樊祥宇，林燕萍，廖國建，謝建平

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基因組定向編輯技術(shù)的專利概述及其對高校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育的啟示

樊祥宇1, 2，林燕萍1，廖國建3，謝建平1

1. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶北碚400715;2. 濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，濟(jì)南 25002;3. 西南大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶北碚 400715

鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas9核酸酶是三個主要的基因組定向編輯技術(shù)。它們在基因功能研究、物種改造和疾病預(yù)防與基因治療等各個領(lǐng)域都有重大科學(xué)研究及應(yīng)用價值。每個技術(shù)背后都有過和有著激烈的知識產(chǎn)權(quán)歸屬之爭。本文歸納總結(jié)這三大基因組定向編輯技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)，以期為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因組編輯工具提供一些借鑒，也為現(xiàn)階段高校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育提供啟示。

ZFN；TALEN；CRISPR/Cas；知識產(chǎn)權(quán)

2008年我國國務(wù)院印發(fā)的《國家知識產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略綱要》指出“知識產(chǎn)權(quán)日益成為國家發(fā)展的戰(zhàn)略性資源和國際競爭力的核心要素，成為建設(shè)創(chuàng)新型國家的重要支撐和掌握發(fā)展主動權(quán)的關(guān)鍵”。對知識產(chǎn)權(quán)的了解及學(xué)習(xí)可以激發(fā)人們特別是青年學(xué)生及科研工作者的創(chuàng)造性，規(guī)范市場經(jīng)濟(jì)秩序和增強國家的自主創(chuàng)新能力意識。相反，知識產(chǎn)權(quán)知識匱乏，人們的創(chuàng)造性就難以被充分激發(fā)，創(chuàng)新型國家的建設(shè)也就難以實現(xiàn)。

基因組編輯技術(shù)作為新興的遺傳操作技術(shù)，在基因功能研究、動植物改造和疾病預(yù)防與基因治療等各個領(lǐng)域都具有重大科研及應(yīng)用價值。本文概述了它們的知識產(chǎn)權(quán)之爭，期望以此激發(fā)國內(nèi)的廣大遺傳學(xué)工作者的創(chuàng)造力和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)意識，以期為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因組編輯工具提供一些借鑒，為高?，F(xiàn)行的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育提供啟示。

1 基因組編輯技術(shù)簡介

1.1 鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)

ZFN可以被稱作第一代基因組編輯技術(shù)，它由美國約翰霍普金斯大學(xué)的Srinivasan Chandrasegaran課題組于1996年發(fā)明[1]。隨著眾多科學(xué)家對其的改造及應(yīng)用，逐漸成為最為成熟的基因組編輯技術(shù)[2, 3]。ZFN由鋅指蛋白(能夠特異性的識別并結(jié)合DNA序列)及非特異性核酸內(nèi)切酶Ⅰ融合而成，其工作原理是通過鋅指蛋白識別特定DNA序列后，Ⅰ將在此位點切割一個DNA雙鏈切口，之后細(xì)胞固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機制將進(jìn)行切口修復(fù)，從而實現(xiàn)對基因的定點編輯。

1.2 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)

TALEN可以被稱作第二代基因組編輯技術(shù)，在其被發(fā)現(xiàn)的短短幾年時間便得到了眾多科學(xué)家的關(guān)注及應(yīng)用開發(fā)[4]。德國馬丁-盧瑟大學(xué)Ulla Bonas研究組首次發(fā)現(xiàn)由植物致病菌Xanthomonas所分泌的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription activator-like effector，TALE)可以特異性識別、結(jié)合并激活植物宿主特定基因[5]。美國明尼蘇達(dá)大學(xué)的Dan Voytas和愛荷華州立大學(xué)的Adam Bogdanove研究組將TALE上進(jìn)行特異性識別并結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域與核酸內(nèi)切酶(Ⅰ)融合改造，得到TALEN[6, 7]。它的工作原理和ZFN類似，不過由于TALE結(jié)構(gòu)域可識別單個堿基(鋅指模塊識別三聯(lián)體堿基)，意味著TALEN比ZFN更容易設(shè)計、特異性更高。

1.3 成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9核酸酶

CRISPR/Cas是細(xì)菌及古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，其中CRISPR/Cas9被成功改造為第三代基因組編輯工具，可用于動物、植物以及細(xì)菌的基因組編輯。2012年Jennifer Doudna 和Emmanuelle Charpentier課題組首次提出該系統(tǒng)可作為基因編輯工具[8]。在接下來的短短幾年里眾多科學(xué)家對其產(chǎn)生了極大的興趣，該技術(shù)得到了迅速的推廣應(yīng)用[9]。CRISPR/Cas9核酸酶的作用原理和ZFN及TALEN(DNA序列特異性結(jié)合蛋白導(dǎo)向的基因編輯)不同，它主要依賴一段序列特異性的向?qū)NA分子(Single guide RNA，sgRNA)指導(dǎo)Cas9核酸酶的定向切割，Cas9蛋白在與 sgRNA 配對的序列靶位點剪切宿主的雙鏈 DNA，起到基因編輯的作用。這一系統(tǒng)相對于ZFN及TALEN技術(shù)擁有操作制備容易、特異DNA靶點尋找簡單和作用高效等優(yōu)點(表1)。

表1 三個基因組編輯技術(shù)的優(yōu)缺點

2 三大技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)問題

2.1 ZFN的知識產(chǎn)權(quán)問題

鋅指核酸酶技術(shù)是最成熟的基因組編輯技術(shù)?？茖W(xué)家對其進(jìn)行了近20年的開發(fā)研究，已經(jīng)從序列特異性、細(xì)胞毒性和免疫原性等方面對其有了較深的認(rèn)識。許多科學(xué)家已經(jīng)將這一技術(shù)用于人類疾病的基因治療以及植物動物的基因改良[2, 3]，并取得了一定的成果。但由于受到鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)專利保護(hù)的制約，這一技術(shù)的大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用甚至使進(jìn)一步的實驗室研究開發(fā)的前景都受到了很大的限制。

鋅指核酸酶的發(fā)明者Srinivasan Chandrasegaran教授在2009年時曾調(diào)查了ZFN的專利情況，發(fā)現(xiàn)美國Sangamo公司持有了有關(guān)鋅指核酸酶的大部分專利[10]。專利類別分析結(jié)果顯示，在Sangamo公司所持有的或得到專有授權(quán)的專利中，近一半的專利涉及到ZFP工程設(shè)計、篩選及優(yōu)化技術(shù)。眾所周知，鋅指模塊需要大量優(yōu)化才能實現(xiàn)特異性基因打靶，ZFP工程設(shè)計、篩選及優(yōu)化技術(shù)是鋅指核酸酶技術(shù)的核心。設(shè)計與鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合的核酸酶是繁瑣復(fù)雜的任務(wù)，一位分子生物學(xué)研究生需要花費1~2個月時間才能設(shè)計出完美的鋅指核酸酶。依托這些專利，美國生物化學(xué)公司Sigma-Aldrich(Sangamo生物技術(shù)公司把ZFN技術(shù)獨占性許可給Sigma-Aldrich公司)可為客戶提供專門定制或商品化的鋅指核酸酶。不過價格相當(dāng)昂貴(定制價格為25000美元/一種鋅指蛋白；商品化價格為12000美元/一種鋅指蛋白)。

這種情況于2008年發(fā)生改變，J. Keith Joung教授牽頭組織的鋅指協(xié)會公開了一種被稱作寡聚體庫工程(Oligomerized Pool Engineering，OPEN)的設(shè)計鋅指核酸酶的新方法[11]。并且鋅指協(xié)會還將儲存并為研究者提供已被證明的具有高效率的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(200美元/一種鋅指蛋白)。這意味著，學(xué)術(shù)研究者無需通過Sigma-Aldrich便可直接獲得高效率的鋅指蛋白。盡管到目前為止Sangamo公司并沒有對OPEN的鋅指核酸酶設(shè)計方法提出異議，也沒有對學(xué)術(shù)研究者發(fā)出禁止使用鋅指的禁令，但值得注意的是作為大部分鋅指核酸酶專利的持有者，Sangamo公司應(yīng)該會對所有涉及到ZFN下游應(yīng)用的商業(yè)發(fā)展都宣稱其知識產(chǎn)權(quán)。

2.2 TALEN的知識產(chǎn)權(quán)問題

TALEN技術(shù)晚于ZFN技術(shù)出現(xiàn)，但卻表現(xiàn)出更強的可塑性。相比鋅指模塊識別三聯(lián)體堿基，TALE結(jié)構(gòu)域可以識別單個堿基，這意味著原則上TALEN能靶向所有的核苷酸序列。面對如此巨大的應(yīng)用潛力，各大醫(yī)藥公司針對TALEN技術(shù)的專利戰(zhàn)早已打響。

筆者調(diào)查美國專利商標(biāo)局中有關(guān)TALEN技術(shù)的專利情況，發(fā)現(xiàn)主要有4大機構(gòu)持有TALEN技術(shù)的專利(附表1)：德國馬丁-盧瑟大學(xué)Ulla Bonas研究組(發(fā)明TALEN技術(shù)的兩個小組之一)、美國明尼蘇達(dá)大學(xué)的Dan Voytas和愛荷華州立大學(xué)的Adam Bogdanove研究組(發(fā)明TALEN技術(shù)的兩個小組之一)、Sangamo生物技術(shù)公司以及麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)的Broad研究所。

德國馬丁-盧瑟大學(xué)Ulla Bonas研究組擁有的有關(guān)TALEN技術(shù)的專利具有寬泛的保護(hù)范圍，內(nèi)容涵蓋TALE設(shè)計和使用的方方面面，包括融合蛋白。2011年他們將這些專利許可給美國Life Technologies公司。Life Technologies公司依托這些專利可開展除植物(TALEN技術(shù)在植物中的商業(yè)應(yīng)用被保留)以外所有方面的商業(yè)應(yīng)用。美國明尼蘇達(dá)大學(xué)/愛荷華州立大學(xué)研究組所持有的有關(guān)TALEN專利的關(guān)注點是獲得可在DNA上進(jìn)行位點特異性切割的TALEN的材料和方法。這些專利已被許可給法國Cellectis公司。Sangamo公司所擁有的有關(guān)TALEN技術(shù)的專利是利用TALE轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控哺乳動物內(nèi)源基因的表達(dá)，并對人內(nèi)源性基因進(jìn)行序列編輯。麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)Broad研究所持有的有關(guān)TALEN的專利主要利用此技術(shù)來改變動物細(xì)胞中特定的基因位點。值得關(guān)注的是中國斯丹賽生物技術(shù)有限公司(SIDANSAI Biotechnology Co.)的“TALEN構(gòu)建一步法”技術(shù)于2014年獲得專利授權(quán)(美國專利號：8748134)。這一技術(shù)將繁瑣的TALEN構(gòu)建方法簡化，提高了基因操作的效率。

現(xiàn)在，商業(yè)化定制的基因特異性的TALEN可以由多家公司提供，成套的TALEN試劑盒也已經(jīng)商業(yè)化。相比ZFN技術(shù)，其價格更易被科研工作者接受。

2.3 CRISPR/Cas9的知識產(chǎn)權(quán)問題

CRISPR/Cas9技術(shù)作為第三代基因組編輯技術(shù)，是現(xiàn)階段基因組編輯領(lǐng)域的熱點，被認(rèn)為是自20世紀(jì)70年代以來發(fā)明的重要性不亞于PCR技術(shù)的基因工程技術(shù)。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的開發(fā)及廣泛應(yīng)用，與其有關(guān)的專利大戰(zhàn)也拉開帷幕。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)的第一個專利于2014年由美國麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)Broad研究所的張峰團(tuán)隊獲得[12]，這一專利的保護(hù)范圍將一整套CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體和操作方法包括在內(nèi)。隨后張峰團(tuán)隊又逐漸獲批了10份相關(guān)的專利(附表2)。這些專利已被排他性地授予給美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部和Sigma-Aldrich公司，他們都有機會將CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)用于商業(yè)開發(fā)及動植物的改良等。

第一份CRISPR/Cas9系統(tǒng)的專利被批準(zhǔn)，引起了科學(xué)界極大震驚。其中美國加州伯克利大學(xué)的Jennifer Doudna和德國亥姆霍茲醫(yī)學(xué)研究中心的Emmanuelle Charpentier(兩人因CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)獲得2015年的生命科學(xué)突破獎)聲明她們最先發(fā)明了這一技術(shù)，并要求專利局重新考慮麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)Broad研究所獲得的有關(guān)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的專利。做出這一聲明的依據(jù)是她們最先報道利用CRISPR/Cas9技術(shù)來進(jìn)行基因組編輯[8]，并且也先于張峰團(tuán)隊遞交專利申請。而張峰則認(rèn)為他們才是首次證明CRISPR在人類細(xì)胞中起作用的團(tuán)隊[13]，而Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier團(tuán)隊只是猜測?，F(xiàn)在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的專利究竟在未來花落誰家還無從得知，不過可以肯定的是針對這一技術(shù)所產(chǎn)生的專利糾紛已經(jīng)減緩了它的商業(yè)化進(jìn)程。

3 對高校教育的啟示

以我們從美國專利商標(biāo)局調(diào)查得到的數(shù)據(jù)(附表1和附表2)和Srinivasan Chandrasegaran教授的統(tǒng)計結(jié)果[6]進(jìn)行整合，繪制了三大基因組編輯技術(shù)的專利區(qū)域分布圖(圖1)?？偟膩砜矗cZFN、TALEN及CRISPR/Cas9這3種基因組定向編輯技術(shù)相關(guān)的專利都集中在歐美的大學(xué)、研究院或公司。鮮有中國的學(xué)者或公司持有此類專利。從一方面來說，我國科研工作者的科研嗅覺及知識產(chǎn)權(quán)意識還有待加強；從另一方面來說，我國的生物技術(shù)公司也應(yīng)該加強對此類具有重大應(yīng)用開發(fā)前景專利的收購。通過對這三大基因組編輯技術(shù)有關(guān)的知識產(chǎn)權(quán)及相應(yīng)糾紛的概述，我們認(rèn)為國內(nèi)學(xué)者應(yīng)該做到以下3點：(1) 培養(yǎng)知識產(chǎn)權(quán)意識，重視專利申請；(2) 專利申請應(yīng)注重專利的保護(hù)范圍；(3) 注重成果轉(zhuǎn)化，敢于將基礎(chǔ)研究成果開發(fā)成商業(yè)應(yīng)用。

圖1 三大基因組編輯技術(shù)的專利區(qū)域分布圖

雖然我國重視大學(xué)生的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育，但不可否認(rèn)的是現(xiàn)階段高校更重視大學(xué)生創(chuàng)新教育，對創(chuàng)業(yè)教育特別是從創(chuàng)新走向創(chuàng)業(yè)的連貫性教育缺失。只有經(jīng)過了這一階段的培養(yǎng)，學(xué)生們才能更快地發(fā)現(xiàn)并抓住機遇，重視基礎(chǔ)研究的商業(yè)應(yīng)用?？偟膩碚f，對大學(xué)生進(jìn)行知識產(chǎn)權(quán)教育及培養(yǎng)他們對重大科技進(jìn)展的知識產(chǎn)權(quán)嗅覺是不可或缺的。而調(diào)查發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在大學(xué)的知識產(chǎn)權(quán)課堂面臨以下問題：教材匱乏、師資不足且學(xué)生興趣度不高。在這一背景下，要想增強大學(xué)生的知識產(chǎn)權(quán)意識，做到創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育的融合，就需要高校管理者和相應(yīng)的教師轉(zhuǎn)變思維：將灌輸性的知識產(chǎn)權(quán)課堂轉(zhuǎn)換為案例教學(xué)，以最新的具有沖擊力的案例吸引學(xué)生。這樣，大量圍繞最新生物技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)案例，解決了教材匱乏的問題；相應(yīng)的專業(yè)性案例由專業(yè)課老師講解，解決了師資不足的問題；有趣的、具有沖擊力的案例，解決了學(xué)生興趣度不高的問題。而3大基因組定向編輯技術(shù)的專利爭奪戰(zhàn)正是不可多得的良好素材。通過對ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9的知識產(chǎn)權(quán)的介紹，可以看到眾多生物公司及科技人才發(fā)現(xiàn)商機并抓住商機的過程，這對高校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育具有良好的啟示和指導(dǎo)作用。

附錄:附表見電子版www.chinagene.cn。

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Overview of patents on targeted genome editing technologies and their implications for innovation and entrepreneurship education in universities

Xiangyu Fan1, 2, Yanping Lin1, Guojian Liao3, Jianping Xie1

Zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease are important targeted genome editing technologies. They have great significance in scientific research and applications on aspects of functional genomics research, species improvement, disease prevention and gene therapy. There are past or ongoing disputes over ownership of the intellectual property behind every technology. In this review, we summarize the patents on these three targeted genome editing technologies in order to provide some reference for developing genome editing technologies with self-owned intellectual property rights and some implications for current innovation and entrepreneurship education in universities.

ZFN; TALEN; CRISPR/Cas; intellectual property

2015-06-03;

2015-08-12

重慶市教委研究生教改項目“全球視野高層次人才培養(yǎng)的區(qū)域性跨院校支撐平臺”(編號：YJG123104)，重慶市教委研究生優(yōu)質(zhì)課程《高級微生物學(xué)》，西南大學(xué)本科生教改項目(編號：2013JY201)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才資助計劃(編號：NCET-11-0703)，國家自然科學(xué)基金(編號：81371851, 81071316, 81271882, 81301394)和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(編號：XDJK2011D006, XDJK2012D011, XDJK2012D007, XDJK2013D003，XDJK2014D040)資助

樊祥宇，博士，講師。研究方向：噬菌體功能基因組學(xué)。E-mail: fxysnd@126.com

謝建平，博士，研究員。研究方向：人類重要致病菌的致病耐藥機理和新干預(yù)措施研發(fā)。Tel: 86-23-68367108; E-mail: georgex@swu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-263

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-8-12 16:05:02

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150812.1605.010.html

(責(zé)任編委: 吳強)