朱春花，李云霞，陳蘭明*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上 海 201306）

副溶血性弧菌整合接合元件核心基因表達(dá)對溫度變化的響應(yīng)

朱春花，李云霞，陳蘭明*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上 海 201306）

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法分析在15～42 ℃溫度范圍內(nèi)副溶血性弧菌（Vibrio paraha emolyticus）CHN25整合接合元件（integrative and conjugative elements，ICEs）ICEVpaChn1核心基因表達(dá)對溫度變化的響應(yīng)。結(jié)果表明：溫度介導(dǎo)ICEVpaChn1元件保守模塊核心基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中，編碼進(jìn)入排斥蛋白Eex（entry exclusion）的基因?qū)囟茸兓顬槊舾?，低于或高?7 ℃的溫度條件均強(qiáng)烈抑制eex基因表達(dá)（＞10 倍）。此外，在15～37 ℃范圍內(nèi)，溫度的升高顯著激活編碼整合酶Int（integrase）、接合轉(zhuǎn)移蛋白TraI（transfer protein I）和TraG、DNA修復(fù)蛋白RumA基因的表達(dá)，且在37 ℃達(dá)到最大值；與其他檢測基因明顯不同，溫度升高抑制轉(zhuǎn)錄抑制子SetR基因的表達(dá)，促進(jìn)int等基因轉(zhuǎn)錄激活子SetC和SetD的積累，進(jìn)而刺激切離，促進(jìn)ICEVpaChn1元件的接合轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了環(huán)境溫度對ICEs元件核心基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)低溫（＜15 ℃）和高溫（＞37 ℃）條件均可能阻遏ICEVpaChn1元件及其攜帶基因信息在不同種屬細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移。

副溶血性弧菌；整合接合元件；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；基因表達(dá)

整合接合元件（integrative and conjugative elements，ICEs）是一類具有自主轉(zhuǎn)移活性的可移動(dòng)遺傳性元件，攜帶大量基因信息，介導(dǎo)遺傳物質(zhì)的橫向（水平）基因轉(zhuǎn)移（lateral/horizontal gene transfer，LGT/HGT），在細(xì)菌基因組進(jìn)化和生物多樣性形成中發(fā)揮重要作用［1］。SXT/R391家族ICEs于1992年從印度分離的霍亂弧菌臨床分離菌株（Vibrio cholerae O139）中最初被發(fā)現(xiàn)［2］，攜帶氯霉素、鏈霉素、新諾明和甲氧氨芐嘧啶抗性基因［3］。迄今為止，已在弧菌屬（Vibrio）［4-6］、變形菌屬（Proteus）［7-8］、葡萄球?qū)伲⊿taphylococcus）［9-10］、鏈球菌屬（Streptococcus）［11-12］等革蘭氏陰性（G-）和革蘭氏陽性（G+）細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了該家族ICEs元件，它們均含有3 個(gè)高度保守的功能模塊（modules），包括整合與切離（integration and excision）、接合（conj ugation）和調(diào)控（regulation）模塊［13］。

近年來，有研究報(bào)道顯示，不同的環(huán)境應(yīng)激壓力影響大腸桿菌（Escherichia coli）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）攜帶的ICEs元件的切離轉(zhuǎn)移，例如紫外照射［14］、絲裂霉素C處理［15］、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)RapI（regulator aspartate phosphatase I）蛋白過量表達(dá)［16］等。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-ti me polymerase chain reaction，real-time PCR）方法分析副溶血性弧菌CHN25攜帶的整合接合元件ICEVpaChn1［17］保守功能模塊核心基因?qū)囟茸兓捻憫?yīng)，包括接合轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基因traI（transfer protein I）和traG、整合酶基因int（integrase）、整合接合調(diào)控蛋白基因setR、進(jìn)入排斥相關(guān)蛋白基因eex（entry ex clusion）和DNA修復(fù)蛋白基因rumA，以探索ICEs元件的環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1菌株與試劑

副溶血性弧菌CHN25菌株由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院陳蘭明教授實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存［17］。

FastStart Universal SYBR Green Master 瑞士Roche公司；Trizol試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real time） 日本TaKaRa公司；LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

小型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；BioTek Synergy? 2多模塊微板讀數(shù)儀 美國BioTek公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3副溶血性弧菌總RNA提取和cDNA合成

挑取在LB瓊脂平板（pH 8.0～8.5、3% NaCl）上生長良好的副溶血性弧菌單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，分別于15、20、25、30、37、42 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)。采用多模塊微板讀數(shù)儀測定副溶血性弧菌的生長曲線。分別收集不同培養(yǎng)溫度條件下對數(shù)生長中期的菌液1 mL，4 ℃、12 000×g離心5 min，棄上清液，收集菌體沉淀。根據(jù)Trizol試劑盒說明書的操作步驟，提取菌體總RNA，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real time）試劑盒去除RNA樣品中的基因組DNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。

1.4ICEs保守模塊核心基因的引物設(shè)計(jì)與合成

采用Primer 5軟件（http：//www.PremierBiosoft.com），基于霍亂弧菌SXT元件DNA序列（GenBank登錄號：AY055428.1）設(shè)計(jì)int、setR、traI、eex和rumA基因的引物，traG基因的引物序列設(shè)計(jì)參考Song Yuze等［17］的研究。寡核苷酸引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1　寡核苷酸引物堿基序列Table1　Oligonucleotide primers used in this study

1.5Real-time PCR反應(yīng)體系及其優(yōu)化

Real-time PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包括10 μL SYBR Green、1.5 μL上游/下游引物、2 μL cDNA、5 μL無菌水。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 次循環(huán)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀完成Real-time PCR反應(yīng)。

根據(jù)趙玉華等［18］的報(bào)道，分別對Real-time PCR反應(yīng)體系中的引物濃度和cDNA模板量進(jìn)行優(yōu)化，其中上游和下游引物終濃度分別設(shè)計(jì)為0.4、0.6、0.8 μmol/L，模板量分別設(shè)計(jì)為每20 μL體系添加1 000、200、20、2、0.2 ng。選擇pvuA和pvsA基因作為Real-time PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因［19］。

1.6熔解曲線分析

鑒于SYBR Green可以結(jié)合所有雙鏈DNA，因此引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)及錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)均會(huì)增加熒光值，進(jìn)而影響Real-time PCR反應(yīng)中基因表達(dá)量檢測的準(zhǔn)確性。通過熔解曲線（melting curves）分析產(chǎn)物的均一性，有助于提高SYBR Green法獲得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性［20］。熔解曲線的設(shè)置在整個(gè)Real-time PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行，當(dāng)溫度從60 ℃升至95 ℃，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以0.5 ℃/s的速率自動(dòng)收集熒光信號，隨著溫度的升高，雙鏈DNA解鏈，熒光信號不斷降低，且在退火溫度時(shí)下降速率最快，用熒光信號值改變的一次導(dǎo)數(shù)的相反數(shù)與溫度作圖，即得到相應(yīng)的熔解曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)溫度條件下副溶血性弧菌CHN25細(xì)胞總RNA的制備

收集副溶血性弧菌CHN25在15、20、25、30、37、42 ℃培養(yǎng)溫度下生長至對數(shù)生長中期的細(xì)胞，采用Trizol法分別提取菌體總RNA，取2 μL RNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖譜顯示有3 條RNA條帶，分別對應(yīng)于23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA（圖1）。其中，23S rRNA和16S rRNA條帶明亮清晰，23S rRNA條帶的亮度約為16S rRNA條帶的2 倍，表明本研究制備的總RNA樣品完整性好、無降解（圖1）。利用多模塊微板讀數(shù)儀測定總RNA樣品的濃度，結(jié)果顯示均高于800 ng/μL，OD260nm/OD280nm值約為2.0，表明提取的總RNA質(zhì)量較高，符合Real-time PCR反應(yīng)要求。

圖1　不同培養(yǎng)溫度下副溶血性弧菌CHN25總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA isolated from V. parahaemolyticus CHN25 incubated at different temperatures

2.2Real-time PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用終濃度為0.4、0.6、0.8 μmol/L的引物進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物無明顯差異（文中未給出相應(yīng)圖片結(jié)果）。為避免檢測中因引物添加量過少或過多而影響擴(kuò)增效果，故選取Real-time PCR反應(yīng)引物終濃度為0.6 μmol/L。此外，在20 μL反應(yīng)體系中添加1 000、200、20、2、0.2 ng的cDNA模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，當(dāng)模板添加量為20 ng時(shí)，擴(kuò)增效率較高，因此，將待測樣品的RNA質(zhì)量濃度均稀釋為200 ng/μL。

2.3ICEs保守模塊核心基因的Real-time PCR擴(kuò)增

基于2.2節(jié)得到優(yōu)化的Real-time PCR反應(yīng)條件，本研究對15～42 ℃培養(yǎng)條件下的副溶血性弧菌CHN25攜帶的ICEVpaChn1元件核心基因traI、traG、int、setR、eex和rumA分別進(jìn)行了Real-time PCR擴(kuò)增（引物見表1）。如圖2所示，ICEVpaChn1元件各核心基因的擴(kuò)增曲線無非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)明顯的“S”型，且具有較好的重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可靠性和穩(wěn)定性，可用作下一步分析。

圖2　不同培養(yǎng)溫度下ICEVV ppaaChn1元件核心基因Real-ttiimmee PCR擴(kuò)增曲線Fig.2　Amplification plots of real time PCR products derived from ICEVpaChn1 of V. parahaemolyticus CHN25 grown at different temperatures

2.4熔解曲線分析

采用優(yōu)化的Real-time PCR反應(yīng)體系，獲得在15～42 ℃培養(yǎng)溫度下，獲得ICEVpaChn1保守模塊各核心基因rumA、int、eex、setR、traG和traI的熔解曲線。如圖3所示，除空白對照，各核心基因熔解曲線均為單峰型，表明Real-time PCR擴(kuò)增特異性良好，無明顯的引物二聚體和錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為下一步分析的依據(jù)。

圖3　副溶血性弧菌CHN25在不同培養(yǎng)溫度下VICpEaChn1元件核心基因Real-time PCR熔解曲線Fig.3　Melting curves of real-time PCR with core genes of ICEVpaChn1 in V. parahaemolyticus CHN25 grown at different temperatures

2.5ICEs保守模塊核心基因的Real-time PCR分析

圖4　副溶血性弧菌CHN25在不同培養(yǎng)溫度下ICEVV ppaaChn1元件核心基因表達(dá)量Fig.4　Expression of core genes of ICEVpaChn1 in V. parahaemolyticus CHN25 grown at different temperatures

基于上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)檢測副溶血性弧菌CHN25在不同培養(yǎng)溫度下ICEVpaChn1元件保守模塊核心基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示。鑒于副溶血性弧菌最適生長溫度為37 ℃，故數(shù)據(jù)分析時(shí)將該條件下的基因表達(dá)量設(shè)為1（作為對照）。結(jié)果顯示，副溶血性弧菌在37 ℃條件下，ICEVpaChn1元件的int和traI基因的表達(dá)水平均達(dá)到最大值，而處于＜15 ℃和＞42 ℃培養(yǎng)條件下則被強(qiáng)烈抑制。int基因編碼整合與切離模塊必需的整合酶，而traI基因編碼的單鏈釋放因子，在接合轉(zhuǎn)移模塊接合轉(zhuǎn)移初期催化SXT元件斷裂形成單鏈DNA［21］。本研究結(jié)果表明，在15～37 ℃條件下，溫度的升高很可能促進(jìn)ICEVpaChn1元件接合轉(zhuǎn)移。SXT/R391家族的進(jìn)入排斥系統(tǒng)能夠特異性阻止同一類型基因元件在細(xì)菌間重復(fù)傳遞［1］。研究發(fā)現(xiàn)，雖然SXT和R391擁有幾乎相同的接合轉(zhuǎn)移基因，但它們之間并不相互排斥，這歸因于eex和traG基因編碼的介導(dǎo)R/S進(jìn)入排斥系統(tǒng)的蛋白Eex和TraG［22］。在副溶血性弧菌CHN25中，Eex和TraG介導(dǎo)ICEVpaChn1元件的R型進(jìn)入排斥系統(tǒng)，eex基因表達(dá)水平在低于或高于37 ℃條件下均顯著下降10 倍以上，而在20～37 ℃條件下，traG基因表達(dá)水平僅少許被抑制（＜2.5 倍），表明表達(dá)于供體菌中的Eex對溫度變化的響應(yīng)更為敏感，推測有利于ICEs的進(jìn)入，相關(guān)分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。rumA和rumB基因與大腸桿菌（Escherichia coli）的umuDC基因在系統(tǒng)發(fā)育上具有同源性，在損傷或誘變所致的突變DNA修復(fù)中發(fā)揮作用［23］。研究表明，一些ICEs的rumAB基因簇還是抗菌素抗性基因的插入熱點(diǎn)［24］。可是，Song Yuze等［17］研究發(fā)現(xiàn)ICEVpaChn1元件rumAB基因簇完整，其間并無插入序列。本研究結(jié)果顯示，＜25 ℃或＞42 ℃的溫度條件顯著抑制rumA基因的表達(dá)，提示不利的生長溫度并未啟動(dòng)rumA的DNA損傷修復(fù)功能，推測它在ICEVpaChn1中可能有未知的生物學(xué)功能。此外，setR基因編碼的轉(zhuǎn)錄抑制子SetR能夠抑制int等基因轉(zhuǎn)錄激活子setC和setD的表達(dá)，從而抑制接合轉(zhuǎn)移過程，使SXT在細(xì)菌內(nèi)呈現(xiàn)不活化狀態(tài)［24］。本研究結(jié)果顯示，與其他檢測基因明顯不同，setR基因表達(dá)隨溫度的升高而降低，從而激活setC和setD基因以啟動(dòng)int和tra基因的表達(dá)，刺激切離，促進(jìn)ICEVpaChn1元件在不同宿主菌間水平橫向傳播［14，25］。

3　結(jié) 論

獲得高質(zhì)量的RNA是應(yīng)用Real-time PCR方法檢測不同培養(yǎng)溫度下ICEVpaChn1元件核心基因表達(dá)的關(guān)鍵之一，本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合該菌株自身特性，采用Trizol法提取菌體總RNA并獲得了完整、無明顯降解的RNA樣品。另外，運(yùn)用SYBR Green法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，熒光染料SYBR Green與雙鏈DNA微槽結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度增加100 倍，有效地提高了檢測的靈敏度。同時(shí)，所需設(shè)計(jì)的引物較簡單，成本較低。此外，為了精確測定ICEVpaChn1元件核心基因的表達(dá)量，本研究對Real-time PCR反應(yīng)體系的引物濃度和cDNA模板添加量分別進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)體系；每組Real-time PCR反應(yīng)均設(shè)置空白對照，避免假陽性結(jié)果；并根據(jù)Real-time PCR反應(yīng)獲得的熔解曲線進(jìn)行反應(yīng)體系特異性評定。

基于優(yōu)化的Real-time PCR反應(yīng)體系，本實(shí)驗(yàn)研究了不同溫度對ICEs保守模塊核心基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，低于或高于37℃的溫度應(yīng)激條件很可能阻遏ICEVpaChn1元件及其攜帶基因信息在不同種屬細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移，為進(jìn)一步探討可移動(dòng)遺傳元件的環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Temperature on the Expression of Core Genes of Integrative and Conjugative Elements in Vibrio parahaemolyticus

ZHU Chunhua， LI Yunxia， CHEN Lanming*
（College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

In this study， for the first time， we investigated the effect of temperature （15-42 ℃） on the expression of core genes of the integrative and conjugative element （ICE， ICEVpaChn1） in Vibrio parahaemolyticus CHN25 using real time polymerase chain reaction （real-time PCR）. The results revealed distinct expression patterns of the tested genes. The eex gene involved in the entry exclusion system was strongly inhibited by m ore than 10 folds when the bacterium was incubated at the temperatures below or above 37 ℃. Along with increasi ng temperature in the range of 15-37 ℃， the expression of int， traI， rumA， and traG genes was enhanced， and reached the highest level at 37 ℃ as the optimal growth temperature for V. parahaemolyticus CHN25. In contrast， increasing temperature could significantly repress the expression of the gene encoding a repress or protein SetR that can stimulate the activators of the int gene （SetC and SetD） and promote the conjugation and transfer of ICEVpaChn1. In addition， self-transmissible activity of the ICE was likely inhibited when the bacterium was grown at temperatures lower than 15 ℃ or above 37 ℃. The results of this study will facilitate better understanding of the molecular mechanism underlying the effects of environment stresses on the conjugative transfer of ICEs.

Vibr io parahaemolyticus； integrative and conjugative elements； real-time polymerase chain reaction； gene expression

Q933

A

1002-6630（2015）13-0101-06

10.7506/spkx1002-6630-201513020

2015-02-11

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271830）

朱春花（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：m120250549@st.shou.edu.cn

陳蘭明（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：lmchen@shou.edu.cn