熊榮川　李明　田應(yīng)洲等

摘要：對采自貴州省興義市的華西雨蛙（Hyla gongshanensis）標(biāo)本進(jìn)行了線粒體16S rRNA基因擴(kuò)增，并用雙重單系法分析構(gòu)建了華西雨蛙各種群的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，該標(biāo)本屬華西雨蛙，群內(nèi)部分化為興義支系、云南曲靖支系和越南沙巴支系，而3個(gè)支系間相互聚類關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：華西雨蛙（Hyla gongshanensis）；16S rRNA基因；克??；分子鑒定

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4865-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.055

Abstract： The mitochondrial 16S rRNA of two Hyla gongshanensis samples from Xinyi city in Guizhou province was amplified and sequenced，the phylogenetic trees of various groups of H. gongshanensis was constructed using double monophyletic analyse. The results showed that this specimen was belonged to H. gongshanensis. H. gongshanensis recovered 3 lineages，including the Xinyi lineage， the Quqing lineage and the Sabah （Viet Nam） lineage， but the relationship among the three lineages was still unresolved.

Key words： Hyla gongshanensis； 16S rRNA gene； cloning； molecular identification

華西雨蛙（Hyla gongshanensis）隸屬于雨蛙科（Hylidae）雨蛙屬（Hyla），廣泛分布于中國四川、云南、貴州、湖南、廣西、廣東等地及印度和緬甸[1]。各地方種群間存在一定的形態(tài)差異，進(jìn)一步將其分成5個(gè)亞種[2，3]，即指名亞種、川西亞種、景東亞種、騰沖亞種和武陵亞種。貴州省境內(nèi)主要分布有景東亞種和武陵亞種兩個(gè)亞種，景東亞種主要分布于貴州省西部，武陵亞種主要分布于貴州省東北部。近年來，由于人為的農(nóng)田耕作環(huán)境的改變以及農(nóng)藥化肥的大量使用，種群數(shù)量大量減少，需要加強(qiáng)保護(hù)。

本研究利用華西雨蛙線粒體16S rRNA與其他華西雨蛙亞種同源基因進(jìn)行相似性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對華西雨蛙各地方種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

華西雨蛙標(biāo)本于2014年6月23～25日采自貴州省興義市下五屯鎮(zhèn)，2個(gè)成體（標(biāo)本號：LPSXY2014062308；LPSXY2014062501），保存于六盤水師范學(xué)院生命科學(xué)系標(biāo)本館。

1.2 目的基因片段的擴(kuò)增和序列測定

DNA模板的提取方法參照熊榮川等[4]的方法，擴(kuò)增引物為1對兩棲動物通用的線粒體16S rRNA片段擴(kuò)增引物P7/P8[5]，P7為上游引物：5-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3；P8為下游引物：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3。PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，總DNA模板2 μL（含10～100 ng），上、下游引物各2 μL（10 μmol/L），ddH2O補(bǔ)至50 μL。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)雙重單系法，對兩組16S rRNA基因數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。所測得的華西雨蛙16S rRNA基因序列經(jīng)過Blast比對獲得100條初步的參考序列，與待定基因序列一起構(gòu)成數(shù)據(jù)集A；經(jīng)過雙重單系法的篩選，得到5條系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的16S rRNA序列并與待定基因序列一起構(gòu)成數(shù)據(jù)集B（表1）。

對于數(shù)據(jù)集A，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)不預(yù)先設(shè)定外群，構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹。用MUSCLE[10]程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對，輔以人工校對。在jModelTest 2中篩選最適合該數(shù)據(jù)集序列演化模型以供最大似然法（Maximum likelihood，ML）分析。根據(jù)AIC標(biāo)準(zhǔn)，適合本數(shù)據(jù)集的模型為GTR+G+I，其中G=0.436，I= 0.487。使用FastTree[11]構(gòu)建最大似然樹（ML tree）。ML樹支持率大于70%，表明該支系關(guān)系得到充分解決；在50%～70%之間為弱支持，否則視為未解決[12]。

對于數(shù)據(jù)集B，以中國雨蛙作為外群，用ClustalW[13]程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對，輔以人工校對。為了對待定基因的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行更準(zhǔn)確判斷，對數(shù)據(jù)集B同時(shí)進(jìn)行最大似然法分析和貝葉斯分析。在jModelTest 2中篩選最適合該數(shù)據(jù)集序列演化模型以供最大似然法分析。根據(jù)AIC標(biāo)準(zhǔn)，適合本數(shù)據(jù)集的模型為GTR+G，其中G=0.32。使用MEGA6.0[14]構(gòu)建最大似然樹；以無根的鄰接樹為搜索起始樹，非參數(shù)自展抽樣次數(shù)設(shè)置為1 000。支持率大于70%，表明該支系關(guān)系得到充分解決；在50%～70%之間為弱支持，否則視為未解決[12]。

貝葉斯分析采用MrBayes 3.2[15]軟件，堿基替換模型設(shè)置為GTR+G+I。起始樹設(shè)為隨機(jī)樹，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法設(shè)置為4條鏈同時(shí)運(yùn)行1×106代，3條熱鏈1條冷鏈。每1 000代對系統(tǒng)樹進(jìn)行抽樣，最終得到1 000棵系統(tǒng)發(fā)育樹。將前250棵樹舍棄后，根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹（Consensus tree），并計(jì)算相關(guān)參數(shù)。以后驗(yàn)概率（Posterior probability，PP）來表示各分支的可信度（支持率），貝葉斯后驗(yàn)概率大于等于95%說明其支系支持率得到充分解決[16]。endprint

1.4 遺傳距離的計(jì)算

選用MEGA6.0[14]分析數(shù)據(jù)集B中各序列間差異，依據(jù)Kimura2-parameter模型計(jì)算兩兩序列間的遺傳距離以及主要支系間的平均遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得600 bp左右的基因片段。經(jīng)雙向測序并拼接，獲得長度分別為547 bp，核苷酸序列（GenBank登錄號：KP123603、KP123604），序列堿基組成存在明顯的偏向性：AT含量較高，GC含量較低。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

將所測得華西雨蛙16S rRNA基因序列進(jìn)行搜索比對，其與GenBank中的已有華西雨蛙序列相似度最高，搜索得到的100條同源序列與KP123603、KP123604構(gòu)成16S rRNA序列數(shù)據(jù)集A?；跀?shù)據(jù)集A構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖1），KP123603、KP123604與3條華西雨蛙同源序列聚為一個(gè)單系（華西雨蛙支系）。在其內(nèi)部，KP123603、KP123604以較低的最大似然率獨(dú)立為一個(gè)支系（圖1），進(jìn)一步與云南曲靖種群16S rRNA基因序列（KM271781）以及一未知序列（JQ621934）構(gòu)成單系，而該單系與越南種群構(gòu)成的華西雨蛙支系并沒有得到較高的最大似然支持率。

經(jīng)過雙重單系法篩選得到5條近緣16S rRNA序列與KP123603、KP123604構(gòu)成數(shù)據(jù)集B（表2），使用最大似然法及貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，內(nèi)群由3個(gè)支系構(gòu)成，其中貴州興義為一個(gè)獨(dú)立支系且支持率較高，與云南曲靖支系互為姊妹群但是支持率并不高，另外越南沙巴種群獨(dú)立為一個(gè)支系。

2.3 遺傳距離

基于16S rRNA序列的遺傳距離（表2）表明，貴州興義華西雨蛙與越南種群的遺傳距離最近（0.004），內(nèi)群各序列間的遺傳距離為0.008（0.000～0.012），內(nèi)外群間遺傳距離為0.030（0.023～0.036）。

3 小結(jié)與討論

華西雨蛙因其各地方種群間存在一定形態(tài)差異而被學(xué)者劃分為5個(gè)不同的亞種[2，3]，即指名亞種、川西亞種、景東亞種、騰沖亞種和武陵亞種。隨著現(xiàn)代DNA測序技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用特定DNA片段對生物進(jìn)行種類鑒定，已經(jīng)成為深入認(rèn)識生物種分類地位及種間親緣關(guān)系的一個(gè)重要手段，尤其是對于那些一直存在分類爭議的動物類群。本研究成功擴(kuò)增了貴州興義華西雨蛙的線粒體16S rRNA基因，經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育分析，其與華西雨蛙云南曲靖及越南沙巴的兩個(gè)種群聚為一個(gè)單系，因此應(yīng)該屬于華西雨蛙。

參考文獻(xiàn)：

[1] 費(fèi) 梁，胡淑琴，葉昌媛，等.中國動物志兩棲綱（中卷）無尾目[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[2] 沈猷慧.中國華西雨蛙一新亞種——華西雨蛙武陵亞種（無尾目：雨蛙科）[J].動物學(xué)研究，1997（2）：52-57.

[3] 利思敏，楊大同.華西雨蛙—新亞種描述[J].動物學(xué)研究，1985（1）：23-28.

[4] 熊榮川，田應(yīng)洲，李 松，等.貴州高原分布沼水蛙系統(tǒng)發(fā)育地位的初步研究[J].六盤水師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，26（4）：55-59.

[5] SIMONS C，F(xiàn)RATI F， BECKENBACH A， et al. Evolution， weighting， and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[J]. Annals of the Entomological Society of America， 1994， 87（6）： 651-701.

[6] YE L， ZHU C， YU D， et al. The complete mitochondrial genome of Hyla annectans（Anura： Hylidae）[J]. Mitochondrial DNA，2014，19：1-2.

[7] FAIVOVICH J， HADDAD C F B， GARCIA P C A， et al. Systematic review of the frog family Hylidae， with special reference to Hylinae： Phylogenetic analysis and taxonomic revision [J]. Bulletin of the American Museum of Natural History， 2005，294： 1-240.

[8] MARDIS E R. The impact of next-generation sequencing technology on genetics[J]. Trends in Genetics， 2008， 24（3）： 133.

[9] ZHANG， P， ZHOU H， CHEN Y Q， et al. Mitogenomic perspectives on the origin and phylogeny of living amphibians [J]. Systematic Biology， 2005， 54（3）： 391-400.

[10] EDGAR R C. MUSCLE： Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Research， 2004，32（5）：1792-1797.endprint

[11] PRICE M N， DEHAL P S， ARKIN A P. FastTree 2-approximately maximum-likelihood trees for large alignments[J]. PloS One， 2010， 5（3）： e9490.

[12] FOK A C， MOK S S， LEE S D， et al. ECplot： An online tool for making standardized plots from large datasets for bioinformatics publications [J]. Bioinformatics， 2014， 30（10）：1467-1468.

[13] LARKIN M， BLACKSHIELDS G， BROWN N， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics， 2007，23（21）：2947.

[14] TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6： Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[15] RONQUIST F， TESLENKO M， VAN D M P， et al. MrBayes 3.2： Efficient bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model Space[J]. Systematic Biology，2012，61（3）： 539-542.

[16] LEACH? A D， REEDER T W. Molecular systematics of the eastern fence lizard （Sceloporus undulatus）： A comparison of parsimony， likelihood， and Bayesian approaches [J]. Systematic Biology， 2002， 51（1）： 44-68.endprint