孫鳳嬌，賀　羽，陳蘭明*

（農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海），上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201 306）

攜帶SXT/R391家族整合接合元件多重耐藥菌株的高效篩選與分析

孫鳳嬌，賀羽，陳蘭明*

（農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海），上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201 306）

本研究建立了一種抗生素平板與分子檢測(cè)相結(jié)合的高效篩選水產(chǎn)品中攜帶SXT/R391家族整合接合元件（integrative and conjugative elements，ICEs）的多重耐藥菌株的方法。采用美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所標(biāo)準(zhǔn)Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法、需氧菌液體微量稀釋法，以及接合實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選、鑒定獲得的攜帶SXT/R391家族ICEs的變形桿菌（Proteus vulgaris）進(jìn)行了抗菌素、重金屬抗性以及ICEs元件接合轉(zhuǎn)移活性的分析。結(jié)果表明：運(yùn)用本研究建立的篩選法可有效獲得含有多重耐藥基因的ICEs元件，其檢出率為3%，遠(yuǎn)高于常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的檢測(cè)水平（＜1‰）。受試菌株對(duì)六大類10 種抗菌素均表現(xiàn)出抗性，并且對(duì)重金屬鎘、銅、鋅和汞具有高度耐受性。接合實(shí)驗(yàn)證明了受試菌株所攜帶的ICEs元件在普通變形桿菌與大腸桿菌（Escherichia coli）MG1655之間的自我轉(zhuǎn)移活性。

整合接合元件；SXT/R391家族；多重耐藥；重金屬抗性

自2002年以來，我國(guó)已成為世界第一大水產(chǎn)品生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)［1-2］。可是，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高密度、集約化、規(guī)?；目焖侔l(fā)展，細(xì)菌性病害的發(fā)生更為頻繁，給中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］。目前，化學(xué)藥物防治仍然是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害控制的主要措施之一，然而抗生素的過量使用現(xiàn)象較為普遍，導(dǎo)致抗性致病菌甚至“超級(jí)細(xì)菌”的形成；同時(shí)，藥物殘留造成的環(huán)境污染也加速了多藥抗性（multip le drug resistance，MDR）基因的傳播和擴(kuò)散［2-6］。

原核生物的可移動(dòng)遺傳元件（mobile geneticelement，MGEs）通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式介導(dǎo)遺傳物質(zhì)在不同種屬細(xì)菌間的橫向（水平）基因轉(zhuǎn)移（lateral/horizontal gene transfer，LGT/HGT）［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶抗性基因簇的SXT/R391家族的可移動(dòng)遺傳性整合接合元件（integrative and conjugative elements，ICEs）與抗藥性的散播高度相關(guān)。ICEs元件最初發(fā)現(xiàn)于1992年導(dǎo)致印度和孟加拉霍亂爆發(fā)的致病性霍亂弧菌（Vibrio cholera）MO10臨床分離株中，該菌株攜帶的99.5 kb SXT元件含有編碼磺胺甲基異噁唑（sulfamethoxazole，Su）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim，Tm）、鏈霉素（streptomycin，Sm）和氯霉素（chloramphenicol，Cm）的抗性基因［6-7］。此后，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，SXT/R391家族ICEs元件不僅存在于弧菌屬（Vibrio）細(xì)菌中，而且還在超過25 個(gè)種屬的細(xì)菌中被檢測(cè)和鑒定，例如變形菌屬（Proteus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）等［8-12］，它們廣泛存在于水產(chǎn)品、養(yǎng)殖水體等環(huán)境水體中［13-14］。作為MDR基因的載體，環(huán)境中ICEs元件及其散播的分子機(jī)制已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［15-16］。生物信息學(xué)的方法也已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌ICEs的研究，ICEs數(shù)據(jù)庫(kù)ICEberg（http：//db-mml.sjtu.edu.cn/ ICEberg/）通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和文獻(xiàn)挖掘，已系統(tǒng)地識(shí)別了上百個(gè)細(xì)菌中400多個(gè)ICEs，包括89 個(gè)SXT/R391家族的ICEs。但是目前所發(fā)現(xiàn)的ICEs僅如冰山一角，未來必將在越來越多隸屬于不同種屬的原核生物中發(fā)現(xiàn)SXT/R391家族ICEs的存在［17］。

本研究課題組在國(guó)內(nèi)率先開展了水產(chǎn)品、養(yǎng)殖水體、環(huán)境淡水和海水中攜帶ICEs元件弧菌的大量研究工作。本實(shí)驗(yàn)研究一種抗性平板與分子檢測(cè)相結(jié)合的高效篩選攜帶MDR基因SXT/R391家族ICEs元件的方法；并對(duì)本研究所獲目的菌株進(jìn)行了藥物敏感性、重金屬耐受性以及ICEs元件自主傳遞活性的測(cè)定，為MDR超級(jí)細(xì)菌形成的分子機(jī)制以及水產(chǎn)食品安全的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

水產(chǎn)品樣品采集于上海恒大水產(chǎn)市場(chǎng)和上海蘆潮港水產(chǎn)市場(chǎng)。

MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Premix Ex Taq DNA聚合酶 大連寶生物工程有限公司；慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基、堿性蛋白胨水（alkaline peptone water，APW）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB）、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（thiosulfate citrate bile salts sucrose，TCBS） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Mueller-Hinton Broth（MHB）培養(yǎng)基以及抗生素試紙片，包括氨芐西林（ampicillin，AMP，10 μg）、鏈霉素（streptomycin，STR，10 μg）、氯霉素（chloramphenicol，CHL，30 μg）、卡那霉素（kanamycin，KAN，30 μg）、復(fù)方新諾明（trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT，25 μg）、四環(huán)素（tetracycline，TET，30 μg）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim，TMP，5 μg）、利福平（rifampin，RIF，5 μg）、慶大霉素（gentamicin，GEN，10 μg）、壯觀霉素（spectinomycin，SPE，100 μg） 英國(guó)Oxoid公司；重金屬BaCl2、PbCl2、ZnCl2、CrCl3、CdCl2、NiCl2、CuCl2、HgCl2上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Eppendorf 6325 PCR儀、Eppendorf 5424高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀、Bio-Rad CHEF Mapper XA System凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；拍擊式均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司；多功能酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司；MilliQ純化柱純水儀 法國(guó)Millipore公司。

1.2樣品制備

參考Loi-Braden等［18］的方法富集樣品中的細(xì)菌，根據(jù)美國(guó)食品藥品管理局的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)（the Standard of the Bacteriological Analytical Manual（BAM）of U.S. Food and Drug Administration，8th Edition Revision A，1998）分離樣品中的細(xì)菌。步驟如下：無菌操作將25 g水產(chǎn)品樣品置于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL的APW（3 g/100 mL NaCl），用拍擊式均質(zhì)器拍打3 min成為勻漿。將勻漿倒入250 mL無菌離心瓶中，380×g離心5 min。收集上清液于50 mL無菌離心管中，5 000×g離心7 min，棄上清后將沉淀重懸浮于5 mL APW中為菌體原液，并用APW梯度稀釋5～25 倍后，各吸取原液與稀釋液100 ?L涂布于慶大霉素平板和TCBS平板上，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.3SXT/R391家族ICEs元件保守核心基因的檢測(cè)

挑取上述平板上生長(zhǎng)良好的單菌落，接種在含200 ?L APW（3 g/100 mL NaCl）的96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)16～18 h。吸取10 ?L菌液至200 ?L的超純水中，95 ℃熱裂解15 min。吸取1 ?L裂解液為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，擴(kuò)增SXT/R391家族ICEs元件的保守功能模塊相關(guān)核心基因，包括整合酶基因（int）、ICEs調(diào)控蛋白基因（setR）、接合轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基因（traC、traI），以及SXT/R391家族ICEs元件攜帶的典型鏈霉素（strA、strB），甲氧芐氨嘧啶（dfrA1、dfr18），磺胺甲基異噁唑（sul2）抗性基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件參考Song Yuze等［15］的方法，PCR反應(yīng)引物以及相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。寡核苷酸引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的菌株，通過16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和DNA序列的測(cè)定進(jìn)行鑒定。

表1　寡核苷酸引物及其序列Table1　The oligonucleotides used in this study

1.4抗菌素平板-PCR結(jié)合篩選法

收集上述慶大霉素平板或TCBS平板上生長(zhǎng)的菌體，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）［22］重懸菌體，系列梯度稀釋后，涂布于LB選擇性平板（含256 ?g/mL磺胺甲基異噁唑，128 ?g/mL鏈霉素）或LB選擇性平板（含128 ?g/mL磺胺甲基異噁唑，64 ?g/mL鏈霉素）上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取選擇性平板上生長(zhǎng)良好的單菌落，按照上述菌液PCR法，檢測(cè)受試菌的ICEs元件保守核心基因（int、setR、traC、traI）與典型耐藥基因（strA、strB、sul2、dfrA1、dfr18）。對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株，進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和DNA序列的測(cè)定與鑒定。

1.5抗菌素藥物敏感性和重金屬抗性分析

采用美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2012版）標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法（Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests），對(duì)受試菌進(jìn)行六大類10 種抗生素的藥物敏感性測(cè)試。質(zhì)控菌大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC2785購(gòu)自上海工業(yè)微生物研究所。參考美國(guó)CLSI的需氧菌液體微量稀釋法，對(duì)受試菌株進(jìn)行重金屬（BaCl2、PbCl2、 ZnCl2、CrCl3、CdCl2、NiCl2、CuCl2、HgCl2）耐受性測(cè)定。進(jìn)行3 次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。

1.6接合實(shí)驗(yàn)

參考Song Yuze［15］、Waldor［23］等的方法，以E. coli MG1655（Cmr、Sms、Sus）為受體菌，本研究分離菌株為供體菌進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)。挑取LB抗性平板（含磺胺甲基異噁唑256 ?g/mL、鏈霉素128 ?g/mL、氯霉素30 ?g/mL）上生長(zhǎng)的接合子單菌落，提取基因組DNA，檢測(cè)ICEs元件保守核心基因、耐藥基因以及16S rDNA。同時(shí)計(jì)算受試菌接合效率，即形成接合子數(shù)量/供體菌數(shù)量。分別進(jìn)行3 次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1抗菌素平板-PCR結(jié)合篩選法的建立

本研究采用慶大霉素平板與TCBS平板從蝦、貝類水產(chǎn)品中初篩獲得約1 000 株弧菌或變形菌屬分離菌株。采用PCR法檢測(cè)SXT/R391家族ICEs元件耐藥基因與保守功能模塊核心基因，結(jié)果顯示：鏈霉素、磺胺甲基異噁唑、甲氧芐氨嘧啶抗性基因（strA/strB、sul2、dfrA1/dfr18）的檢出率分別約為28%、40%和13%，攜帶2 種或以上抗性基因的菌株檢出率分別約為7%、1%；ICEs元件保守功能模塊核心基因int、setR、traC、traI檢出率分別約為48%、25%、20%和23%，攜帶ICEs元件保守功能模塊核心基因的菌株檢出率約為4%，與Bakhshi等［24］報(bào)道的5.4%的篩選率基本一致。但是，在受試菌中未篩選到ICEs元件可變區(qū)Ⅲ插入MDR基因簇的菌株。

Song Yuze［15］和唐毓祎［25］等的研究也表明僅采用傳統(tǒng)PCR技術(shù)獲得攜帶MDR基因的ICEs元件的環(huán)境分離菌株篩選率極低（＜1‰）。因此，本研究在初篩基礎(chǔ)上，增加了氯霉素、鏈霉素、磺胺甲基異噁唑抗性平板篩選步驟，對(duì)獲得的200 株陽(yáng)性分離菌株進(jìn)行了ICEs元件核心基因與典型耐藥基因簇的檢測(cè)，結(jié)果顯示：int、setR基因檢出率分別為43%和27%，但是，int和setR基因同時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株，經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)為攜帶SXT/R391家族ICEs元件且含有MDR抗性基因菌株的篩選率高達(dá)3%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)PCR技術(shù)的篩選率（＜ 1‰）。

2.2“多重耐藥菌”抗菌素藥物敏感性及重金屬耐受性的分析

本研究對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性菌株中的5 株分別進(jìn)行了16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定。BLASTn比對(duì)分析結(jié)果顯示，它們與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)［26］（http：//rdp.cme.msu. edu/）中普通變形桿菌（Proteus vulgaris）16S rRNA基因序列相似性為99%?？股厮幬锩舾行苑治鼋Y(jié)果顯示：受試菌株對(duì)8 種抗生素均表現(xiàn)出抗性，包括氨芐西林、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素、新諾明、甲氧芐氨嘧啶、利福平和壯觀霉素，對(duì)慶大霉素與四環(huán)素表現(xiàn)為中介。其中，鏈霉素、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲基異噁唑和氯霉素的抗性為SXT/R391家族ICEs元件攜帶菌株具有的典型MDR表型。此外，本研究對(duì)獲得的“多重耐藥菌”還進(jìn)行了8 種環(huán)境常見重金屬的敏感性測(cè)定，結(jié)果如表2所示。受試菌株對(duì)重金屬鋅（≥3 200 μg/mL）、銅（≥3 200 μg/mL）、鎘（≥3 200 μg/mL）和汞（≥25 μg/mL）表現(xiàn)出高度抗性。

表2　攜帶SXT/R391家族ICEs元件變形桿菌分離菌株重金屬與抗菌素的耐受性Table2　Susceptibility off Proteus vulgaris isolates harboring SXT/R391 family of ICEs to heavy metals and antimicrobial agents

2.3變形桿菌分離菌株攜帶的ICEs元件的接合轉(zhuǎn)移活性

本研究以篩選獲得的攜帶SXT/R391家族ICEs的變形桿菌為供體菌，E. coli MG1655作為受體菌進(jìn)行了接合實(shí)驗(yàn)，在LB抗性平板上（含256 ?g/mL磺胺甲基異噁唑，128 ?g/mL鏈霉素，30 ?g/mL氯霉素）獲得了E. coli MG1655接合子。PCR檢測(cè)接合子的ICEs元件核心基因（int、setR、traC、traI）以及典型耐藥基因簇（strA、strB、sul2）均呈陽(yáng)性反應(yīng)；并且通過接合子的16S rDNA序列測(cè)定鑒定，證明了本研究發(fā)現(xiàn)的SXT/R391家族ICEs元件（命名為ICEPvuChn1～I(xiàn)CEPvuChn5）在變形桿菌與大腸桿菌之間自主的接合轉(zhuǎn)移活性，介導(dǎo)MDR基因在不同屬細(xì)菌間的傳播。它們的自主傳遞頻率如表3所示，其中ICEPvuChn3的自主接合轉(zhuǎn)移效率最高，為6.61×10-4。

表3　普通變形桿菌攜帶的SXT/R391家族ICEs元件自主傳遞頻率的比較Table3　Self-transmissible activity of SXT/R391 family of ICEs derived from from Proteus vulgaris aris isolates ates

3　討 論

ICEs元件兼具轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和噬菌體的特性，既可以在染色體上跳躍，從宿主染色體上切離、整合并隨染色體一起復(fù)制，也可以接合形式在細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移［16］。ICEs攜帶大量基因信息，例如，耐藥基因、抗重金屬基因、烴類化合物降解基因等，使得宿主對(duì)環(huán)境脅迫獲得適應(yīng)性［8-9］。SXT/R391家族作為ICEs中較具代表性的一類，闡明其耐藥基因散播的分子機(jī)制將對(duì)致病菌防控研究起到重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義［20］。

變形桿菌在自然界中分布廣泛，腐物寄生，屬于條件致病菌。普通變形桿菌可引發(fā)人類腸 道或尿道感染等疾病及水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類疾?。?7］。近年來，涉及變形桿菌屬ICEs元件攜帶菌株的相關(guān)研究大多集中于臨床分離菌株［28］。本研究自水產(chǎn)品中分離、鑒定出攜帶SXT/R391家族ICEs元件的變形桿菌，表現(xiàn)出多重耐藥性和重金屬抗性特性，并且在不同種屬細(xì)菌間具有自主轉(zhuǎn)移活性。細(xì)菌的重金屬耐受性及協(xié)同選擇機(jī)制下的抗生素抗性問題已對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成潛在威脅［29-30］。多重抗性菌株的加快形成和抗性基因的連鎖傳播為致病菌感染性疾病的醫(yī)治帶來了極大的挑戰(zhàn)［4］。本研究建立的高效篩選攜帶ICEs元件多重耐藥菌的方法，為進(jìn)一步探討環(huán)境中重金屬和抗生素逆境應(yīng)答的共選擇機(jī)制以及多重抗性超級(jí)細(xì)菌形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Effective Screening for Multiple-Drug Resistant Bacteria Harboring SXT/R391 Family of Integrative and Conjugative Elements

SUN Fengjiao， HE Yu， CHEN Lanming*
（Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation （Shanghai）， Ministry of Agriculture， College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

In this study， we established a highly effective method to screen multiple-drug resistant （MDR） bacteria carrying the integrative and conjugative elements （ICEs）. Five Proteus vulgaris strains harboring SXT/R391 family of ICEs， isolated from aquatic products in Shanghai， China， were obtained using the new method. Antimicrobial activity and heavy metal susceptibility of the P. vulgaris strains w ere examined using standard Kirby-Bauer disk diffusion method and dilution susceptibility t ests according to the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI， USA， 2012 Edition）， all showing distinct resistance to ten antimicrobial agents belonging to six drug classes tested. In addition， a wide heavy metal resistance profile was also detected， displaying strong resistance to Cd， Cu， Zn and Hg. The conjugation experiments demonstrated the capacities of active self-transmission of the SXT/R391-like ICEs between P. vulgaris and Escherichia coli MG1655 strains. Our results will facilitate further research on collaborative selection mechanism of environmental antibiotics and heavy metals， and early warning in prevalence of novel MDR bacteria or “super bacteria”.

integrative and conjugative elements （ICEs）； SXT/R391 family； multiple-drug resistance； heavy metal tolerance

TS201.3

A

1002-6630（2015）13-0079-05

10.7506/spkx1002-6630-201513016

2015-02-11

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271830）

孫鳳嬌（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：fengjiaosun@foxmail.com

陳蘭明（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制、海洋微生物資源的開發(fā)與利用。E-mail：lmchen@shou.edu.cn