姜太玲，吳紅洋，申光輝，董小華，張志清*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，申光輝，董小華，張志清*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

利用酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽，以底物質(zhì)量濃度、酶與底物比、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間為影響因子，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken方法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以對(duì)大腸桿菌的抑菌率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)花椒籽蛋白制備抗菌肽工藝進(jìn)行優(yōu)化。其最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.2 ℃、酶解時(shí)間4.7 h，此條件下酶解產(chǎn)生的抗菌肽復(fù)合物的水解度為9.05%，對(duì)大腸桿菌的抑菌率為56.98%。

花椒籽蛋白；抗菌肽；酸性蛋白酶；抑菌率

抗菌肽又叫抗生素肽、抗微生物肽，是由多種生物細(xì)胞特定的基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類(lèi)具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、抑殺腫瘤細(xì)胞等生物活性作用的多肽，由12～100 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量小于10 kD，是生物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分［1-4］。由于抗菌肽具有廣譜殺菌性以及良好的溶解性和穩(wěn)定性，易在 消化系統(tǒng)中降解成對(duì)人類(lèi)副作用小、使用安全的氨基酸，對(duì)人類(lèi)而言這將成為一種具有前途的新型食品防腐劑。目前有學(xué)者用從天然蠶蛹、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌中分離得到的抗菌肽分別對(duì)鮮豬肉、羅非魚(yú)片進(jìn)行處理后，表現(xiàn)出良好的防腐效果［5-6］，而從乳酸菌中分離得到的乳酸鏈球菌素（Nisin）已在50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用于食品的防腐保鮮［7］。

花椒籽，是花椒果皮生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，除含有豐富的油脂外，還含有18%的蛋白質(zhì)［8］。目前，對(duì)于花椒籽蛋白的研究主要集中在提取工藝上，而從其蛋白中提取活性肽的研究除王輝［9］、宋燕［10］等制備出的抗氧化肽外，還未見(jiàn)從花椒籽蛋白中提取具有抑菌活性多肽的研究報(bào)道。而在植物種子中，有學(xué)者已從咖啡豆、豇豆、小麥、蘇鐵和稗草等植物種子中分離出抗菌肽［11-15］，這為從花椒籽蛋白中制備具有抗菌活性的多肽提供了理論上的依據(jù)。

目前，制備抗菌肽常用到的蛋白酶包 括胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等，利用這些蛋白酶已從酪蛋白、螺旋藻、油茶粕蛋白和小麥蛋白等多種材料中分離出抗菌肽［16-19］，而選用酸性蛋白酶制備抗菌肽的研究很少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以花椒籽蛋白為原料，以其酶解產(chǎn)物為研究對(duì)象，對(duì)大腸桿菌的抑菌率為指標(biāo)，優(yōu)化酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的條件，對(duì)制備抗菌肽的主要因素進(jìn)行研究，同時(shí)利用響應(yīng)面回歸分析對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為花椒籽蛋白抗菌肽在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

花椒籽 涼山州金陽(yáng)縣花椒產(chǎn)區(qū)。

大腸桿菌（ATCC 25922） 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定保存；酸性蛋白酶（酶活力≥50 U/mg） 北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉 成都科龍化工試劑廠；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

CP225D型電子天平 德國(guó)賽多利斯股份公司；真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZQ-A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Thermo ST16R冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛有限公司。

1.2方法

1.2.1花椒籽蛋白的提取［20］

脫脂花椒籽→NaOH溶液提取→離心去沉淀→HCl溶液進(jìn)行酸析→離心去上清液→水洗沉淀→調(diào)pH值→真空冷凍干燥→花椒籽蛋白

1.2.2酸性蛋白酶對(duì)花椒籽蛋白的酶解

酶解制備工藝參考薛培宇等［21］的方法，并作一定的修改。取1.0 g花椒籽蛋白溶于適量的去離子水中，在適當(dāng)溫度的恒溫水浴鍋中預(yù)熱，達(dá)到酶解溫度后用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至適宜值，加入酸性蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解過(guò)程中不斷攪拌，并滴加HCl或NaOH以維持溶液的pH值。酶解完成后取出放入95 ℃水浴鍋中滅酶15 min，冷卻，然后4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH值至中性，真空冷凍干燥，凍干粉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照1.2.2節(jié)的方法制備花椒籽蛋白的酶解液，對(duì)其中的底物質(zhì)量濃度（10、20、30、40、50 mg/mL），酶與底物比（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）進(jìn)行考察。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、pH 4.0的條件下，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取酶與底物比（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時(shí)間（X3）這3 個(gè)影響酶解產(chǎn)物抑菌活性的主要因素作為響應(yīng)面考察因素，以對(duì)大腸桿菌抑菌率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.5b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及對(duì)模型進(jìn)行方差分析。

1.2.5水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法［22］測(cè)定。

1.2.6抑菌活性的測(cè)定

稱(chēng)取0.250 g凍干粉溶于2 mL去離子水中，調(diào)節(jié)樣液的pH值至近中性，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，然后用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

抑菌率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［23］，并作一定的修改。以大腸桿菌為受試菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。取過(guò)濾除菌后的樣液100 μL，加LB培養(yǎng)基30 μL和菌懸液70 μL（菌懸液濃度為103～104CFU/mL）并混勻，37 ℃、150 r/min搖床孵育1 h，取100 μL傾注于LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算菌落數(shù)。以去離子水為對(duì)照組。計(jì)算抑菌率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面分析以外的其他數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行分析，0.01＜P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽主要影響因素分析

2.1.1底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響

在酶與底物比4.0%、pH 3.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定不同底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著底物質(zhì)量濃度的增大，酶解產(chǎn)物的抑菌活性增加，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌率達(dá)到最大；隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶解產(chǎn)物的抑菌活性呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，下降的原因可能是底物質(zhì)量濃度增大導(dǎo)致酶解不完全，其中具有抑菌活性組分的比例下降，致使抑菌率降低，而質(zhì)量濃度在40 mg/mL后的抑菌率出現(xiàn)升高，其具體原因還有待進(jìn)一步研究。因此，最佳底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL，優(yōu)化試驗(yàn)底物質(zhì)量濃度選用30 mg/mL。

圖1　底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.2酶與底物比對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響

在底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、pH 3.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定不同酶與底物比對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著酶與底物比的增加，酶解產(chǎn)物的抑菌活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，酶與底物比為3.0%時(shí)酶解產(chǎn)物的抑菌活性達(dá)到最大。原因可能是酶與底物比較低時(shí)，酶解不充分，隨著酸性蛋白酶與花椒籽蛋白比例的增加，酶解產(chǎn)物中具有抑菌活性的多肽量增加，抑菌活性隨之增強(qiáng)；當(dāng)酶與底物比較高時(shí)，酶與酶之間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，過(guò)量的蛋白酶會(huì)將具有抑菌活性的多肽酶解成無(wú)抑菌活性的小分子片段或酶解成具有促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)作用的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，最佳酶與底物比為3.0%，優(yōu)化試驗(yàn)酶與底物比選用2.0%～4.0%。

圖2　酶與底物比對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響Fig.2　Effect of enzyme/substrate ratio on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.3pH值對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響

在底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定不同pH值對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著pH值的增加，酶解產(chǎn)物的抑菌活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，pH值為4.0時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大。原因可能是，當(dāng)pH值低于或高于酶的最適pH值時(shí)，pH值會(huì)破壞蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，引起酶的失活；也可能改變了底物的解離狀態(tài)，導(dǎo)致底物不能與酶結(jié)合。因此，最佳pH值為4.0，優(yōu)化試驗(yàn)pH值選用4.0。

圖3　pH值對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響Fig.3　Effect of pH on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.4酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響

在底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、 pH 4.0、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定不同酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的抑菌活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，酶解溫度為55 ℃時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大。原因可能是，酶解溫度的升高，提高了酶分子與花椒籽蛋白分子間的碰撞概率，使抑菌活性增大；當(dāng)酶解溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)使蛋白酶變性失活，或影響酶與底物的結(jié)合，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致抑菌活性降低。因此，最佳酶解溫度為55 ℃，優(yōu)化試驗(yàn)酶解溫度選用50～60 ℃。

圖4　酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on the antibacterial activity of hydrolysate

2.1.5酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響

在底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、pH 4.0、酶解溫度55 ℃的條件下，測(cè)定不同酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的抑菌活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，酶解時(shí)間為5 h時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大。原因可能是，在5 h以前，酶解時(shí)間太短，酶解不充分，酶解產(chǎn)物的抑菌活性受到限制；5 h以后，具有抑菌活性的多肽可能會(huì)酶解成無(wú)抑菌活性的小分子片段或酶解成具有促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)作用的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，最佳酶解時(shí)間為5 h，優(yōu)化試驗(yàn)酶解時(shí)間選用4～6 h。

圖5　酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌效果的影響Fig.5　Effect of hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate

通過(guò)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果分析可知，酶與底物比、酶解溫度和酶解時(shí)間這3 個(gè)因素對(duì)酸性蛋白酶提取花椒籽蛋白所得抗菌肽復(fù)合物的抑菌活性影響顯著。單因素試驗(yàn)所確定的酸性蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的合適條件為：底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間5 h，此試驗(yàn)結(jié)果為設(shè)定響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的零點(diǎn)提供參考。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽

2.2.1響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及制備的抗菌肽抑菌效果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，運(yùn)用Design Expert 8.0.5b軟件，選取酶與底物比、酶解溫度和酶解時(shí)間這3 個(gè)影響顯著的因素，各取3 個(gè)水平，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，對(duì)酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，其響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表1和表2。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table1　Experimental design and results for RSM

表2　方差分析結(jié)果Table2　Results of analysis of variance

由表2可知，回歸模型的P值為0.000 2，表明回歸模型是顯著的。失擬項(xiàng)的P檢驗(yàn)值為0.14（P＞0.05），表明該模型可以充分地解釋響應(yīng)中的變異，模型擬合度高，相對(duì)于純誤差是不顯著的。同時(shí)該模型具有較高的回歸系數(shù)（R2=96.78%），說(shuō)明對(duì)于加工過(guò)程中的數(shù)據(jù)，有96.78%的抑菌率變異可由該模型解釋。因此，這種試驗(yàn)方法是可靠的，可以用該模型對(duì)酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽的抑菌率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

在該模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)X2，平方項(xiàng)，交互項(xiàng)X1X3、X2X3的影響均達(dá)到極顯著水平；交互項(xiàng)X1X2的影響達(dá)到顯著水平。由方差分析中的P值可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)抑菌率影響大小的順序?yàn)椋好附鉁囟龋久概c底物比＞酶解時(shí)間。

綜合上述分析結(jié)果，得到酶與底物比（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時(shí)間（X3）的二次多項(xiàng)回歸方程：

2.2.2響應(yīng)面分析

采用Design Expert 8.0.5b軟件對(duì)3 個(gè)因素間的交互作用進(jìn)行全面的模型分析，模型的響應(yīng)面曲線圖見(jiàn)圖6～8。

圖6　酶與底物比和酶解溫度交互作用對(duì)抑菌活性的影響Fig.6　Response surface and contour plots for the effect of enzyme/ substrate ratio and hydrolysis temperature on the antibacterial activity of hydrolsate

由圖6可知，無(wú)論酶解溫度處于何種水平，隨著酶與底物比的增加，酶解產(chǎn)物的抑菌活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，原因可能為酶與底物處于低水平時(shí)，酶解不充分，生成抗菌肽的量較少，而處于較高水平時(shí)，生成的抗菌肽被酶解為更小的分子片段；無(wú)論酶與底物比處于何種水平，隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的抑菌活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，原因可能為高于或低于酶解的最適溫度都會(huì)破壞酸性蛋白酶的活性，從而影響酶解反應(yīng)的進(jìn)行，造成抑菌活性的降低。

由圖7可知，無(wú)論酶解時(shí)間出于何種水平，隨著酶與底物比的增加，酶解產(chǎn)物的抑菌活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；無(wú)論酶與底物比處于何種水平，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的抑菌活性都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，原因可能是酶解時(shí)間太短，具有抗菌活性的基團(tuán)沒(méi)有完全暴露出來(lái)，而酶解時(shí)間太長(zhǎng)，具有抗菌活性的多肽被水解成了氨基酸等物質(zhì)。

圖7　酶與底物比和酶解時(shí)間交互作用對(duì)抑菌活性的影響Fig.7　Response surface and contour plots for the effect of enzyme/substrate ratio and hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate

圖8　酶解溫度和酶解時(shí)間交互作用對(duì)抑菌活性的影響Fig.8　Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis temperature and hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate

由圖8可知，當(dāng)酶解時(shí)間處于低水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性逐漸降低，原因可能是溫度過(guò)高，破壞了酶解產(chǎn)物的穩(wěn)定性，影響了多肽的抑菌活性；而酶解時(shí)間處于高水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的抑菌活性表現(xiàn)出平緩的先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度處于低水平時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的抑菌活性變化平緩，酶解反應(yīng)進(jìn)行5.5 h后，抑菌率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是時(shí)間太長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物發(fā)生了解離，生成了無(wú)抑菌活性的物質(zhì)；酶解溫度處于高水平時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但在5～6 h這一段時(shí)間內(nèi)，變化趨勢(shì)較為平緩。

2.2.3最佳酶解工藝條件的驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert 8.0.5b軟件分析可得，酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.01%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.22 ℃、酶解時(shí)間4.68 h，在此優(yōu)化條件下，酶解產(chǎn)物抑菌率的理論值為56.46%。結(jié)合實(shí)際條件，最終選擇的試驗(yàn)條件為底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.2 ℃、酶解時(shí)間4.7 h，實(shí)際測(cè)得酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的平均抑菌率為56.98%。與理論值相比，相對(duì)誤差為0.91%。說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。在該優(yōu)化條件下，酶解產(chǎn)物的水解度為9.05%，由于酶解產(chǎn)物的水解度與抗菌肽的抑菌率沒(méi)有顯著的線性關(guān)系［24-25］，所以本研究中只對(duì)在最佳工藝條件下獲得的抗菌肽進(jìn)行了水解度的測(cè)定。

3　結(jié) 論

本研究對(duì)酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白條件進(jìn)行了優(yōu)化以及酶解產(chǎn)物抗菌性的研究，針對(duì)酶解過(guò)程中對(duì)大腸桿菌抑菌活性影響顯著的酶與底物比、酶解溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行了深入研究。最后得出在底物質(zhì)量濃度30 mg/mL、酶與底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解溫度51.2 ℃、酶解時(shí)間4.7 h時(shí)，測(cè)得酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的平均抑菌率為56.98%，驗(yàn)證結(jié)果顯示，該模型可靠，具有很好的預(yù)測(cè)能力。另外，在該模型條件下，所得酶解產(chǎn)物的水解度為9.05%。

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸性蛋白酶制備的花椒籽蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有一定的抑菌效果，但抑制率較本項(xiàng)目中其他蛋白酶酶解產(chǎn)物而言較低，后續(xù)工作應(yīng)將其作進(jìn)一步純化以提高抑菌活性，并進(jìn)一步研究不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑菌機(jī)理。在某些條件下制備的花椒籽蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，可能是酶解產(chǎn)生的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了大腸桿菌的生長(zhǎng)，但具體原因還有待進(jìn)一步探究。

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Preparation of Antibacterial Peptide Derived from Hydrolysis of Prickly Ash Seed Protein by Acid Protease

JIANG Tailing， WU Hongyang， SHEN Guanghui， DONG Xiaohua， ZHANG Zhiqing*
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an 625014， China）

This work reports the preparation of antibacterial peptide by enzymatic hydrolysis of prickly ash seed protein with acid protease. Substrate concentration， enzyme/substrate ratio， pH， hydrolysis temperature and hydrolysis time were investigated by single factor method for their effect on the anti-E. coli activity of hydrolysates. Optimization of enzyme/ substrate ratio， hydrolysis temperature and hydrolysis time based on anti-E. coli activity of hydrolysates was carried out using a Box-Behnken experimental design. The degree of hydrolysis of prickly ash seed protein was 9.05% and the inhibitory rate of the produced antibacterial peptide against E. coli was 56.98% when the hydrolysis experiment was carried out for 4.7 h at 51.2 ℃ and an initial pH of 4.0 with a substrate concentration of 30 mg/mL and an enzyme/substrate ratio of 3.0%.

prickly ash seed protein； antibacterial peptide； acid protease； inhibitory rate

TS201.2

A

1002-6630（2015）13-0148-06

10.7506/spkx1002-6630-201513028

2014-09-03

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)科建設(shè)雙支計(jì)劃”項(xiàng)目（06070909）

姜太玲（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：ynjiangtailing@163.com

張志清（1976—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油副產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用。E-mail：zqzhang721@163.com