吳盼盼，段元鋒，徐德平

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

油菜蜂花粉多糖的分離鑒定及免疫活性研究

吳盼盼，段元鋒，徐德平*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

油菜蜂花粉粉碎后經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇脫脂，過濾，濾渣用去離子水60℃提取，再用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀提取液，得到油菜蜂花粉水提醇沉物。利用DEAE-纖維素柱、HW-55F色譜柱及Sephacryl色譜柱、Sepharose色譜柱對油菜蜂花粉水提醇沉物進(jìn)行分離，得到一個(gè)主要的多糖類化合物。經(jīng)Sephadex G-100色譜柱及紫外光譜分析對該化合物進(jìn)行純度鑒定，再通過核磁方法對其進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR分析，得該化合物結(jié)構(gòu)為HOCH2-［CHOH］4-COOH。給免疫抑制小鼠灌胃花粉多糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：油菜蜂花粉多糖能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01）、脾臟指數(shù)（P＜0.01）及血清IgG水平（P＜0.01）。

油菜蜂花粉水提物；免疫活性；分離；多糖

油菜（Brassica campestris L.）是十字花科蕓薹屬植物，為中國大面積種植的經(jīng)濟(jì)作物。油菜蜂花粉是蜜蜂采集油菜的花粉，再經(jīng)蜜蜂加工而成的花粉團(tuán)狀物，蜜蜂在采集花粉的過程中加入了一些花蜜和分泌物。油菜蜂花粉中含有蛋白質(zhì)和游離氨基酸、糖類、脂類、維生素、微量元素、酶、激素等多種營養(yǎng)物質(zhì)［1］，營養(yǎng)價(jià)值較高。油菜蜂花粉具有增強(qiáng)免疫力、預(yù)防衰老、防治心腦血管疾病以及調(diào)節(jié)腸胃功能等作用［1-2］。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3-9］，油菜蜂花粉中具有增強(qiáng)免疫力作用的成分存在于蜂花粉水提物中，多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為其中能夠提升免疫活性的物質(zhì)基礎(chǔ)為多糖。對于蜂花粉中多糖成分具有增強(qiáng)免疫活性作用的研究也一般以多糖粗品為主，對蜂花粉多糖成分結(jié)構(gòu)的深入研究甚少。對于花粉水提物中其它活性成分是否具有提高免疫力的功效并未見文獻(xiàn)報(bào)道。作者針對這一問題對油菜蜂花粉水提物中具有的免疫活性成分進(jìn)行了深入研究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

油菜蜂花粉：購于青海門源蜂場；昆明小鼠30只，雌雄各半，4周齡，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司；注射用環(huán)磷酰胺（Cytoxan，CTX）：山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號04110606；羊抗小鼠抗血清：上海晶天生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；疊氮鈉：北京鑫鼎鵬飛科技有限公司產(chǎn)品；ODS柱填料：Nacalai Tosoh Inc產(chǎn)品；AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠產(chǎn)品；GF254硅膠板：山東煙臺芝罘化工廠產(chǎn)品；其它試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2儀器和設(shè)備

DFY-600搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；CQ-005型萃取罐：常州市特威電氣自動化系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；核磁共振儀Avance 500 MHz：Bruker公司產(chǎn)品；ZF-90型暗箱式紫外透射儀：上海顧村電光儀器廠產(chǎn)品；CR3i高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo公司產(chǎn)品。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1油菜蜂花粉水提醇沉物的制備

將10 kg油菜蜂花粉粉碎，過80目篩，投入100 L萃取罐，按料液質(zhì)量體積比比1 g∶8 mL加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，60℃條件下攪拌提取3 h，抽濾得上清液與濾渣。濾渣回入100 L萃取罐中，按料液1 g∶5 mL比加入去離子水，60℃條件下提取3 h，抽濾得上清液和濾渣，濾渣按相同條件再提取一次，抽濾，合并兩次的上清液。將上清液濃縮到10 L，按體積比1∶4邊攪拌邊加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，室溫下沉淀12 h。將上清液與沉淀分離，沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌兩次，真空干燥后即為水提醇沉物。

2.2油菜蜂花粉水提醇沉物的分離

2.2.1大孔樹脂AB-8柱的分離水提乙醇沉淀物加適量去離子水超聲處理，過280目篩，上大孔樹脂AB-8柱（10 cm×150 cm），流量20 mL/min，依次用去離子水，體積分?jǐn)?shù)10%、95%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，用100 mL的三角瓶依次進(jìn)行收集，用苯酚—硫酸法跟蹤檢測多糖，收集含多糖部分［10］。

2.2.2DEAE-纖維素凝膠柱的分離多糖組分經(jīng)濃縮后，上DEAE-纖維素凝膠柱（D 3 cm×100 cm），流量5 mL/min。分別用去離子水、0.1、0.2、0.3 mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，流量5 mL/min，自動分部收集器15 mL/每管收集，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，合并收集各含糖的峰。

2.2.3HW-55F色譜柱的分離將含多糖的主要峰組分濃縮，過濾后上HW-55F（D 3 cm×100 cm）色譜柱，流量5 mL/min。用去離子水洗脫，流量5 mL/ min，15 mL/管收集洗脫液，苯酚-硫酸法檢測洗脫液。經(jīng)HW-55F色譜柱分離的多糖組分，再經(jīng)Sephacryl S-400（3 cm×100 cm）色譜柱色譜柱多次純化，分離得到多糖化合物A。

2.3純度鑒定

2.3.1Sephadex G-100色譜柱鑒定將多糖化合物A上Sephadex G-100色譜柱鑒定其純度，流速為2 mL/min，去離子水洗脫。苯酚-硫酸法檢驗(yàn)。

2.3.2紫外光譜分析配制0.5 mg/mL多糖A溶液，利用分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，波長范圍為200～400 nm，觀察260 nm和280 nm處的吸收峰。

2.4多糖化合物A免疫活性測定

采用清潔級昆明小鼠（雌雄各半）40只，分為正常組（10只）、環(huán)磷酰胺（CTX）模型組（10只）、環(huán)磷酰胺（CTX）-水提醇沉組（10只）、磷酰胺（CTX）-多糖A組（10只）。CTX-水提醇沉物組每天灌胃油菜蜂花粉水提醇沉物250 mg/Kg，正常組與模型組每天灌胃等量的生理鹽水。第10天時(shí)，給模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg/kg，正常組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。注射環(huán)磷酰胺后第4天最后一次灌胃，禁食12 h后小鼠稱重，眼球采血，斷頸處死，制備血清，采用單向瓊脂擴(kuò)散法比較小鼠血清中的IgG含量。取出小鼠的胸腺、脾臟稱重，計(jì)算其胸腺脾臟指數(shù)并用spss16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果用x±s表示［3，11-14］。

2.5結(jié)構(gòu)鑒定

所得的化合物以氘代吡啶為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)物，在核磁共振儀上進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR分析。

3　結(jié)果與討論

3.1水提醇沉物成分分離

3.1.1DEAE-纖維素凝膠柱的分離結(jié)果水提醇沉物過大孔樹脂AB-8柱，水洗部分用DEAE-纖維素凝膠柱分離，經(jīng)去離子水和氯化鈉溶液梯度洗脫，得如圖1所示的洗脫曲線。從圖中可以看到各梯度鹽溶液的洗脫峰，由洗脫液的吸光度值可知，多糖組分主要集中在水洗部分。由于氯化鈉洗脫部分的多糖含量較少，因此將水洗部分多糖作為進(jìn)一步研究對象。

圖1　DEAE-纖維素凝膠柱洗脫曲線Fig.1Elution curve of DEAE-cellulose gel column

3.1.2HW-55F柱分離結(jié)果將DEAE-纖維素凝膠柱分離出的水洗部分，過HW-55F柱，用苯酚-硫酸法檢測得如圖2所示的洗脫結(jié)果。由圖可知，洗脫液主要有一個(gè)多糖峰，取此峰段合并。

圖2　HW-55F柱洗脫曲線Fig.2Elution curve of HW-55F column

3.1.3Sephacryl S-400的分離結(jié)果將HW-55F柱分離得到的多糖，經(jīng)Sephacryl S-400柱反復(fù)純化，最終得到油菜蜂花粉多糖A，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測所得洗脫曲線如圖3所示。從圖中可知，多糖A具有單一對稱蜂，表明多糖A已分純。

圖3　多糖經(jīng)Sephacryl S-400柱洗脫曲線Fig.3Elution curve of polysaccharide A by Sephacryl S-400 column

3.2紫外光譜分析結(jié)果

將多糖A溶液在波長200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，得如圖4所示結(jié)果。圖中顯示，260 nm、280 nm波長處均無吸收峰，說明多糖A不含蛋白質(zhì)和核酸。

3.3多糖A免疫活性測定

油菜蜂花粉多糖A對免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及血清IgG水平的影響結(jié)果見表1，由表1可知多糖A組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及小鼠血清IgG水平均顯著高于模型組（P＜0.01），且與正常組小鼠的各項(xiàng)指數(shù)沒有顯著性差異（P＞0.05）。水提醇沉物組小鼠胸腺指數(shù)及血清IgG水平均顯著高于模型組（P＜0.01），脾臟指數(shù)顯著高于模型組小鼠（P＜0.05），各項(xiàng)指標(biāo)與正常組小鼠沒有顯著性差異（P＞0.05）。表明多糖A及水提醇沉物均可將小鼠的胸腺、脾臟重量及血清IgG水平（P＜0.05）恢復(fù)到正常水平。且多糖組小鼠的血清IgG水平顯著高于水提醇沉物組（P＜0.05），說明油菜蜂花粉多糖在純化后免疫活性更顯著。

圖4　多糖A紫外吸收圖譜Fig.4UV absorption spectrum of polysaccharide A

表1　小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及血清IgG水平（x±s）Table 1Level of serum IgG and thymus index and spleen index of mice（x±s）

注：a代表差異為P＜0.01，b代表差異為P＜0.05，均與模型組比較。*代表差異為P＜0.05，與水提醇沉物組比較。

3.4多糖A結(jié)構(gòu)鑒定

多糖A為白色粉末，無揮發(fā)性，無甜味，易溶于水，難溶于丙酮、乙醇、乙醚。

多糖A的1H-NMR見圖6，由圖6可見δ 3.5～4.3有6個(gè)質(zhì)子信號，這些信號為糖上質(zhì)子信號，δ 4.5～5.5未見質(zhì)子信號，說明該物質(zhì)無端基質(zhì)子，進(jìn)一步得出多糖A為酮糖糖醇類。其13C-NMR見圖7，其數(shù)據(jù)見表2，由碳信號數(shù)據(jù)可見，多糖A共6個(gè)碳信號，180.84處為一羧基信號，76.47、74.90、73.72、73.38、65.16為連氧碳信號，表明多糖A為糖醛酸。其135DEPT見圖8，65.2處為CH2信號，這些信號表明多糖A不是普通的環(huán)狀呋喃或吡喃糖，由于未見端基碳信號，應(yīng)該為直鏈型?？梢酝茢嗥淦谓Y(jié)構(gòu)為：HOCH2-［CHOH］4-COOH。

多糖連接方式的分析：從洗脫過程中可見，在DEAE色譜柱中是用水洗脫的，表明該多糖為中性多糖，可推測-COOH參與成鍵因而不表現(xiàn)酸性多糖性質(zhì)，故得出如圖5所示的重復(fù)結(jié)構(gòu)。

表2　多糖A在13C-NMR中的碳信號Table 2Signals of carbon in the13C-NMR of A

圖5　多糖A的結(jié)構(gòu)式Fig.5Structure of polysaccharide A

圖6　多糖A的1H-NMR譜圖Fig.61H-NMR spectrum of compound polysaccharide A

圖7　多糖A的13C-NMR譜圖Fig.713C-NMR spectrum of polysaccharide A

圖8　多糖A的135DEPT-NMR譜圖Fig.8135DEPT-NMR spectrum of polysaccharide A

4　討論

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Isolate，Identify and the Immune Improving Activity of Polysaccharides from Rape Bee Pollen

WU Panpan，DUAN Yuanfeng，XU Deping*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Rape bee pollen was powered and extracted by 95%ethanol under reflux，then extracting the filer residue by deionized water under 60℃.Adding 95%ethanol into the extract，rested and layered，then acquired the ethanol sediment of rape bee pollen.Isolating the ethanol sediment with DEAE-cellulose column，HW-55F chromatographic column，Sephacryl chromatographic column and Sepharose chromatographic column，acquired one main polysaccharide compound.Identifing the purity of this compound by Sephadex G-100 chromatographic column and ultraviolet spectral analysis，then using nuclear magnetic mathod to analyse the1H-NMR、13C-NMR and135DEPT-NMR of this compound，obtained its structural formula：HOCH2-［CHOH］4-COOH.Irrigating the immune suppression mice with this component of rape bee pollen，results showed that this component of rape bee pollen could improve the thymus index（P＜0.01），spleen index（P＜0.01）and serum IgG level（P＜0.01）of immune suppression mice significantly.

rape bee pollen，immune activity，isolation，polysaccharide

TM 344.1

A

1673—1689（2015）10—1040—05

2014-08-15

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD83B02）。

徐德平（1965—），男，安徽宣城人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：xdp1219@sina.com