李　艷，董振玲，李　佳，牟德華，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

羊羔美酒大曲中乳酸菌多樣性及分子鑒定

李艷1，2，董振玲1，3，李佳1，牟德華1，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

目的：分離和鑒定羊羔美酒大曲中的乳酸菌，探尋其菌群多樣性，為釀酒工藝條件改進(jìn)提供參考。方法：將酒曲進(jìn)行梯度稀釋、富集培養(yǎng)、平板畫線等分離純化，獲取乳酸菌單菌落。采用菌落特征和個(gè)體形態(tài)特征結(jié)合的方法進(jìn)行乳酸菌形態(tài)鑒定。乳酸菌的分子鑒定采用重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技術(shù)和16S rDNA序列分析法。結(jié)果：從羊羔美酒大曲中共得到65 株乳酸菌，形態(tài)學(xué)分為9 類。用Rep-PCR技術(shù)在75%的相似性上將其區(qū)分為5 類，經(jīng)基因序列分析，鑒定為分屬于4 個(gè)屬的乳酸菌，分別為：片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）。結(jié)論：傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)與現(xiàn)代分子鑒定技術(shù)相結(jié)合，可快速準(zhǔn)確鑒定出羊羔美酒大曲中乳酸菌的菌群組成和多樣性。

羊羔美酒大曲；乳酸菌；分子鑒定；重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；16S rDNA序列分析

乳酸菌指利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱。在分類學(xué)上，乳酸菌這個(gè)名稱是非正式、非規(guī)范的［1］。乳酸菌與中國傳統(tǒng)釀造業(yè)息息相關(guān)。黃酒發(fā)酵屬糖化和發(fā)酵并行的過程，以多品種、高密度酵母菌和乳酸菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生酒精、乳酸和多種風(fēng)味物質(zhì)［2］。乳酸菌對(duì)釀酒過程及最終產(chǎn)品的風(fēng)味形成有突出貢獻(xiàn)，發(fā)酵初期產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵環(huán)境的pH值下降，可抑制有害菌繁殖；發(fā)酵中后期產(chǎn)生的乳酸可與酵母代謝產(chǎn)生的乙醇作用，形成乳酸乙酯以增強(qiáng)酒的濃醇感和酒香氣的柔和性［3］。酒曲是發(fā)酵的動(dòng)力，酒曲微生物菌群的組成是釀酒的源泉，鑒定酒曲中的乳酸菌對(duì)酒曲應(yīng)用和釀酒工藝改進(jìn)極有意義。

目前，越來越多的分子生物學(xué)方法，如擴(kuò)增片段長度多態(tài)技術(shù)、變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳、16S～23S rDNA間區(qū)、16S rDNA序列分析、重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技術(shù)等［4-10］已應(yīng)用于乳酸菌的分類鑒定。其中Rep-PCR是采用特定引物對(duì)細(xì)菌基因組DNA的重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)電泳技術(shù)分離后分析其多態(tài)性。該技術(shù)可以在亞種和菌株水平上對(duì)菌種進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的分類和鑒定，并且有操作簡便、重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)勢。

羊羔美酒是一種北方特色肉釀型黃酒，河北省名酒，利用大曲為糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑［11］。本實(shí)驗(yàn)檢測羊羔酒大曲中的乳酸菌，可以探明羊羔美酒的發(fā)酵驅(qū)動(dòng)力，從一個(gè)側(cè)面解密酒的風(fēng)味特征，對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化釀酒工藝，篩選有益于酒類釀造和形成特色風(fēng)味的乳酸菌奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

羊羔美酒大曲由河北味道府酒業(yè)有限責(zé)任公司提供。

MRS固體培養(yǎng)基［12］（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母浸粉5.0、檸檬酸氫二銨2.0、葡萄糖20.0、乙酸鈉2.0、K2HPO42.0、MgSO40.58、MnSO40.25、瓊脂18.0、CaCO310，吐溫-80 1.0 mL蒸餾水配制，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中不添加碳酸鈣、中性紅和瓊脂。

1.2試劑與儀器

引物：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，1495R：5'-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3'，（GTG）5：5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3'，BOXAIR：5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GACG-3'；10×PCR Buffer、dNTP、rTaq酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

PCR儀、凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；瓊脂糖水平板電泳儀 北京六一公司。

1.3方法

1.3.1酒曲中乳酸菌的分離

樣品處理：取成品羊羔美酒大曲，分別用無菌刀在酒曲外表面、中間和內(nèi)部取樣各1.0 g，混合研磨成粉。取1 g加入100 mL無菌水，置于搖床上150 r/min搖30 min，靜止，取其上清液進(jìn)行系列10 倍梯度稀釋［11-13］。選適宜稀釋梯度的稀釋液0.2 mL傾注法接種于3 個(gè)平行MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。對(duì)在MRS培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生透明圈并長勢良好的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。再選取產(chǎn)生透明圈及在厭氧條件生長的菌落接種于液體MRS培養(yǎng)基（含20%甘油），-20 ℃條件下保藏。

乳酸菌的分離：分別選用大米、糯米、黍米為酒曲活化基質(zhì)，進(jìn)行大曲微生物的富集，30 ℃培養(yǎng)5 d。取培養(yǎng)基質(zhì)1 g，加100 mL無菌水，打漿，取5 mL漿液進(jìn)行系列10 倍梯度稀釋，選3 個(gè)合適的稀釋度0.2 mL進(jìn)行3 個(gè)平行平板的涂布分離培養(yǎng)。

1.3.2乳酸菌的初步鑒定和形態(tài)聚類

將保存的菌株進(jìn)行活化，接種于瓊脂培養(yǎng)基，劃線分離，上層傾注MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落連續(xù)純化2 次。將已純化的單菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏陽性且過氧化氫實(shí)驗(yàn)陰性的菌確定為乳酸菌［14］。將已確定為乳酸菌的菌株采用平板劃線法接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)5 d后根據(jù)其菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)進(jìn)行分類。

1.3.3乳酸菌的分子鑒定

1.3.3.1基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，獲得足夠量的菌體。取1.5 mL培養(yǎng)液12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加20 mg/mL的溶菌酶50 μL，37 ℃處理1 h。向每管加入200 μL裂解緩沖液（4 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol/L乙酸鈉，1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）），混合均勻。加入10 μL蛋白酶K（10 mg/mL），55 ℃處理30 min，向每管加入66 μL飽和NaCl溶液，充分混合后，12 000 r/min離心10 min，除去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?。取離心后上清液，加入等體積的Tris飽和酚，14 000 r/min離心5 min，取上清液，用等體積的氯仿異戊醇溶液抽提2 次，取上清液，用預(yù)冷1 倍體積的異丙醇沉淀DNA，15 000 r/min離心10 min，棄去上清液。用400 μL 70%的乙醇洗滌沉淀兩次。室溫干燥后，用50 μL無菌雙蒸水溶解DNA［15-17］。檢測DNA的純度與濃度，將DNA稀釋至質(zhì)量濃度20～50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?8］。

1.3.3.2Rep-PCR分析

（GTG）5 PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，（GTG）5（0.4 μmol/L）1 μL，模板DNA（20～50 ng）1 μL，Taq酶（0.5 U/L）0.2 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足 25 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 7 min，94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，35 個(gè)循環(huán)，最后65 ℃ 20 min［19-21］。

BOX AIR PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，BOX AIR（0.4 μmol/L）1 μL，模板DNA（20～50 ng）1 μL，Taq酶（0.5 U/L）0.5 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，35 個(gè)循環(huán)；最后65 ℃ 16 min［22-25］。

PCR產(chǎn)物的檢測：吸取8 μL PCR產(chǎn)物，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電壓140 min，經(jīng)過EB染色15 min后，利用凝膠成像系統(tǒng)成像［26］。

1.3.3.316S rDNA序列分析

擴(kuò)增乳酸菌16S rDNA使用細(xì)菌通用引物27F與1495R。PCR反應(yīng)體系：Buffer 10 μL，Taq酶0.4 μL，dNTP 1 μL，引物2 μL，DNA 2 μL，雙蒸水32.6 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min。將PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度［27］。

將樣品菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其進(jìn)行序列測定。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離與形態(tài)聚類

表1　MRS培養(yǎng)基上（培養(yǎng)5 d）乳酸菌落的形態(tài)描述Table1　Morphological characteristics of lactic acid bacteria on MRS medium （incubation for 5 days）

從羊羔美酒大曲中共分離得到168 株可以產(chǎn)生透明圈的單菌株，對(duì)單菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫實(shí)驗(yàn)后，將65 株過氧化氫實(shí)驗(yàn)顯示陰性且革蘭氏陽性的菌株初步確定為乳酸菌，其中桿菌18 株（27.7%），球菌47 株（72.3%）。根據(jù)乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的不同進(jìn)行聚類，可將桿菌分為3 類，其中形態(tài)2數(shù)量最多，共12 株，占乳桿菌數(shù)量的66.7%；球菌分為6 類，其中形態(tài)4與形態(tài)9數(shù)量較多，各有13 株和12 株，分別占乳球菌總數(shù)量的27.7%與25.5%，形態(tài)聚類結(jié)果見表1。因此，在羊羔美酒大曲中，優(yōu)勢乳酸菌群為形態(tài)2的乳桿菌和形態(tài)4與9的乳球菌。

2.2Rep-PCR技術(shù)鑒定乳酸菌

為了選擇適合大曲中乳酸菌多樣性研究的引物，本研究選取了2 種在乳酸菌Rep-PCR技術(shù)報(bào)道中使用較多的引 物（GTG）5與BOXAIR。用這兩種引物對(duì)9 種形態(tài)的乳酸菌代表菌株進(jìn)行基因擴(kuò)增。由圖1可知，用（GTG）5和BOXAIR 分別作為引物的 PCR 產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條帶譜，其分子質(zhì)量大小范圍在0.25～0.5 kb 之間，菌株之間的差異能夠明顯地被區(qū)分開來。從（GTG）5擴(kuò)增結(jié)果可知，各菌株均有良好的多態(tài)性，擴(kuò)增條帶數(shù)目均在9～15 條；而BOXA1R引物擴(kuò)增結(jié)果并不是很理想，泳道5～10的條帶均少于8 條，圖譜多態(tài)性并不理想。因此，（GTG）5在這些乳酸菌基因組中的分布比BOXA1R更為多樣，且兩者的結(jié)果對(duì)菌株的分群有差異，暗示這兩種短重復(fù)序列在基因中的分布也不同［28］。

圖1?。?GTG）5（a）和BOXA1R（b）擴(kuò)增條帶的比較Fig.1　Comparison of fingerprints obtained with （GTG） 5 （a） and BOXA1R （b）

以（GTG）5擴(kuò)增圖譜進(jìn)行多態(tài)性分析，使用NTSYSpc2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用平均連鎖法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）繪出聚類樹狀圖，并進(jìn)行菌株的分群，結(jié)果見圖2。

圖2　采用平均連鎖法構(gòu)建的Rep-PCR結(jié)果樹狀圖Fig.2　UPGMA dendrogram generated from Rep-PCR fingerprints

由圖2可知，在75%相似性上進(jìn)行分群，（GTG）5可以將9 種不同類型的乳酸菌區(qū)分為5 個(gè)群，其中群Ⅱ是最大的一個(gè)群，包含了形態(tài)4、5、6、7共4 種形態(tài)；群Ⅲ包含形態(tài)2、3兩種形態(tài)；其余形態(tài)1、形態(tài)8、形態(tài)9分別屬于群Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ。使用Rep-PCR技術(shù)可以快速地將不同菌株在基因型上進(jìn)行聚類分析。

2.316S rDNA序列分析法鑒定乳酸菌

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Rep-PCR技術(shù)的可靠性，將實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行16S rDNA測序，將所得序列結(jié)果登陸GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST（http： //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/ Blast. cgi）相似性比對(duì)，以相似度大于99%確定其屬種，測序結(jié)果見表2。

表2　乳酸菌16S rDNA序列分析結(jié)果Table2　16S rDNA sequence analysis of lactic acid bacteria

在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)菌株16S rDNA序列，與已測序菌株的序列放在一起，使用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)；利用MEGA4生物學(xué)軟件的Neighbor-Joining連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000 次Bootstrap檢驗(yàn)。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

結(jié)合圖2與圖3進(jìn)行分析可知，Rep-PCR結(jié)果樹狀圖與16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹有較好的相關(guān)性。因此，（GTG）5-PCR指紋分析技術(shù)能夠反映出不同菌株的基因組間存在的差異，可以作為鑒別菌種的手段之一［26-28］。針對(duì)羊羔美酒大曲中大量乳酸菌的基因型差異性，在后續(xù)研究中，可以建立相關(guān)Rep-PCR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，結(jié)合16S rDNA序列測序技術(shù)，便可實(shí)時(shí)了解羊羔美酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌的演變規(guī)律，為發(fā)酵工藝優(yōu)化與控制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)為羊羔美酒大曲中乳酸菌的Rep-PCR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫建立奠定了基礎(chǔ)。

圖3　基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS region sequences and Neighbor-Jointing method

另外，從以上分子鑒定結(jié)果可以看出，羊羔美酒大曲中乳酸菌種類非常豐富，存在著乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和腸球菌屬，其中片球菌屬和乳桿菌屬所占比重較大。片球菌屬、腸球菌屬和明串珠菌屬都有糖化作用，也可分解蛋白質(zhì)、產(chǎn)生乳酸、降低pH值。羊羔美酒大曲中豐富的球菌對(duì)保證其釀造過程順利進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用。乳桿菌在羊羔酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生不同類型的肽聚糖，而肽聚糖可以成為羊羔酒的風(fēng)味成分之一。另外，乳酸桿菌也可以利用霉菌等微生物代謝生成的朊、胨和多肽類物質(zhì)分解成氨基酸，推測這些乳酸桿菌與羊羔美酒獨(dú)特的香氣和富含的22 種氨基酸有著密切聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究各種乳酸菌單菌株特性、優(yōu)勢菌株的分析、及其在羊羔美酒發(fā)酵過程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為改進(jìn)釀酒工藝條件提供參考。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從羊羔美酒大曲中共分離乳酸菌65 株，形態(tài)區(qū)分為9 類，使用Rep-PCR技術(shù)將其區(qū)分為5 類，經(jīng)16S rDNA基因序列分析，將其鑒定為分屬于片球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬4 個(gè)屬的乳酸菌。研究結(jié)果反映了羊羔美酒大曲中乳酸菌的多樣性，為優(yōu)化這一我國北方特色地方名酒的釀造工藝、改進(jìn)傳統(tǒng)的配料和研究產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)特征奠定了基礎(chǔ)。

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Diversity and Molecular Biological Identification of Lactic Acid Bacteria from Yanggaomeijiu Daqu， a Traditional Chinese Liquor Fermentation Starter

LI Yan1，2， DONG Zhenling1，3， LI Jia1， MOU Dehua1，*
（1. College of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province， Shijiazhuang 050018， China；3. Hebei Inatural Biological Technology Co. Ltd.， Shijiazhuang 050800， China）

Purpose： The aim of this work was to isolate and identify lactic acid bacteria （LAB） in Yanggaomeijiu Daqu，a fermentation starter for the production of Chinese liquor Yanggaomeijiu， and to explore the diversity of LAB in Yanggaomeijiu Daqu. Methods： Individual bacterial colonies of LAB from Yanggaomeijiu Daqu were obtained through isolation and purification steps including gradient dilution， enrichment， cultivation， and plate streaking. Morphological identification of LAB isolates was performed based on colony and individual morphological characteristics and further molecular identification was carried out by repetitive sequence-based polymerase chain reaction （Rep-PCR） and 16S rDNA sequence analysis. Res ults： A total of 65 LAB isolates were obtained from Yanggaomeijiu Daqu， which could be assigned into 9 different groups by conventional microbiological anal ysis， differentiated into five types by Rep-PCR at a 75% similarity， and belonged to 4 genera including Pediococcus，Leuconostoc， Lactobacillus and Enterococcus by gene sequencing. Conclusion： The diversity and composition of LAB in Yanggaomeijiu Daqu can be identified quickly and accurately by the combination of traditional microbial separation methods and modern molecular biological identification techniques.

Yanggaomeijiu； lactic acid bacteria； molecular biological identification； repetitive sequence-based polymerase chain reaction （Rep-PCR）； 16S rDNA sequence analysis

TS261.1

A

1002-6630（2015）13-0167-05

10.7506/spkx1002-6630-201513031

2014-09-19

河北省石家莊市科技支撐計(jì)劃課題（101171271A；10117901A）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011208028）

李艷（1958—），女，教授，本科，研究方向?yàn)轱嬃暇漆勗臁⑨劸莆⑸?。E-mail：lymdh5885@163.com

牟德華（1960—），男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：dh_mou@163.com