吳　寒，肖　愈，李　偉，芮　昕，王　丹，徐　笑，馬宇瀟，黃　璐，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中生化成分的動(dòng)態(tài)變化

吳寒，肖愈，李偉，芮昕，王丹，徐笑，馬宇瀟，黃璐，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

研究燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定燕麥發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的麥角固醇含量、利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定燕麥發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)水解情況。結(jié)果表明：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物pH值明顯下降，最低達(dá)到pH 3.90；總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間明顯上升，最終達(dá)到0.74%；氨基酸態(tài)氮含量在24～36 h達(dá)到最大值0.06%，之后快速下降；還原糖含量在36 h內(nèi)顯著增加，達(dá)到41.17 g/100 g之后逐漸下降。麥角固醇含量持續(xù)上升，最終增加至213.64 ?g/g。大分子燕麥蛋白被明顯水解，小分子蛋白逐漸生成；其中分子質(zhì)量為35.08 kD的蛋白水解速率最快，平均水解率為55.57%。

燕麥甜醅；甜酒曲；生化成分；麥角固醇；燕麥蛋白

燕麥屬于禾本科燕麥屬，按其外稃性狀可將其分為帶稃型燕麥（Avena sativa）和裸粒型燕麥（Avena nuda）兩大類。我國(guó)燕麥栽培以裸粒型為主，占我國(guó)燕麥種植面積的90%以上，常稱為裸燕麥，又稱莜麥。燕麥甜醅是我國(guó)青海高原的民間小吃，廣受漢、回、藏、土等多族人民的青睞。它以莜麥為原料，經(jīng)甜酒曲長(zhǎng)期發(fā)酵 而成，醅粒如果肉，醅汁似糖水，吃起來(lái)帶有甘甜和醇酒的香味。

燕麥作為一種全價(jià)營(yíng)養(yǎng)谷物，富含平衡全面的必需氨基酸、礦物質(zhì)、維生素及膳食纖維，其中含有的活性多糖（β-葡聚糖）、亞油酸和生物活性成分（皂苷）具有保健作用［1］。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在燕麥的功能特性、保健功能等方面開(kāi)展的研究日益增多，燕麥產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到關(guān)注［2-4］。胡博涵等［5］報(bào)道采用糖化菌和啤酒酵母菌對(duì)燕麥進(jìn)行發(fā)酵，可以釀造低酒精谷物發(fā)酵飲料。葛磊等［6］報(bào)道以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為菌種發(fā)酵劑生產(chǎn)燕麥發(fā)酵乳，不僅可提高必需氨基酸含量，降低植酸含量，還能夠增加發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)的種類，使產(chǎn)品具有良好的風(fēng)味和保健功能。但以固態(tài)燕麥為研究對(duì)象對(duì)其發(fā)酵工藝及發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)化學(xué)成分變化的研究?jī)H見(jiàn)一些零星報(bào)道。周小莉［7］優(yōu)化了麥芽水解燕麥基質(zhì)的工藝，確定了乳酸菌發(fā)酵燕麥水解燕麥糊基質(zhì)開(kāi)發(fā)合生元谷物發(fā)酵食品的可行性。張慶等［8］則是研究了植物乳桿菌發(fā)酵燕麥酸面團(tuán)過(guò)程中燕麥蛋白的溶解度和體外消化率、氨基酸組成和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的變化情況，證實(shí)了通過(guò)發(fā)酵可以顯著提高燕麥蛋白的溶解度和體外消化率。本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)燕麥甜醅的發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，研究了真菌固態(tài)發(fā)酵燕麥的相關(guān)情況，并圍繞發(fā)酵過(guò)程中燕麥營(yíng)養(yǎng)成分及微生物代謝產(chǎn)物的變化進(jìn)行說(shuō)明，為燕麥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)和相關(guān)功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

燕麥仁，購(gòu)于安徽燕之坊有限責(zé)任公司；甜酒曲安琪酵母股份有限公司。

正戊烷（優(yōu)級(jí)純） 沃凱試劑有限公司；甲醇（色譜純） 南京試劑有限公司；麥角固醇 （色譜純）美國(guó)Aladdin公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

722S型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；64RL高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；PB-20型pH計(jì) 德國(guó)Sartarius公司；Mini-Protean型電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；UVP GDS-8000型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；Powerdry LL3000型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Heto公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司；LHS-150SC恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司。

1.3方法

1.3.1燕麥發(fā)酵工藝流程［9-12］

精選燕麥→浸泡→排出水分→煮燕麥→瀝干冷卻→裝于容器→接種→保鮮膜封口，戳孔→發(fā)酵

1.3.2發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)測(cè)定

pH值的測(cè)定［13］：10 g搗碎的樣品加入100 mL無(wú)CO2蒸餾水，邊浸泡邊搖動(dòng)15 min，過(guò)濾，取濾液用酸度 計(jì)直接測(cè)定。

總酸含量的測(cè)定［13］：采用滴定法，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定?？偹岷慷x為1 g樣品所含酸的百分含量，以乳酸計(jì)。

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定［13］：甲醛滴定法。

還原糖含量的測(cè)定［14］：3，5-二硝基水楊酸比色 法。

1.3.3發(fā)酵過(guò)程中麥角固醇含量測(cè)定［15］

精確稱取10 g燕麥樣品，將其轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入37.5 mL甲醇，25 mL 95%乙醇和5 g氫氧化鉀。在100 ℃水浴中加熱15 min后，加入適量蒸餾水，取上清液用正戊烷萃取，重復(fù)操作2 次。收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（30 ℃，100 r/min，1 min），溶于0.5 mL甲醇中。高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）條件為，分析柱：C18色譜柱 （12.5 mm×4.6 mm，5 ?m）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：100%甲醇；流速：1.5 mL/min；檢測(cè)器：可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm。

1.3.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）法檢測(cè)燕麥蛋白［16-17］

準(zhǔn)確稱取樣品凍干粉40 mg，加入0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.8緩沖液，振蕩1 h后離心 （12 000 ×g，20 min，5 ℃）。將蛋白質(zhì)提取液與2×上樣緩沖液1∶1（V/V）混勻，并在100 ℃沸水浴中保溫3～5 min，取出待用。SDS-PAGE的濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為4%，分離膠體積分?jǐn)?shù)為15%。電泳時(shí)，先將電壓調(diào)至60 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓使之恒定在120 V，直至溴酚藍(lán)移至離底部約0.5 cm時(shí)，切斷電源，停止電泳。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)變化

2.1.1發(fā)酵產(chǎn)物溫度變化

圖1　燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物溫度的變化Fig.1　Temperature change during fermentation of sweet oat

溫度的變化可以有效且直接地反映發(fā)酵的情況，由圖1可知，發(fā)酵最初，燕麥甜醅的中心溫度下降至培養(yǎng)溫度，約30 ℃，之后迅速上升，在發(fā)酵24 h時(shí)達(dá)到最高溫度34.20 ℃，之后呈現(xiàn)平緩下降的趨勢(shì)，最終穩(wěn)定在33.90 ℃。發(fā)酵前期的降溫與淀粉降解速率慢有著很大關(guān)系，由于燕麥種皮較厚，微生物較難將其中的淀粉利用；之后甜醅的品溫提高，說(shuō)明微生物的生長(zhǎng)代謝進(jìn)入旺盛期，大量產(chǎn)熱，逐漸進(jìn)入酒精發(fā)酵階段；在發(fā)酵48 h后，溫度的變化逐漸趨于穩(wěn)定，可能是由于微生物的活動(dòng)進(jìn)入穩(wěn)定期所致。

2.1.2pH值變化

圖2　燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化Fig.2　Cha nge in pH of sweet fermented oat during fermentation

燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中的pH值與微生物繁殖和代謝產(chǎn)物的積累有密切關(guān)系，是微生物在特定環(huán)境下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，能夠判斷酒精發(fā)酵是否正常。由圖2可知，甜酒藥發(fā)酵后的燕麥，其pH值在0～36 h期間持續(xù)顯著下降（P＜0.05），降低到4.67。之后pH值降低緩慢，在36～48 h期間下降不顯著，這可能是由于發(fā)酵后期糖類物質(zhì)供應(yīng)不足，使生成的部分碳源被微生物利用所導(dǎo)致的結(jié)果。

2.1.3總酸含量變化

圖3　燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Fig.3　Change in total acidity of sweet fermented oat during fermentation

由圖3可知，0～48 h燕麥甜醅發(fā)酵產(chǎn)生的總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升（P＜0.05），之后上升緩慢，最終達(dá)到0.74%。總酸含量的變化趨勢(shì)與pH值的下降呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），說(shuō)明該發(fā)酵產(chǎn)生的酸種類較少，酸性較強(qiáng)，有利于對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的控制［18］。由于本實(shí)驗(yàn)研究所用甜酒曲的主要成分為米根霉，因此，發(fā)酵過(guò)程中pH值、總酸的變化與米根霉分解燕麥中淀粉，利用碳源從而大量產(chǎn)酸有著密切關(guān)系［19］。

2.1.4還原糖和氨基酸態(tài)氮含量變化

圖4　燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中還原糖和氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.4　Changes in reducing sugar content and ammonium nitrogen content of sweet fermented oat during fermentation

還原糖作為微生物可直接利用的碳源，在發(fā)酵過(guò)程中的含量變化會(huì)直接影響微生物的生長(zhǎng)情況，反映不同微生物相互作用的協(xié)調(diào)程度。由圖4可知，在0～36 h內(nèi)，由于甜酒曲中的霉菌分泌大量糖化酶，還原糖含量明顯增加（P＜0.05），最大值可達(dá)41.17 g/100 g。36 h后糖化酶活力則逐漸降低，還原糖被利用于酒精發(fā)酵，含量則隨之顯著下降（P＜0.05）。發(fā)酵過(guò)程中較高的還原糖含量不僅增加了燕麥甜醅的甘甜口感，而且有利于延長(zhǎng)甜醅的貯藏時(shí)間［20］。

氨基酸態(tài)氮的含量變化與還原糖含量變化呈相同趨勢(shì)，總體先升高再下降。在0～24 h期間，氨基酸態(tài)氮含量顯著提高（P＜0.05），直至36 h達(dá)到最大值0.06%，之后則顯著下降（P＜0.05），最小值為0.01%。由于前期燕麥的煮沸處理增加了蛋白的溶解度，在發(fā)酵過(guò)程中微生物才能夠更有效地利用燕麥蛋白，分解產(chǎn)生自身生長(zhǎng)所需的小分子氮源。與此同時(shí)，發(fā)酵使得蛋白質(zhì)水解，氨基酸態(tài)氮含量增加，多種營(yíng)養(yǎng)全面的氨基酸有效成分生成，極大提高了人體對(duì)谷物蛋白的利用率［21-22］。此外，不同呈味氨基酸的產(chǎn)生與相互協(xié)調(diào)也對(duì)燕麥甜醅風(fēng)味的形成發(fā)揮著重要作用［23］。

2.2發(fā)酵過(guò)程中麥角固醇含量變化

麥角固醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分，其含量變化可以一定程度上反映甜酒曲中微生物的生長(zhǎng)情況。如圖5所示，圖譜A和圖譜B分別表示了麥角固醇標(biāo)品和樣品的出峰情況，虛線處的保留時(shí)間為7.88 min，并且該處的峰面積隨著標(biāo)品質(zhì)量濃度的升高表現(xiàn)出良好的線性增加趨勢(shì)。由此可知，麥角固醇在HPLC圖中的出峰時(shí)間為7.88 min，處理樣品圖譜時(shí)可針對(duì)該處的峰進(jìn)行分析。

由圖6可知，燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的麥角固醇在0～72 h顯著增加（P＜0.05），最終在72 h達(dá)到最大值213.64 ?g/g。作為真菌細(xì)胞膜的重要組分，麥角固醇在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜的流動(dòng)性、細(xì)胞活力及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔茫浜康某掷m(xù)增加說(shuō)明了甜酒曲中真菌在燕麥中的生長(zhǎng)情況良好。此外，麥角固醇也是VD2的前體物質(zhì)，為人體對(duì)鈣磷的吸收利用發(fā)揮著重要作用［24］。

圖5　麥角固醇高效液相色譜圖Fig.5　HPLC chromatogram of ergosterol standard and ergosterol from sweet fermented oat

圖6　燕麥甜醅發(fā)酵過(guò)程中麥角固醇含量的變化Fig.6　Change in ergosterol content of sweet fermented oat during fermentation

2.3發(fā)酵過(guò)程中燕麥蛋白水解情況

圖7　發(fā)酵過(guò)程中燕麥蛋白的SDS-PAGE圖Fig.7　SDS-PAGE patterns of oat proteins from sweet fermented oat during fermentation

由圖7可知，煮熟后的燕麥蛋白在發(fā)酵0 h時(shí)的分子質(zhì)量主要分布在12～40 kD，共有7 條可見(jiàn)條帶，分別為條帶a（35.08 kD）、條帶b（33.52 kD）、條帶c（32.75 kD）、條帶d（31.89 kD）、條帶e（29.59 kD）、條帶f（23.78 kD）和條帶g（22.42 kD），并且根據(jù)相關(guān)報(bào)道可推測(cè)［25-26］，條帶d和條帶g分別為燕麥的12S球蛋白降解而成的α蛋白多肽亞基和β蛋白多肽亞基。除此之外，在分子質(zhì)量為50～60 kD處也存在少量的燕麥蛋白條帶。

表1　發(fā)酵過(guò)程中燕麥蛋白的降解情況Table1　Degradation of oat proteins during fermentation

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不同的燕麥蛋白的條帶變化情況均有所不同，被水解的蛋白主要集中在區(qū)域Ⅰ，由水解產(chǎn)生的小分子蛋白則集中在區(qū)域Ⅱ和區(qū)域Ⅲ，其中區(qū)域Ⅱ中的蛋白亞基主要是由分子質(zhì)量大于120 kD的蛋白降解而成的。由QuantityOne 4.62軟件分析得表1。通過(guò)比較，條帶a、b、c、d在0～48 h降解明顯，通過(guò)計(jì)算，最高降解率為70.31%，48～72 h期間則無(wú)明顯變化；條帶f在較長(zhǎng)時(shí)間不斷被降解，直至60 h達(dá)到穩(wěn)定，最終降解率為39.37%。另一方面，條帶d處的蛋白含量在0～24 h快速增加，之后逐漸減少；條帶g處的蛋白含量則是先不斷上升，在48 h時(shí)生成率達(dá)到最大值58.27%后略有減少；對(duì)于條帶e處的蛋白，其含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，增加最快，增幅最大，平均增長(zhǎng)率可達(dá)451.56%。根據(jù)上述分析，燕麥蛋白在燕麥甜醅生產(chǎn)過(guò)程中總體表現(xiàn)出前期大量水解，后期大量生成；大分子蛋白逐漸減少，小分子蛋白逐漸產(chǎn)生的情況。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)甜酒曲發(fā)酵燕麥過(guò)程中理化成分的動(dòng)態(tài)變化、微生物代謝生成麥角固醇的含量變化以及發(fā)酵過(guò)程中燕麥蛋白水解情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明在燕麥甜醅的制作過(guò)程中，燕麥的pH值明顯下降，利于抑制發(fā)酵過(guò)程中腐敗菌的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品的安全性；氨基酸態(tài)氮和還原糖在發(fā)酵前期的快速增加，說(shuō)明甜酒曲中微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中將許多大分子物質(zhì)有效分解為易被吸收利用的小分子物質(zhì)，為后期發(fā)酵提供了天然且充足的氮源及碳源。發(fā)酵至36～48 h，微生物對(duì)燕麥中蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的利用程度達(dá)到最大，發(fā)酵基本徹底；同時(shí)，燕麥甜醅的酸甜口感和風(fēng)味物質(zhì)也在該階段大量產(chǎn)生，這對(duì)于燕麥甜醅在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵終點(diǎn)的確定提供了理論依據(jù)。麥角固醇含量在0～72 h持續(xù)增加，反映了甜酒曲中真菌能夠以燕麥為載體，持續(xù)快速生長(zhǎng)，也說(shuō)明了麥角固醇生物合成新途徑和相關(guān)燕麥功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有可能性。最后通過(guò)SDS-PAGE分析，從燕麥蛋白亞基的水平上解釋了甜酒曲中微生物對(duì)不同分子質(zhì)量的燕麥蛋白的降解情況，結(jié)果表明，大分子燕麥蛋白在前期水解較為明顯，而在24～72 h則表現(xiàn)為小分子燕麥蛋白的明顯增加。在此基礎(chǔ)上，方便進(jìn)一步探究燕麥蛋白被微生物降解后所生成的小分子肽的生物活性，為開(kāi)發(fā)燕麥生物活性產(chǎn)品提供了新思路。

本實(shí)驗(yàn)所研究的燕麥甜醅是基于燕麥在真菌作用下的固態(tài)發(fā)酵，整個(gè)過(guò)程較為緩慢，周期較長(zhǎng)，因此，在后續(xù)的研究中可以進(jìn)一步討論提高燕麥固態(tài)發(fā)酵速率的方法。對(duì)燕麥甜醅功能性成分的研究和益生產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)工作也將繼續(xù)展開(kāi)。

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Dynamic Changes in Biochemical Components during Fermentation of Sweet Fermented Oat

WU Han， XIAO Yu， LI Wei， RUI Xin， WANG Dan， XU Xiao， MA Yuxiao， HUANG Lu， DONG Mingsheng*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Tianpei （sweet fermented oat） is a famous local snack in Lanzhou which is traditionally made by fermentation of highland barley and oat for 2 or 3 days. In this paper， during fermentation， physicochemical changes were investigated， and the production of ergosterol and proteolysis were monitored by high performance liquid chromatography （HPLC） an d sodium dodecyl sulfate polyacrylamide-gel electrophoresis （SDS-PAGE）， respectively. Results showed that pH value decreased rapidly and reached the lowest level of 3.90， and total acidity showed a gradual increase to the highest level of 0.74% as the fermentation progressed. The content of ammonium nitrogen increased to the highest value of 0.06% during 24-36 h and then dropped rapidly. Reducing sugar content increased significantly to the highest value of 41.17 g/100 g during the first 36 h and then decreased until the end of fermentation. Continually， the content of ergosterol augmented and reached its final value of 213.64 ?g/g. High-molecular-weight oat proteins were significantly hydrolyzed during fermentation， especially for the protein with a molecular weight of 35.08 kD， which had a mean degradation rate of 55.57%.

sweet fermented oat； traditional culture starter； biochemical components； ergosterol； oat protein

TS210.4

A

1002-6630（2015）13-0114-05

10.7506/spkx1002-6630-201513022

2014-09-22

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD18B01-4）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100903）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201422）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371807）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

吳寒（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：blesscatherine2011@hotmail.com

董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn