姚秋萍，李　陽，鄧　健

（貴州民族大學化學與環(huán)境科學學院，貴州 貴陽 550025）

硫酸酯化修飾的油菜花粉多糖的抗氧化活性

姚秋萍，李陽，鄧健

（貴州民族大學化學與環(huán)境科學學院，貴州 貴陽 550025）

目的：對油菜花粉多糖進行硫酸酯化，研究體外抗氧化活性。方法：采用濃硫酸法分別在0 ℃和10 ℃條件下對油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP）進行硫酸酯化修飾，并對其清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力進行了研究。結果：酯化得到取代度分別為0.89和1.36的2 個改性產物（S-RPP1和S-RPP2），RPP、S-RPP1和S-RPP2表現出不同程度的抗氧化活性。總的自由基清除能力大小為S-RPP1＞S-RPP2＞RPP。結論：硫酸化修飾能提高油菜花粉多糖的體外抗氧化活性。

油菜花粉多糖；硫酸酯化修飾；抗氧化活性

花粉含有豐富的營養(yǎng)物質，是一種較為新型的食品資源，并且蜜蜂采集的花粉所含的營養(yǎng)素更為豐富［1］，因此，蜂花粉被譽為“最完全的營養(yǎng)食品”、“濃縮的營養(yǎng)庫”［2］。多糖是油菜花粉的主要有效成分之一。藥理研究表明，油菜花粉多糖具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化和抑菌等作用［3-6］。硫酸酯化多糖（sulfated polysachcarides，SPS）是指含有硫酸基團的天然及其半合成的酸性多糖，為聚陰離子化合物。多糖經硫酸酯化的結構修飾后，構象發(fā)生了變化，而構象變化往往是生物活性變化的決定因素［7］。多糖經硫酸酯化后，很多生物活性得到顯著提高，多糖硫酸酯作為一種新型藥物具有很多優(yōu)勢，如具有良好的抗病毒、增強免疫、抗腫瘤、抗凝血等重要作用。硫酸化香菇多糖能增強雞新城疫（newcastle disease，ND）疫苗的免疫作用［8］。硫酸化枸杞多糖均能顯著提高雞胚成纖維細胞的抗新城疫病毒感染能力，且與硫酸基取代度有關［9］。硫酸酯化豬苓多糖可增強對羥自由基（·OH）的清除能力，并呈明顯量效關系［10］。硫酸酯化馬尾松花粉多糖能抑制體內外腫瘤細胞，促進T、B細胞增殖［11］，并可以抑制G2/M期人類肝癌HepG2細胞的生長［12］。取代度范圍為0.68～1.91的6 種硫酸酯化當歸多糖中，取代度為1.91硫酸酯化當歸多糖不僅能抑制病毒增殖，而且可以提高免疫功能［13］。本研究對油菜花粉多糖進行硫酸酯化修飾，并對其抗氧化活性進行深入系統的研究，旨在解決油菜花粉在保鍵食品方面的關鍵節(jié)點問題，擴大油菜花粉在食品工業(yè)中的應用范圍。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP），貴州民族大學化學與環(huán)境科學學院藥物與化學實驗室自制，純度為74.86%。

MD34型透析袋（截留分子質量8 000～14 000 D，進口分裝）；氯仿、濃硫酸、濃鹽酸、正丁醇、NaOH、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚、硫酸銨、硫酸鉀、三氯乙酸、BaCl2、明膠、抗壞血酸、焦性沒食子酸、三（羥甲基）氨基甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、過氧化氫、濃鹽酸等均為分析純。

1.2儀器與設備

電子分析天平、756PC紫外分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州博遠實驗分析儀器廠；傅里葉Nicolet6700型紅外光譜儀上海萊?？茖W儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1硫酸酯化油菜花粉多糖的制備［14］

取濃硫酸7.5 mL、正丁醇2.5 mL，置于裝有冷凝管和攪拌裝置的干燥三頸瓶中，再加入0.130 g硫酸銨，磁力攪拌并冰浴冷卻至0 ℃，緩慢加入油菜花粉多糖0.5 g，分別在0 ℃和10 ℃反應30 min，反應液經預冷至0 ℃的4 mol/L NaOH溶液中和至pH 7，移入透析袋，流水透析2 d、蒸餾水透析1 d。透析液離心，上清液冷凍干燥，即得硫酸酯化油菜花粉多糖S-RPP1和S-RPP2。

1.3.2硫酸基含量的測定［15］

1.3.2.1標準曲線的繪制

精確稱取105 ℃干燥至恒質量的K2SO4217.5 mg，用1 mol/L的HCl溶液定容至50 mL，得硫酸根標準溶液。準確吸取K2SO4標準溶液0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL，分別以1 mol/L的HCl溶液補至0.40 mL，以0.40 mL HCl溶液作為空白，加入質量分數為3%的三氯乙酸7.6 mL和質量分數為0.2%的BaCl2-明膠溶液2.0 mL，搖勻，室溫靜置15 min，于360 nm波長處測定吸光度（A1）；再以相同體積的質量分數為0.5%明膠溶液代替BaCl2-明膠溶液，依上法操作，于360 nm波長處測定吸光度（A2）。以硫酸根含量為橫坐標，A1-A2為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.004 4x+0.028 7（R2=0.994 4）。

1.3.2.2樣品中硫酸根含量的測定

精密稱取硫酸酯化油菜花粉多糖樣品各20 mg，振搖于2 mL的1 mol/L鹽酸中。移至具塞試管中密封好，待完全溶解后置于沸水浴中1 h。取0.2 mL反應液進行分析，按照制作標準曲線的方法，測定其吸光度（A1）。

根據標準曲線得到試樣中SO42-的百分含量，硫酸酯化油菜花粉多糖的取代度（degree of substitution，DS）計算公式如下。

式中：C為試樣中硫酸根含量/%。

1.3.3紫外光譜分析

在200～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描。

1.3.4紅外光譜分析

采用KBr壓片法。波數范圍為4 000～400 cm-1，儀器分辨率為0.5 cm-1，靈敏度為90，掃描次數為32/64。

1.3.5對·OH的清除作用測定［16］

在具塞試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同濃度的樣品溶液1 mL和6 mol/L H2O2溶液1 mL，搖勻，37 ℃恒溫水浴0.5 h，以蒸餾水為參比，于510 nm波長處測定其吸光度?！H清除率計算公式如下。

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為加入多糖溶液后的吸光度；A2為不加顯色劑H2O2多糖溶液本底的吸光度。

1.3.6對O2-·的清除作用測定［17］

在具塞試管中加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.27）和4.2 mL蒸餾水，混勻，在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液），迅速搖勻，在325 nm波長處每隔10 s測定吸光度（A）。按公式（3）計算鄰苯三酚自氧化率（ΔA0）。

加入鄰苯三酚前，分別加入1.0、1.2、1.5、1.7、2.0、4.2 mL質量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，不足4.2 mL的用蒸餾水補足，其他操作方法同上。計算加樣后鄰苯三酚自氧化速率（ΔA），得出對O2-·的抑制率。以VC為對照品。

1.3.7對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用測定［18］

用無水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，在具塞試管加入DPPH溶液2 mL和不同濃度樣品溶液2 mL，混合均勻，暗室下室溫避光反應30 min后，以乙醇溶劑調零點，測定DPPH混合溶液在517 nm波長處的A值。

式中：Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL多糖溶液的吸光度；Aj為2 mL多糖溶液+2 mL溶劑的吸光度；Ac為2 mL DPPH溶液+2 mL溶劑的吸光度（溶劑均為無水乙醇）。

2　結果與分析

2.1硫酸根離子含量測定結果

經測定，S-RPP1、S-RPP2的吸光度分別為0.225、0.286，帶入標準曲線回歸方程計算得其硫酸根含量分別為11.3%、14.5%，取代度分別為0.89、1.36。

2.2紫外光譜分析

圖1　S-RPP1（a）和S-RPP2（b）的UV光譜Fig.1　UV spectra of S-RPP1（a） and S-RPP2（b）

由圖1可知，S-RPP1、S-RPP2在260、280 nm波長附近均出現新的吸收峰，說明在油菜花粉多糖分子上連接上了硫酸酯基團。

2.3紅外光譜分析

圖2　油菜花粉多糖RPP（a）及其酯化產物S-RPP1（b）和S--RPP2（c）的紅外光譜Fig.2　IR spectra of RPP （a）， S-RPP1（b） and S-RPP2（c）

在3 280 cm-1和2 910 cm-1附近分別有—OH和C—H的吸收峰，均是多糖類化合物的特征吸收峰；1 650 cm-1附近出現的吸收峰是C=O鍵非對稱收縮振動；1 541、1 400 cm-1附近出現的吸收峰是C—O的變角振動引起，說明有官能團—COOH存在；1 233、1 142 cm-1出現的吸收峰均是O=S=O的伸縮振動特征峰。由圖2可知，硫酸根基團通過反應已經成功地連接到了油菜花粉多糖的葡萄糖殘基上。

2.4RPP、S-RPP1和S-RPP2對·OH的清除作用

圖3　RPP1和S-RPPS-RPP2對·OH的清除作用Fig.3　Hydroxyl radical scavenging effect of RPP， S-RPP1and S-RPP2

由圖3可知，隨著多糖質量濃度的增加，對Fenton反應產生的·OH均有較強的清除作用。當質量濃度大于0.4mg/mL時，RPP、S-RPP1和S-RPP2對·OH清除能力的差異明顯增大，而S-RPP1表現出更強的清除活性，但是清除能力均低于同質量濃度的VC。

2.5RPP、S-RPP1和S-RPP2對O2-·的清除作用

圖4　RPP1和S-RPPS-RPP2對OO2-·的清除作用Fig.4　Superoxide anion radical scavenging effect of RPP， S-RPP1and S-RPP2

由圖4可知，RPP、S-RPP1和S-RPP2對鄰苯三酚自氧化體系產生的O2-·都表現出了一定的清除能力。S-RPP1和S-RPP2的清除活性相當。當多糖質量濃度在2～6 mg/mL范圍內，S-RPP1和S-RPP2的清除活性明顯高于RPP，當質量濃度高于6 mg/mL時差異又相對減小。說明在一定質量濃度范圍內對硫酸化修飾油菜花粉多糖可提高其對O2-·的清除能力。

2.6RPP、S-RPP1和S-RPP2對DPPH自由基的清除作用

圖5　RPP、S-RPP1和SS--RPP2對DPPH自由基的清除作用Fig.5　DPPH radical scavenging effect of RPP， S-RPP1and S-RPP2

由圖5可知，RPP、S-RPP1和S-RPP2對DPPH自由基均有顯著的清除作用，隨著樣品質量濃度的增加，對 DPPH自由基的清除能力均呈現增長趨勢。在2～10 mg/mL質量濃度范圍內，S-RPP1對DPPH自由基的清除能力都遠高于RPP和S-RPP2；當質量濃度大于4 mg/mL時，S-RPP2對DPPH自由基的清除能力明顯大于RPP。

3　結 論

本實驗以油菜花粉多糖為原料，經硫酸酯化修飾后得到S-RPP1和S-RPP22 個產物，硫酸根含量分別為11.3%、14.5%，取代度分別為0.89、1.36。體外抗氧化活性結果顯示，硫酸酯化修飾后的多糖對DPPH自由基、·OH和O2-·具有較好的清除能力，并且呈現明顯的量效關系。同質量濃度條件下，S-RPP1和S-RPP2的清除能力均明顯高于RPP，說明油菜花粉多糖經過修飾后，抗氧化作用明顯增強。尤其是S-RPP1表現出更好的抗氧化活性?？赡苁且驗檠苌?，多糖的部分支鏈被水解，空間結構發(fā)生變化，進而使油菜花粉多糖的抗氧化活性提高。硫酸酯化油菜花粉多糖的構效關系有待進一步研究。

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Antioxidant Effect of Sulfated Polysaccharides from Rape Pollen

YAO Qiuping， LI Yang， DENG Jian
（School of Chemistry and Environmental Science， Guizhou Minzu University， Guiyang 550025， China）

Objective： To investigate the antioxidant effect in vitro of native and sulfated polysaccharides from rape pollen（RPP）. Methods： After sulfation of RPP using a sulfuric acid method at 0 and 10 ℃， respectively， the scavenging capacities against hydroxyl free， superoxide anion， and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radicals were assayed using vitamin C（VC） as the control. Results： Two sulfated polysaccharides of RPP with degree of substitution （SD） of 0.89 and 1.36， named S-RPP1and S-RPP2， respectively， were obtained. RPP， S-RPP1and S-RPP2had certain scavenging ability against the three free radicals. Total antioxidant activity was in the decreasing order of S-RPP1＞ S-RPP2＞ RPP. Conclusion： The antioxidant activity of polysaccharides from rape pollen can be improved through sulfation.

polysaccharides from rape pollen； sulfation modification； antioxidant activity

TS255.1

A

1002-6630（2015）13-0065-04

10.7506/spkx1002-6630-201513013

2014-09-22

貴州省科技廳自然科學基金資助項目（黔科合J字［2010］2263號）；貴州民族大學引進人才科研項目

姚秋萍（1978—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：wonderyqp@aliyun.com