沈蕾，高斌，賀克武，肖衛(wèi)華

金納米棒聯(lián)合125I粒子誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

沈蕾，高斌，賀克武，肖衛(wèi)華

目的探討葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs@SiO2-FA）聯(lián)合125I粒子誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制，為臨床提高肝癌125I粒子組織間植入療效提供理論依據(jù)。方法將體外培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞隨機(jī)分成空白對(duì)照組，單純金納米棒組，單純125I粒子照射組及金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，PT-PCR檢測(cè)bax mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)水平，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2表達(dá)水平及腫瘤細(xì)胞核增殖性抗原Ki67表達(dá)情況。結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率，單純金納米棒組、單純125I粒子照射組較空白對(duì)照組均有升高（P＜0.05）；聯(lián)合組較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合組bax mRNA表達(dá)明顯高于單純金納米棒組與單純125I粒子照射組，bcl-2 mRNA表達(dá)明顯低于單純金納米棒組與單純125I粒子照射組。肝癌HepG2細(xì)胞bax表達(dá)于胞質(zhì)，bcl-2表達(dá)于胞質(zhì)和胞膜，Ki67表達(dá)于胞核，均表現(xiàn)為棕黃色細(xì)顆粒狀沉淀。4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2及增殖核抗原Ki67蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，Bcl-2、Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論金納米棒與125I粒子聯(lián)合應(yīng)用能更有效增加肝癌細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制可能是通過(guò)增加Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

金納米棒；125I粒子；肝癌；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2；Ki67

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第5位，死亡率居第3位［1］。我國(guó)是肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家，占所有癌癥死亡的第2位，僅次于肺癌［2］。因此，如何提高患者的生存率是臨床工作者亟待攻克的難題。放射性125I粒子組織間植入近距離照射治療肝癌已經(jīng)廣泛開展并顯示出良好療效，如CT引導(dǎo)下125I粒子組織間植入可誘導(dǎo)兔VX2腫瘤細(xì)胞凋亡［3］。金納米棒聯(lián)合放射性125I粒子對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的研究并不多見。本實(shí)驗(yàn)以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，重點(diǎn)探討金納米棒聯(lián)合125I粒子對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，為腫瘤的聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為肝癌的臨床治療開辟一條新路徑。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

肝癌HepG2細(xì)胞株（購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)）、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）、胎牛血清（四季青公司）、細(xì)胞凋亡試劑盒（貝博公司）、PCR相關(guān)試劑（Thermo公司）、bax抗體（Abcam公司）、bcl-2抗體（CST公司）、Ki67抗體（博士德公司）、DAB顯色試劑盒（中杉金橋）、流式細(xì)胞儀（FCM，BD公司）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）、紫外發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（天能公司）、125I粒子（欣科公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、單純金納米棒組、單純125I粒子照射組、金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組。空白對(duì)照組予正常培養(yǎng)；單純金納米棒組，給予終濃度為40 μg/ml的金納米棒；單純125I粒子照射組，距培養(yǎng)皿1 cm內(nèi)給予9粒放射性活度為0.8 mCi的125I粒子照射；聯(lián)合組，同時(shí)給予金納米棒和125I粒子。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，照射48 h后收集細(xì)胞。

1.2.2FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取各組HepG2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，2 000 r/min，離心5 min，棄上清液。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，冷PBS洗2遍。將細(xì)胞重懸于400 μl的Annexin V結(jié)合液中，加入10 μl Annexin V和5 μl PI染液，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)bax、bcl-2 mRNA表達(dá)收集各組細(xì)胞，提取RNA后進(jìn)行RT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參。GAPDH上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度258 bp。bax上游引物：5'-GCCCACCAGCTCTGAGCAGATCAT-3'；下游引物：5'-CGGCAATCATCCTCTGCAGC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度209 bp。bcl-2上游引物：5'-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3'；下游引物：5'-CAGGTGCCGGTTCAGGTACT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度225 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.4細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)bax、bcl-2、Ki67基因表達(dá)①制作細(xì)胞爬片：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化離心后以密度為2×10/ml接種于事先放好蓋玻片的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24 h。②處理方法：按上述分組方法干預(yù)細(xì)胞，48 h后處理細(xì)胞。③細(xì)胞免疫化學(xué)法：常規(guī)設(shè)立陰性對(duì)照。取出蓋玻片用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗5 min×3次；0.1%Triton× 100 4℃10 min，PBS洗5 min×3次；3%H2O2室溫孵10 min消除內(nèi)源性H2O2酶的活性，PBS洗5 min× 3次；滴加血清封閉液，室溫濕盒內(nèi)孵育30 min，封閉非特異性抗原；滴加抗體：傾去血清后直接滴加的一抗bax、bcl-2、Ki67（稀釋比例均為1∶100）使其完全覆蓋細(xì)胞，于4℃下過(guò)夜；PBS洗5 min×3次，加人生物素化羊抗兔IgG（1∶200），37℃，30 min，PBS洗5 min×3次；DAB顯色：每片滴加DAB 100 μl，顯微鏡下觀察3～5 min，至陽(yáng)性顯色明顯時(shí)用自來(lái)水沖洗，終止顯色。復(fù)染：用蘇木精復(fù)染約10 s，自來(lái)水充分沖洗。70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水。二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.2.5IHC結(jié)果判定bax陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，bcl-2陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)棕黃色顆粒。①定量分析：在光學(xué)顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取陽(yáng)性細(xì)胞分布均勻的10個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)分，＜5%（0分），5%～25%（1分），25%～50%（2分），50%～75%（3分），＞75%（4分）。②著色程度：陰性為未著色（0分），弱陽(yáng)性呈淡黃色（1分），中等陽(yáng)性呈黃色或深黃色（2分），強(qiáng)陽(yáng)性呈褐色或棕褐色（3分）。以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度分值的乘積作為每一例的積分［4］。

Ki67陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色細(xì)顆粒狀沉淀，每張切片觀察10個(gè)以上典型視野（高倍鏡下），至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。以棕色核染為陽(yáng)性細(xì)胞，其百分比為Ki-67細(xì)胞增殖指數(shù)（Ki-67 proliferation index，KI）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)資料采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；單純金納米棒組、單純125I粒子照射組及聯(lián)合組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1　4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表1　4組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較（±s）

組別例數(shù)細(xì)胞凋亡率（%）空白對(duì)照組105.91±1.52單純金納米棒組1010.16±3.18單純125I粒子照射組1020.78±4.79金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組1033.41±8.00 F值99.82 P值0.00

圖1　FCM檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況（A和B）

2.2RT-PCR檢測(cè)bax、bcl-2 mRNA表達(dá)

單純金納米棒組與單純125I粒子照射組的bax mRNA表達(dá)均高于空白對(duì)照組，聯(lián)合組bax mRNA表達(dá)明顯高于單純金納米棒組和單純125I粒子照射組。金納米棒組與單純125I粒子照射組的bcl-2 mRNA表達(dá)均低于空白對(duì)照組，聯(lián)合組bcl-2 mRNA表達(dá)明顯低于單純金納米棒組和單純125I粒子照射組。提示金納米棒與射線作用于肝癌HepG2細(xì)胞后bax mRNA的表達(dá)量增加，bcl-2 mRNA的表達(dá)量減低。見圖2。

2.3Bax、Bc1-2、Ki67蛋白在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

2.3.1Bax蛋白在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)空白對(duì)照組、單純金納米棒組、單純125I粒子照射組和聯(lián)合組染色陽(yáng)性的HepG2細(xì)胞Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)積分分別為0.95±0.18、1.51±0.44、4.29±0.86、7.55±1.40。聯(lián)合組與單純金納米棒組和單純125I粒子照射組比較，Bax蛋白表達(dá)增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3.2Bc1-2蛋白在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)空白對(duì)照組、單純金納米棒組、單純125I粒子照射組和聯(lián)合組染色陽(yáng)性的HepG2細(xì)胞Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)積分依次為9.01±1.02、8.39±0.47、3.81±1.28、1.70±0.83。聯(lián)合組與單純金納米棒組和單純125I粒子照射組比較，Bc1-2蛋白表達(dá)降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3.3IHC檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖相關(guān)抗原Ki67表達(dá)空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，多數(shù)細(xì)胞核被染成棕黃色；聯(lián)合組Ki67表達(dá)強(qiáng)度較單純125I粒子照射組和單純金納米棒組明顯減弱，細(xì)胞核呈淡染。4組KI之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2，圖3、4。

圖2　RT-PCR檢測(cè)金納米棒聯(lián)合125I粒子照射作用于肝癌HepG2細(xì)胞后bax、bcl-2、GAPDH mRNA表達(dá)

表2　4組肝癌HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2、KI蛋白表達(dá)情況

圖3　各組肝癌HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2、KI蛋白表達(dá)情況（SP×400）

圖4　各組肝癌HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2、KI蛋白表達(dá)情況

3　討論

目前，肝癌多采用綜合治療的手段，手術(shù)、放療、熱療等多種方法聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抗腫瘤起到協(xié)同作用［5-6］。外放療作為肝癌治療的常規(guī)手段，由于正常肝臟組織對(duì)放射線的耐受量限制了肝癌照射量的提升，因此肝癌外放療效果欠佳。125I粒子植入近距離治療不同于外放療，125I粒子具有在組織局部劑量最高、近籽源處劑量較高、周圍組織劑量陡降等特性，經(jīng)過(guò)足夠的劑量和半衰期持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞，使腫瘤組織損傷較為徹底。但125I粒子植入屬于人工操作，難免存在冷點(diǎn)［7］，通過(guò)放射增敏的辦法，旨在達(dá)到完全適形放射治療。

本實(shí)驗(yàn)采用的金納米棒可作為放射治療領(lǐng)域中一類新型的放射增敏劑［8］，其機(jī)制主要是金納米棒中的金元素具有高的原子序數(shù)［9-10］，且金納米棒的尺寸遠(yuǎn)大于金原子，其光電吸收截面積遠(yuǎn)超越金原子［11］，都致使其在腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生較周圍正常組織強(qiáng)的光電吸收效應(yīng)。另外，金納米棒表面等離子共振特性即當(dāng)光入射時(shí)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有強(qiáng)的光吸收能力，增強(qiáng)的光吸收量也可有效增強(qiáng)腫瘤組織的吸收劑量。金納米棒聯(lián)合射線照射后則產(chǎn)生更強(qiáng)的光電吸收效應(yīng)，加速DNA鏈斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。

細(xì)胞凋亡是一種多基因參與的調(diào)控機(jī)制，凋亡基因與抗凋亡基因的相互協(xié)調(diào)作用決定了凋亡的啟動(dòng)或抑制。目前研究最深入的一對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因是bax和bcl-2［13］。bax基因最早是在人前B細(xì)胞基因庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物主要定位于胞質(zhì)中，具有拮抗Bcl-2蛋白的作用，還有直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。bcl-2基因最初是在濾泡性B細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物主要定位于胞膜，具有抑制凋亡蛋白的功能。大量研究顯示，bax/bcl-2比值決定細(xì)胞的生或死，bax/bcl-2升高，細(xì)胞接受凋亡信號(hào)刺激發(fā)生凋亡；bax/bcl-2降低細(xì)胞不凋亡［14］。有學(xué)者采用香芹酚、苦參堿等藥物誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的體外研究，通過(guò)線粒體途徑上調(diào)Bax蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平，升高bax/bcl-2比值來(lái)治療肝癌［15-16］。Ki67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖核抗原，可作為肝癌治愈率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［17］，Ki67表達(dá)減少表明腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制。

本研究結(jié)果表明，單純金納米棒組、單純125I粒子照射組、金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組與空白對(duì)照組相比，肝癌HepG2細(xì)胞Bax表達(dá)增加，Bcl-2、Ki67表達(dá)降低，說(shuō)明金納米棒與125I粒子二者單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用時(shí)均能增加肝癌HepG2細(xì)胞Bax的表達(dá)同時(shí)降低Bcl-2、Ki67的表達(dá)。金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組與125I粒子照射組相比，Bax表達(dá)增加更顯著，Bcl-2、Ki67表達(dá)降低更顯著。

綜上所述，在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)金納米棒聯(lián)合125I粒子具有明顯的協(xié)同抗腫瘤效果，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金納米棒聯(lián)合125I粒子的研究尚不多見。本實(shí)驗(yàn)在分子水平上為金納米棒聯(lián)合125I粒子治療肝癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其明確的生物學(xué)機(jī)制尚待更深入研究。

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Apoptosis of hepatoma cell line HepG2induced by the combination use of GNRs@SiO2-FA and125Iseeds：an experimental study

SHEN Lei，GAO Bin，HE Ke-wu，XIAO Wei-hua.Medical Imaging Center，Third Affiliated Hospital，Anhui Medical University，Hefei，Anhui Province 230061，China

GAO Bin，E-mail：gaobin_3136@163.com

ObjectiveTo explore the possible mechanism of the apoptosis of hepatoma cell line HepG2induced by the combination use of GNRs@SiO2-FA and125I seeds and to discuss its relationship with Bcl-2 and Bax protein expressions so as to provide theoretical basis for clinical treatment of hepatic cancer with interstitial brachytherapy by using125I seeds.MethodsIn vitro cultured HepG2cells were randomly divided into 4 groups：blank control group（not treated），simple GNRs@SiO2-FA group，simple125I seeds group，and combination group（GNRs@SiO2-FA plus125I seeds）.The apoptosis of HepG2cells was determined by flow cytometry.The expression of Bax mRNA and Bcl-2 mRNA of HepG2cells were tested by RT-PCR. The apoptosis-related genes（Bax and Bcl-2）and the tumor proliferation cell nuclear antigen（Ki67）proteins expression on HepG2cells were examined with immunohistochemistry method.ResultsThe flow cytometry examination showed that the apoptosis rate of HepG2cells in the simple GNRs@SiO2-FA group and simple125I seeds group was higher than that in blank control group（P＜0.05），and the apoptosis rate of the combination group was significantly higher than that of the simple GNRs@SiO2-FA group and the simple125I seeds group（P＜0.05）.The expression level of Bax mRNA in the combination group was higher than that in the simpleGNRs@SiO2-FA group and simple125I seeds group，while the expression level of Bcl-2 mRNA in the combination group was obviously lower than that in the simple GNRs@SiO2-FA group and simple125I seeds group.Bax protein was expressed on cytoplasm，Bcl-2 protein was expressed on cytoplasm and cell membrane，while Ki67 protein was expressed on nucleus.All of them presented as brown finely granular precipitations.Statistically significant differences in the amount of Bax，Bcl-2 and Ki67 protein expression existed between each other among the four groups（P＜0.05）.The positive expression rate of Bax protein in the combination group was significantly higher than that of the simple GNRs@SiO2-FA group and the simple125I seeds group，while the positive expression rate of Bcl-2 and Ki67 protein was significantly lower than that of the simple GNRs@SiO2-FA group and the simple125I seeds group，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe combination use of GNRs@SiO2-FA and125I seeds can more effectively induce the apoptosis of HepG2cells.This effect may be accomplished through increasing the expression of Bax protein and inhibiting the expression of Bcl-2 and Ki67 proteins.（J Intervent Radiol，2015，24：236-241）

gold nanorod；125I seed；hepatocarcinoma；apoptosis；Bax；Bcl-2；Ki67

R735.7

A

1008-794X（2015）-03-0236-06

2014-09-05）

（本文編輯：李欣）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.03.013

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81071240）

230061合肥安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院影像中心（沈蕾、高斌、賀克武）；中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院（肖衛(wèi)華）

高斌E-mail：gaobin_3136@163.com