明，制備白蕓豆多肽的最佳工藝條件為：加酶量3 200 U/g、酶解pH 2.2、酶解溫度55 ℃、酶解時間60 min，此條件下白蕓豆多肽α-淀粉酶抑制率為80.82%。對白蕓豆多肽α-淀粉酶抑制率的影響因素排序為：酶解溫度＞加酶量＞酶解pH值＞酶解時間，其中酶解溫度對α-淀粉酶抑制率影響顯著。本研究制備的白蕓豆多肽熱穩(wěn)定性明顯高于α-AI粗提液，該多肽的α-淀粉酶抑制活性在85、90 ℃條件下能保持更長時間。由凝膠電泳分析可知，α-AI粗提液共有2 條蛋白亞基，其中分子質量為34.98 ku的亞基為α-AI，具有α-淀粉酶抑制活性的多肽分子質量為7.53～9.09 ku。

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Preparation and Thermal Stability of White Kidney Bean Polypeptide with α-Amylase Inhibitory Activity

ZI Yan， WANG Changqing*， CHEN Xiaomeng， CHEN Tong， LI Xiaofan， HAO Zhiping， YU Wenjuan
（College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

In this study， white kidney bean was used as the raw material to prepare polypeptide with α-amylase inhibitory activity by enzymatic hydrolysis. The hydrolysi s efficiencies of acidic， neutral and alkaline protease for α-amylase inhibitor（α-AI） activity were compared to determine 3.350 acidic protease as the best enzyme. Using combination of single factor and orthogonal array de signs an enzyme dosage of 3 200 U/g， an initial pH of 2.2 and 60 min hydrolysis at 55 ℃ were found to be optimal to obtain th e maximum α-amylase inhibitory rate of 80.82%. White kidney bean polypeptide derived from α-AI extract had higher thermal stability than α-AI extract， and the α-amylase inhibitory activity of the polypeptide could be maintained for a longer time at 85 and 90 ℃. Electrophoretic analysis showed that the molecular weight of white kidney bean polypeptide was 7.53-9.09 ku.

white kidney bean albumin； α-amylase inhibitor （α-AI）； polypeptide； α-amylase inhibitory activity； thermal stability

TS201.1

A

1002-6630（2015）13-0190-06

10.7506/spkx1002-6630-201513035

2014-08-11

訾艷（1990—），女，碩士，研究方向為食品生物技術與功能食品開發(fā)。E-mail：892853695@qq.com

王常青（1956—），男，教授，學士，研究方向為食品生物技術與功能食品開發(fā)。E-mail：wcq@sxu.edu.cn