邵　麗，吳正鈞，張　灝，陳　衛(wèi)，郭本恒，*

（1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)技術中心，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海 200436；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

鼠李糖乳桿菌胞外多糖S2的原子力顯微鏡觀察

邵麗1，2，吳正鈞1，張灝2，陳衛(wèi)2，郭本恒1，2，*

（1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)技術中心，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海 200436；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

胞外多糖S2是從鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）KF5的發(fā)酵乳中分離純化得到的高分子質(zhì)量組分。采用原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）對胞外多糖S2在水溶液中的表觀形貌進行觀察。結果表明：不同質(zhì)量濃度的胞外多糖S2經(jīng)AFM成像，得到了不同形貌多糖分子聚集行為的圖像。隨著胞外多糖S2質(zhì)量濃度的降低，多糖分子之間的作用力減弱，外貌發(fā)生從膜狀、島嶼狀、網(wǎng)格狀到單鏈/雙鏈結構的變化。當胞外多糖S2質(zhì)量濃度為50 ng/mL時，多糖分子間形成網(wǎng)狀結構，說明胞外多糖S2具有多分支的化學結構。當胞外多糖S2質(zhì)量濃度為10 ng/mL時，多糖分子在水溶液中呈柔性鏈，形成無規(guī)卷曲的構象，進一步驗證了由高分子稀溶液理論推斷的無規(guī)卷曲構象的結論。

鼠李糖乳桿菌；胞外多糖；原子力顯微鏡；分子外貌

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的黏液或莢膜多糖。LAB被公認為是安全（generally regarded as safe，GRAS）的，因此，產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株可以直接應用到發(fā)酵生產(chǎn)中，以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性、改善發(fā)酵乳的風味，使產(chǎn)品質(zhì)地細膩均勻，口感潤滑［1-4］。同時，LAB胞外多糖還具有重要的生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇、降血壓、增強黏膜吸附作用等［5-8］。

多糖的生物活性不僅取決于多糖鏈的化學結構，還與多糖本身的分子質(zhì)量大小、溶解性以及構象等物理性質(zhì)有著密切關系［9-11］。因此，了解多糖的構象可以更好地闡明其結構與功能的關系。多糖鏈構象主要由其在溶液中的分子參數(shù)確定，同時也可用顯微技術直接觀察。原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）是近十幾年發(fā)展起來的研究生物大分子形態(tài)和構象的有力工具。生物大分子在其生理環(huán)境下直接成像，可以很直觀地觀察分子的構象變化及分子間的實時動態(tài)反應［12-14］。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）KF5是一株篩選自健康志愿者糞便的乳酸菌菌株。前期研究表明，菌株KF5在脫脂乳中產(chǎn)胞外多糖，經(jīng)提取和分離純化得到低分子質(zhì)量組分S1和高分子質(zhì)量組分S2，兩組分均能顯著地促進T淋巴細胞增殖，具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能［15］。同時，應用高分子稀溶液理論，通過黏度法、尺寸排除色譜和多角度激光光散射聯(lián)用（size-exclusion chromatography with multi-angle laser light scattering，SEC-MALLS）和動態(tài)光散射法（dynamic light scattering，DLS）等對胞外多糖S2的分子特性進行測定，結果表明胞外多糖S2在0.1 mol/L NaNO3溶液中呈現(xiàn)無規(guī)卷曲的構象［16］。本實驗進一步采用AFM對不同質(zhì)量濃度的胞外多糖S2在水溶液中的微觀形貌進行觀察，以期獲得更多該多糖的分子結構特征信息。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）KF5（CGMCC No. 6430），由光明乳業(yè)技術中心篩選得到。

脫脂乳培養(yǎng)基（1 L）：脫脂乳粉120 g、葡萄糖10 g、水880 g，118 ℃滅菌15 min。

1.2試劑與儀器

DEAE-Sepharose Fast Flow離子膠、Sepharose CL-6B凝膠 美國GE公司；其他試劑均為分析純。

Nano Scope Ⅲa型原子力顯微鏡 美國Digital Instruments公司；超純水儀 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1胞外多糖S2的制備

將活化的L. rhamnosus KF5接種到脫脂乳培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)32 h制得發(fā)酵乳。發(fā)酵乳經(jīng)煮沸、離心、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冷凍干燥得到粗多糖。粗多糖再經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sepharose CL-6B凝膠層析制得純多糖，經(jīng)高效液相色譜鑒定為單一對稱峰，確定為均一組分（S2）［15］。

1.3.2多糖溶液的制備

準確稱取1 mg胞外多糖S2，溶解在20 mL超純水中，配制成50 μg/mL的多糖溶液。在磁力攪拌器上攪拌6 h，使其充分溶解，然后用超純水系列稀釋得到10、0.1 μg/mL以及50、10 ng/mL的多糖溶液。

1.3.3AFM樣本的制備

AFM樣本的制備采用兩種如下方法：1）直接將5 μL多糖溶液滴在新剝開的云母片表面，空氣中自然干燥。2）取5 μL 20 mmol/L MgCl2溶液滴在新剝開的云母片上，孵育2 min，然后用大量的超純水沖洗，干燥后在其表面滴加5 μL多糖溶液，在空氣中自然干燥（本實驗中僅10 ng/mL多糖溶液采用此方法）［17］。

1.3.4AFM觀察條件

在室溫、大氣環(huán)境（相對濕度不高于60%）中，將制備好的多糖云母片樣本在Nano Scope Ⅲa型原子力顯微鏡下進行掃描。掃描采用輕敲模式，作用力控制在3～4 nN量級以內(nèi)，掃描頻率2 Hz。所用探針為Si3N4，微懸臂長：225 μm，彈性系數(shù)：0.6～3.7 N/m。圖像處理分析采用AFM附帶的軟件Nanoscope 5.30r3sr3進行。

2　結果與分析

2.150 μg/mL胞外多糖S2的AFM圖像

圖像所顯示的多糖分子的密度取決于其初始質(zhì)量濃度及其沉積到云母表面的量［18］。將不同質(zhì)量濃度的胞外多糖S2樣品分別用AFM成像觀察，得到了不同形貌多糖分子聚集行為的圖像。

圖1　胞外多糖S2（50 ?g/mL）的原子力顯微鏡圖像Fig.1　AFM topographic image of EPS S2 deposited on mica at a concentration of 50 ?g/mL

如圖1所示，當質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，胞外多糖S2在云母片表面鋪展開，形成連續(xù)的膜（圖1a），膜的厚度為2.5～3.8 nm。在立體圖（圖1b）上清楚地看到一張完整的膜，具有淺的凹坑的表面結構。由于多糖質(zhì)量濃度大，羥基數(shù)目多，分子間的氫鍵締合作用增強，多糖聚合較緊密，形成膜狀結構。Ding Xiang等［19］從灰松乳菇子實體中分離到多糖LDG-A（25 μg/mL），在云母片上也觀察到成膜的表面結構，直徑和高度在20～80 nm之間。

2.210 μg/mL胞外多糖S2的AFM圖像

隨著質(zhì)量濃度的降低，胞外多糖S2的形貌發(fā)生了變化。當多糖質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，多糖分子聚集成片狀黏連結構，如圖2a所示。圖2b顯示了胞外多糖S2的3D地形圖，形貌如島嶼狀結構，這些大小不等的“孤島”的相對連續(xù)表面的高度為1.8～3.0 nm，直徑大小不等，如156、259、350、470 nm等。這種島嶼狀的表觀外貌在其他多糖中也曾觀察到。Zeng Weicai等［20］利用AFM觀察木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharides，AAP）在50 μg/mL時的微觀外貌，結果發(fā)現(xiàn)多糖聚 集成高度為1.1～1.5 nm、直徑為7～56 nm大小不等的球殼。陳海霞［21］研究不同質(zhì)量濃度茶多糖的分子外貌，發(fā)現(xiàn)茶多糖在1 μg/mL時形成厚度為1.4～2.6 nm、直徑為320～460 nm的球狀。多糖這種形貌的形成是大量多糖分子的分子間和分子內(nèi)氫鍵作用以及范德華力造成的。

圖2　胞外多糖S2（10 ?g/mL）的原子力顯微鏡圖像Fig.2　AFM topographic image of EPS S2 deposited on mica at a concentration of 10 ?g/mL

2.30.1 μg/mL胞外多糖S2的AFM圖像

圖3　胞外多糖S2（0.1 ?g/mL）的原子力顯微鏡圖像Fig.3　AFM topographic image of EPS S2 deposited on mica at a concentration of 0.1 ?g/mL

如圖3所示，當胞外多糖S2質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL時，多糖鏈的形貌初現(xiàn)，從圖中可以很明顯地看到多糖鏈之間旋轉纏繞，呈麻花狀。測得鏈的高度為0.7～1.5 nm，而鏈的寬度為100～120 nm，遠遠高于多糖鏈的寬度，這是掃描探針的增寬效應所致［18］。

2.450 ng/mL胞外多糖S2的AFM圖像

圖4　胞外多糖S2（50 ng/mL）的原子力顯微鏡圖像Fig.4　AFM topographic image of EPS S2 deposited on mica at a concentration of 50 ng/mL

如圖4所示，當質(zhì)量濃度為50 ng/mL時，胞外多糖S2在云母片表面形成網(wǎng)狀結構，這是由于多糖鏈間通過糖單元間不同的連接方式衍生出許多大小不一的環(huán)狀結構所致，小環(huán)的直徑為126.95、146.48 nm大小不等，從而直接證明了胞外多糖S2具有多分支的結構。鏈的高度很一致，平均高度在0.45～0.75 nm之間。通常多糖分子鏈的高度在0.1～1 nm之間［22-23］，可以推測此處多糖鏈由單股或雙股纏繞而成。從圖中可以清楚地觀察到多糖鏈呈卷曲旋轉狀，趨勢很像螺旋。多糖分子鏈之間交聯(lián)成網(wǎng)狀結構的現(xiàn)象也曾被報道過：蔡林濤等［24］對純化的蟲草多糖（0.01 mg/mL）在水溶液中的分子外貌進行觀察，發(fā)現(xiàn)蟲草多糖分子鏈呈分支結構，而且互相纏繞，鏈間形成大大小小的環(huán)。單鏈的厚度為1.8 nm，長度為幾個微米，寬度為20～40 nm。絞股藍多糖GPPⅢ-a（10 μg/mL）經(jīng)45 ℃水浴加熱后用AFM觀察，聚合物鏈分子間互相纏繞，交聯(lián)形成許多大小不一的不規(guī)則環(huán)狀結構［25］。

2.510 ng/mL胞外多糖S2在經(jīng)修飾的云母片上的AFM圖像

胞外多糖S2分子本身帶有少量的負電荷，為了減少因多糖與云母片間的靜電排斥作用而產(chǎn)生的聚集效應，可采用二價陽離子（如Ni2+、Mg2+）來修飾云母片［17，24］，本實驗選用20 mmol/L MgCl2來處理云母片表面，再將多糖溶液滴在云母片上。當胞外多糖S2的質(zhì)量濃度為10 ng/mL時，捕捉到多糖S2在水溶液中的表觀外貌（圖5a），胞外多糖S2分子在水溶液中以柔性鏈存在，形成無規(guī)卷曲的構象，很明顯地不同于黃原膠（單股螺旋構象）［26］或者香菇多糖（三股螺旋構象）［27］的硬鏈（rigid/stiff）或棒狀（rod-like）鏈構象。如圖5b所示，多糖鏈呈旋轉彎曲狀，測得鏈的平均高度在1.6～2.1 nm左右，鏈的寬度在40～55 nm范圍內(nèi)。說明本實驗所觀測的多糖鏈并非是單鏈多糖，而是由幾股單鏈纏繞聚集而成。即使在如此低的多糖質(zhì)量濃度下，多糖分子之間仍然發(fā)生了聚集。這是由于柔性多糖分子具有更復雜的結構，通常含有支鏈和非碳取代基團，它們之間通過糖鏈上的負離子與陽離子相互作用，或分子內(nèi)和分子間的氫鍵或者范德華力相互作用產(chǎn)生聚集［28-29］。因此，柔性多糖分子在水溶液中很容易發(fā)生鏈間聚集［30］。

圖5　胞外多糖S2（10 ng/mL）的原子力顯微鏡圖像Fig.5　AFM topographic image of EPS S2 deposited on modified mica at a concentration of 10 ng/mL

從胞外多糖S2的AFM圖像（圖1～5）可以看出，隨著質(zhì)量濃度的減小，胞外多糖S2的聚集性明顯減小，表觀外貌呈現(xiàn)出從膜狀、島嶼狀、網(wǎng)狀到單鏈/雙鏈結構的變化。根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)還沒有辦法確定胞外多糖S2單鏈的厚度、寬度和長度。多糖鏈的構象主要與鏈結構、分子內(nèi)和分子間作用力以及溶劑有關，多糖分子作用力主要包括氫鍵、偶極相互作用、疏水力和靜電力等非共價作用力［31］。外界條件（如熱處理、超聲波、pH值的變化、金屬離子、溶劑）的改變都會引起多糖在溶液中構象的變化［32］。為了進一步了解胞外多糖S2分子鏈的信息，可以選擇尿素、NaOH、表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）或二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）來消除分子間或分子內(nèi)的作用力［10，31，33-34］，分析胞外多糖S2的構象變化，獲得更多的信息。

3　結 論

本實驗觀察了鼠李糖乳桿菌胞外多糖S2在不同質(zhì)量濃度條件下所呈現(xiàn)的不同表觀外貌。隨著質(zhì)量濃度的降低，胞外多糖S2分子之間的作用力減弱，外貌呈現(xiàn)出從膜狀、島嶼狀、網(wǎng)狀到單鏈/雙鏈結構的變化。當質(zhì)量濃度為50 ng/mL時，多糖分子間形成網(wǎng)狀結構，說明胞外多糖S2具有多分支的化學結構。當質(zhì)量濃度達到10 ng/mL時，多糖分子在水溶液中呈柔性鏈，形成無規(guī)卷曲的構象，這與動靜態(tài)激光光散射法和黏度法推測的多糖鏈構象結果一致。AFM是研究多糖高級結構的有力工具，可以與其他表征方法結合起來更好地解析多糖構象。但由于多糖結構復雜，采用AFM對多糖分子的研究還遠不及對核酸（DNA）、蛋白質(zhì)等生物大分子的研究。目前運用AFM成功地觀察多糖分子的構象還主要集中在具有剛性鏈結構的多糖分子中，而對含有多支鏈的柔性鏈多糖分子的觀察相對較少［30］。隨著AFM技術的改進和完善，AFM在多糖構象研究中會有更廣泛的應用前景。

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Observation of Exopolysaccharide S2 from Lactobacillus rhamnosus KF5 Using Atomic Force Microscopy

SHAO Li1，2， WU Zhengjun1， ZHANG Hao2， CHEN Wei2， GUO Benheng1，2，*
（1. State Key Laboratory of Dairy Biotechnology， Technology Center of Bright Dairy and Food Co. Ltd.， Shanghai 200436， China；2. School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

S2， a high molecular weight fraction of exopolysaccharides （EPS）， was purified from skim milk fermented by Lactobacillus rhamnosus KF5. The surface topography of EPS S2 in aqueous solution was observed using atomic force microscopy （AFM）. The different topographic images of EPS S2 were obtained in aqueous solutions at different concentrations of polysaccharide. With a decrease in the concentration of polysaccharide solution， the interactions between polysaccharide molecules were weakened. The surface topography of S2 was changed from the spherical lump， island-shape， entangled network to one/two strand chains. At a concentration of 50 ng/mL， the polysaccharide molecules formed network structures， indicated that S2 had branched structure. When the concentration of S2 polysaccharide was 10 ng/mL， the polysaccharides existed as flexible chains，formed disordered random coils in water. This further proved that the random coil conformation of this molecule obtained from light scattering and viscometry experiments， according to the theory of dilute polymer solutions.

Lactobacillus rhamnosus； exopolysaccharides； atomic force microscopy （AFM）； molecular morphology

Q539；TS201

A

1002-6630（2015）13-0043-05

10.7506/spkx1002-6630-201513009

2014-08-14

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100901）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B01）

邵麗（1980—），女，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：teamo-lily@163.com

郭本恒（1963—），男，教授，博士，研究方向為乳品科學與技術。E-mail：gbhbrightdairy@hotmail.com