張曉龍肖靜王瑞明汪俊卿王興吉王正祥

（1. 齊魯工業(yè)大學生物工程學院 山東省微生物重點實驗室，濟南 250353；2. 山東隆利特酶制劑有限公司，臨沂 276000；3. 天津科技大學，天津 300222）

共表達透明顫菌血紅蛋白對畢赤酵母產β-甘露聚糖酶發(fā)酵過程的影響

張曉龍1肖靜1王瑞明1汪俊卿1王興吉2王正祥3

（1. 齊魯工業(yè)大學生物工程學院 山東省微生物重點實驗室，濟南 250353；2. 山東隆利特酶制劑有限公司，臨沂 276000；3. 天津科技大學，天津 300222）

為了改善高密度發(fā)酵生產β-甘露聚糖酶過程中的溶氧限制，提高β-甘露聚糖酶產量，將VHb和β-甘露聚糖酶基因置于AOX1啟動子調控之下，進行VHb和β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的共表達。經(jīng)密碼子優(yōu)化合成VHb基因，插入表達載體pPICZαA，整合到β-甘露聚糖酶工程菌中，通過G418和Zeocin抗性篩選共表達VHb基因的重組酵母工程菌。在30 L發(fā)酵罐水平上分析共表達VHb菌株（VHb+）與初始菌株（VHb-）對β-甘露聚糖酶表達的差異。結果顯示，限氧條件下，VHb+菌株的β-甘露聚糖酶的表達量比對照菌株VH b-高90%，且透明顫菌血紅蛋白提高了甲醇耐受性，縮短發(fā)酵周期約40 h。

透明顫菌血紅蛋白；β-甘露聚糖酶；畢赤酵母；高密度發(fā)酵表達

畢赤酵母表達系統(tǒng)作為目前應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，已有約500種外源蛋白獲得成功表達，畢赤酵母工業(yè)化生產中通常進行高密度發(fā)酵，細胞密度隨著發(fā)酵時間的延長不斷增加，氧氣在發(fā)酵液中的溶解度和傳質效率逐步降低，使得溶氧控制成為影響畢赤酵母高表達目的蛋白的重要因素，而用于通氣和攪拌的能耗已占畢赤酵母發(fā)酵成本的50%以上，又使得該工程菌發(fā)酵成為高能耗項目。通常在工業(yè)化生產中，通過改善發(fā)酵罐通氣管道設計、罐壓以及通純氧來提高溶氧量，但現(xiàn)有工藝極限供氧傳輸速率約為500 mmol/（L·h），難以滿足畢赤酵母高達2 000 mmol/（L·h）的需氧量［1］。另一方面，雖然較低的甲醇流加速率（5 mL/（L·h））可以降低需氧量，但過長的發(fā)酵周期（150 h以上）又極大的增加了發(fā)酵成本。

透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是一種專性好氧的革蘭氏陰性絲狀菌在低氧環(huán)境中產生的一種分子量約為15.8 kD的可溶性蛋白，具有較高的氧吸附和解離速率常數(shù)［2］。在畢赤酵母中共表達目的蛋白和VHb是改善高密度發(fā)酵過程中溶氧限制的一種有效方式，已在多種宿主中成功表達，提高代謝物產率［3］。同時，有研究表明，VHb在畢赤酵母中的表達不僅能提高氧的利用率和S-腺苷甲硫氨酸的產率，還能促進ATP合成，增強甲醇代謝活性［4］。VHb基因在各種表達系統(tǒng)中均有重要應用，如在大腸桿菌中，Khosravi等［5］發(fā)現(xiàn)將VHb基因在大腸桿菌中共表達時，可使細胞密度提高1.4倍，α-淀粉酶的產量提高3.3倍；在酵母表達系統(tǒng)中，1944年Wilfred等在Biotechnical Prog上發(fā)表了VHb在酵母中的應用研究結果，并進一步研究了它對好樣代謝的影響，并證明VHb在酵母中主要存在于細胞質中；在畢赤酵母中應用尤其廣泛。王清路等［6］在畢赤酵母中以Ppic9K為研究對象，轉化GS115后，經(jīng)發(fā)酵驗證在貧氧條件下可以明顯促進酵母菌體生長和目的基因的分泌表達；在霉菌中，李兵等［7］將VHb基因構建至表達載體pMK4-LV，并轉化產黃青霉的原生質體，獲得轉化子后發(fā)酵表明，VHb的表達使得生物量提高9.76%，青霉素的產量提高9.68%。

β-甘露聚糖酶可降解飼料中含有的甘露聚糖，有助于解除甘露聚糖對機體胰島素分泌和胰島素樣生長因子生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收效率，是一種優(yōu)良的飼料添加［8］。本課題組前期通過篩選高表達基因以及工程菌構建，優(yōu)化發(fā)酵條件等方法，使β-甘露聚糖酶在30 L發(fā)酵罐水平達到29 600 U/mL，達到工業(yè)化生產要求。但為從根源解決畢赤酵母發(fā)酵工業(yè)生產中溶氧限制、發(fā)酵周期長等問題，本實驗將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的透明顫菌血紅蛋白基因（VHb）導入β-甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌中，使VHb和β-甘露聚糖酶都在AOX1啟動子下表達，并通過30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，討論限氧條件下共表達VHb蛋白對畢赤酵母產β-甘露聚糖酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 β-甘露聚糖酶表達菌株Pichia pastoris GS115/Ppic9K-β-MAN、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和質粒pPICZαA均由本實驗室保存，VHb基因以及相關引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶AsuⅡ、NotⅠ、SacⅠ、T4DNA連接酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；G418和Zeocin購自上海生工生物工程有限公司；蛋白分子量標準購自賽默飛世爾科技公司，核酸分子量標準、EasyPfu DNA Polymerase、酵母基因組提取試劑盒、質粒小量抽提試劑盒、純化試劑盒等購自北京全式金生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L；YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%、KH2PO45 g/L、CaSO43 g/L、K2SO415 g/L、MgSO415 g/L、NH4H2PO435 g/L、KOH 4.2 g/L、12 mL/L微量元素；分批補料培養(yǎng)基：50%甘油（W/V）（含12 mL/L微量元素）；誘導劑：100%甲醇（含12 mL/L微量元素）；補料培養(yǎng)基：NH4H2PO4200 g、CaSO420 g、K2SO4100 g、MgSO4100 g，定容至2 L；微量元素溶液：參照Invitrogen表達手冊。

1.2 方法

1.2.1 VHb密碼子優(yōu)化與引物設計 根據(jù)已經(jīng)報道的VHb蛋白的氨基酸序列（GenBank：AF274976），VHb蛋白共有441 bp，編碼147個氨基酸，結合畢赤酵母密碼子的偏愛性，使用CodonW軟件包和RNAstructure分析基因序列，進行密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化后的VHb基因提交NCBI數(shù)據(jù)庫（登錄號：KM108313）。

使用Primer Premier 5、Oligo7.0軟件進行引物設計、分析，設計引物：

F1：5'-AGTTCGAAACGATGTTGGACCAG-3'（引入AsuⅡ酶切位點），

F2：5'-TAAAGCGGCCGCCTACTCAACAGCCT GG-3'（引入NotⅠ酶切位點）。

1.2.2 重組質粒的構建與轉化 以上海生工生物工程有限公司合成基因序列為模板，F(xiàn)1與F2為引物，進行目的片段的PCR擴增?；驍U增條件為：94℃預變性5 min，94℃ 30 s，54℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)30次，72℃后延伸10 min。將PCR擴增得到的目的片段純化、雙酶切，并與經(jīng)過同樣雙酶切處理表達載體pPICZαA連接，轉化感受態(tài)大腸DH5α，利用Zeocin（100 μg/mL）篩選抗性菌落，PCR鑒定重組質粒，且送交上海生工生物工程有限公司測序，測序正確后得到重組質粒pPICZαA -VHb。重組質粒別分經(jīng)SacⅠ線性化后，電擊轉化至GM115中。

1.2.3 重組菌株的篩選和搖瓶復篩 將電擊轉化產物涂布于含100、200、300 μg/mL的Zeocin梯度YPD平板（且含500 μg/mL的G418），30℃培養(yǎng)3-4 d，至菌落出現(xiàn)。原始菌株為非Zeocin抗性，只有重組質粒pPICZαA -VHb整合入GM115基因組中，才能在含有Zeocin和G418的抗性YPD平板上生長。從平板上挑取重組工程菌，使用TaKaRa的lysis buffer提取酵母基因組，以F1、F2為引物進行菌落PCR，條件為：94℃預變性10 min，94℃ 30 s，54℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)30次，72℃后延伸10 min。

挑取經(jīng)PCR驗證正確的重組菌株，接種至YPD液體搖瓶培養(yǎng)基中，30℃、240 r/min，培養(yǎng)至OD600≈8.0，按10%接種量接入發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，28℃，240 r/min培養(yǎng)24-30 h，初始碳源耗盡后，補充1 mL 50%甘油，甘油耗盡后饑餓培養(yǎng)0.5 h，每24 h補充100%甲醇1.5 mL，發(fā)酵120 h，取上清測定β-甘露聚糖酶酶活力，篩選高表達菌株進行30 L發(fā)酵罐放大實驗。

1.2.4 30 L發(fā)酵罐放大試驗 發(fā)酵罐裝液量60%，控制pH5.5，YPD種子罐移種后，調節(jié)轉速400 r/min、溫度30℃、空氣流量1 m3/h、罐壓0.05 MPa，進行分批發(fā)酵，基礎培養(yǎng)基中碳源耗盡后，DO值急速上升，此時以15 mL/（L·h）速度流加50%甘油（W/V，含12 mL/L的PTM1），穩(wěn)定罐壓為0.08 MPa，調節(jié)通氣量、攪拌速度控制溶氧為20%左右。

當菌體濃度達到30 g/L左右時，停止流加甘油，饑餓40 min，耗盡細胞內殘留的甘油。誘導階段采取連續(xù)補料方式添加甲醇（含12 mL/L的PTM1），初始流加速度為1 mL/（L·h），之后每小時增加一個單位，直至添加量為10 mL/（L·h）后，調節(jié)轉速為800 r/min、溫度28.5℃、空氣流量4-6 m3/h、罐壓0.1 MPa，同時離線檢測甲醇濃度在0.08%±0.02（V/V）左右，控制DO為10%-20%，誘導β-甘露聚糖酶基因表達。

1.2.5 β-甘露聚糖酶酶活測定方法 采用DNS法測酶活力，酶活力單位定義：在37℃、pH5.5的條件下，每分鐘從濃度3 mg/mL的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.6 細胞質量濃度測定方法 細胞干質量（80℃烘干）與發(fā)酵液體積之比即為細胞質量濃度，根據(jù)測量數(shù)值繪制線性回歸曲線，細胞干重與OD600的關系為：DCW=0.226OD600+0.017（R2=0.989 2）。

1.2.7 VHb表達產物活性檢測方法采用CO-差示光譜法檢測［9］。

2 結果

2.1 VHb基因PCR擴增產物及重組克隆質粒的鑒定

VHb基因PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約460 bp處可見特異的DNA條帶，大小與預期相符（圖1）。重組表達質粒pPICZαA-VHb雙酶切產物（AsuⅡ、NotⅠ）經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見與目的基因大小相符的目的條帶（圖2），且測序結果與人工合成的基因序列一致，表明重組質粒構建正確。

2.2 胞內VHb蛋白表達的鑒定

甲醇誘導5 d后，離心取菌體，采用玻璃珠法，破碎細胞提取胞內總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，可見相對分子量約16 kD的VHb特異性條帶（圖3），大小與預期相符，說明VHb在畢赤酵母內成功表達。

圖1 VHb基因擴增產物電泳圖

圖2 重組表達質粒的PCR及雙酶切鑒定

圖3 胞內VHb蛋白表達的SDS-PAGE分析

圖4 CO-差示光譜

2.3 胞內VHb蛋白活性的檢測

經(jīng)甲醇誘導培養(yǎng)VHb重組酵母和原始菌株，收集菌體，破碎提取胞內蛋白，分別對兩個樣品作CO-差示光譜分析，結果見圖4。VHb重組菌的CO-差示光譜圖為典型的VHb特征曲線，而原始對照菌的CO-差示光譜圖為一條在420 nm處無特殊吸收峰的平緩曲線，表明VHb重組畢赤酵母表達的透明顫菌血紅蛋白具有正常的生物活性。

2.4 低溶氧條件下VHb對高密度發(fā)酵產β-甘露聚糖酶的影響

為了考察低溶氧條件下VHb對高密度產β-甘露聚糖酶的影響，在30 L發(fā)酵罐中，調節(jié)轉速及罐壓控制溶氧在10%±5%，其他條件不變，進行發(fā)酵研究。由圖5可知，在低溶氧條件下，共表達VHb工程菌與原始菌株相比β-甘露聚糖酶表達量有明顯提高。VHb重組菌在發(fā)酵96 h后，酶蛋白表達量增速明顯，而對照菌株增速緩慢，發(fā)酵132 h后，共表達VHb工程菌的菌體濃度和酶活力達到最高值，為130 g/L和29 900 U/mL，分別是原始菌株的1.3倍、1.9倍。

圖5 低溶氧條件下VHb對菌體生長和酶活力的影響

2.5 甲醇添加量對VHb重組菌產β-甘露聚糖酶的影響

在不同甲醇補料量下，通過搖瓶考察了VHb基因對畢赤酵母產β-甘露聚糖酶的影響，結果如圖6所示。每天補充甲醇1%時，VHb重組的最高菌體量和酶活與原始菌株一致，但隨著甲醇補料量的增加，VHb重組菌在2%甲醇添加量下，最高菌體量和酶活并未出現(xiàn)受抑制現(xiàn)象，而原始菌株則下降50%以上，當甲醇補料量增至每天3%時，VHb重組菌和原始菌株菌體量和酶活均出現(xiàn)大幅下降。

圖6 甲醇添加量對VHb重組菌、原始菌生長以及產β-甘露聚糖酶的影響

甲醇誘導階段采取連續(xù)補料方式添加甲醇（含12 mL/L的PTM1），初始流加速度為6 mL/（L·h），之后每小時增加3個單位，直至添加量為15 mL/（L·h），維持高甲醇流加速度至發(fā)酵結束，其余條件保持不變。誘導表達階段提高甲醇流加速度一方面會促進酵母菌加速繁殖，提高目的產物表達；另一方面，過高的甲醇流加速度會對細胞造成毒害作用，進而影響發(fā)酵過程。如圖7所示，原始菌株限于高甲醇的毒副作用，菌體量和酶活嚴重下降，而VHb重組菌同搖瓶驗證結論相同，耐甲醇能力顯著提高。同時，得益于高甲醇添加量，VHb重組菌發(fā)酵96 h后，菌體量和酶活達到最高值，分別為129 g/L和28 500 U/mL，與低甲醇補料下相比沒有大幅度波動，但發(fā)酵時間縮短約40 h。

圖7 30 L發(fā)酵罐中高甲醇添加量對VHb重組菌、原始菌生長以及產β-甘露聚糖酶的影響

3 討論

β-甘露聚糖酶在動物飼料業(yè)具有廣闊的應用前景，畢赤酵母作為成熟的商業(yè)菌株，便于大規(guī)模高密度發(fā)酵以及外源蛋白的高表達，而溶氧限制卻成為畢赤酵母高密度發(fā)酵的瓶頸，已有眾多學者致力于解決發(fā)酵供氧問題。在工藝設備方面，盡量提高攪拌速率、通氣量、罐壓、優(yōu)化通氣系統(tǒng)設計、使用空氣與氧氣的混合氣等［10］，但優(yōu)化工藝并不能從根本上解決溶氧限制問題，更難以解決100 m3規(guī)模以上發(fā)酵罐中由于溶氧分布不均導致的低溶氧和溶氧波動問題，因此眾多學者嘗試在工程菌中引入透明顫菌血紅蛋白共表達的方法，提高重組細胞對氧的利用率、促進細胞生長、改善細胞的表達量、降低發(fā)酵過程的動力成本［11］。在工業(yè)化的基因工程菌中，酵母是更易于工業(yè)化及表達更優(yōu)越的系統(tǒng)，VHb在酵母中的成功應用，無疑對微生物發(fā)酵行業(yè)有著深遠的影響，而對于畢赤酵母高密度發(fā)酵而言，孟志剛等［12］報道其可使得酵母生長速度表快，細胞密度增加等，這對于提高發(fā)酵效率，縮短發(fā)酵周期有著重要工業(yè)化價值。另一方面，唐輝桂等［13］的研究卻表明VHb對宿主細胞的生長沒有明顯影響，但是卻使植酸酶活性提高了3倍。而本研究表明VHb菌株對菌體濃度有一定影響，但酶活力沒有提升，但是宿主菌對甲醇的耐受能力得到了提高，這使得發(fā)酵周期可以進一步縮短。綜上，VHb對不同工程菌影響效果不一，在對VHb作用機制尚不完全了解的前提下，目前公認的VHb的作用機制主要在兩方面：其一是清除對細胞生長不利的自由氧與NO，其二是促進氧的擴散，提高細胞對溶氧的利用，而最近報道它與細胞膜脂可能才在一定的相互作用［14］。

在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，透明顫菌血紅蛋白的啟動子有多種選擇，應用AOX1強啟動子［15］和PsADH2低氧壓力啟動子［16］均有促進外源蛋白表達的報道，根據(jù)前期試驗數(shù)據(jù)，該工程菌在正常溶氧下外源蛋白表達量已經(jīng)達到10.9 g/L，在畢赤酵母系統(tǒng)中已屬較高水平。因此為了降低動力消耗以縮減成本，以及通過控制低溶氧水平以獲得盡可能快的甲醇補料速度，本實驗計劃在整個發(fā)酵中采用低溶氧條件發(fā)酵，這就要求在整個發(fā)酵過程中血紅蛋白應在誘導期連續(xù)表達，因此選擇AOX1強啟動子在低氧水平下與目的蛋白同時表達，以期最大程度縮短發(fā)酵周期。

在低甲醇濃度下共表達VHb菌與原始菌株相比生長情況并無區(qū)別，此時畢赤酵母菌體量已達130 g/L，接近畢赤酵母表達系統(tǒng)菌體濃度的峰值，由此說明VHb的胞內表達對宿主的生長并沒有明顯的促進作用，結果見圖6（1%甲醇組），這也與唐輝桂［13］和盧俊裕［17］等的報道相一致。酶蛋白表達方面，Hu等［18］發(fā)現(xiàn)，誘導型Pichia pastoris進入甲醇誘導期后，胞內ATP供應不足成為蛋白合成的主要限制性因素，而Chen等［19］的研究則表明VHb的表達雖然對ATP水平影響不明顯，但能提高ATP的合成速率達1.68倍，因此Chen等猜測VHb可能對和氧有關的代謝途徑的產物有直接的作用。圖6、圖7也表明高甲醇濃度下，VHb共表達菌株酶蛋白表達速率明顯較高，高效的ATP合成速率可以促進細胞的呼吸［20］，提高能量代謝水平，加快了畢赤酵母目的蛋白的表達速率。誘導期高甲醇濃度條件下，由于甲醇濃度較高致使細胞內產生大量的甲醇及過氧化氫，從而導致細胞的死亡［21］，但本實驗中共表達VHb工程菌耐甲醇能力明顯提高，這可能與VHb的抗氧化脅迫性質有關［22］，VHb蛋白具有的高氧吸附和解離速率常數(shù)［2］，提高了氧氣的利用效率，提高了畢赤酵母對甲醇的耐受性。

在不同甲醇添加量下，通過30 L發(fā)酵罐對比考察了共表達VHb工程菌和原始菌株的生長與β-甘露聚糖酶的合成情況，如圖5中，在低甲醇濃度下，兩株菌均在發(fā)酵130 h左右達到菌體濃度和酶蛋白的峰值，而圖7中在高甲醇濃度下，共表達VHb工程菌在96 h左右便達到峰值，發(fā)酵周期縮短近40 h，根據(jù)Mayson［23］、Hong等［24］的研究，誘導期盡量提高甲醇補料速度有助于菌體生長和酶蛋白的表達，而共表達VHb工程菌較高耐甲醇能力又極大的縮短了發(fā)酵周期。

4 結論

本研究將密碼子優(yōu)化后的VHb基因，構建到表達β-甘露聚糖酶的畢赤酵母中，共表達VHb基因能明顯提高畢赤酵母對甲醇的耐受性，當控制溶氧10%±5%，甲醇流加速度維持為15 mL/（L·h）時，使得β-甘露聚糖酶酶活力未有明顯變化，但發(fā)酵周期降至96 h，縮短約40 h，在動力成本占到總成本約50%以上的畢赤酵母高密度發(fā)酵生產中。

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（責任編輯 李楠）

Effect of Co-expression of Vitreoscilla Hemoglobin on Expression of β-mannanase in Pichia pastoris

Zhang Xiaolong1Xiao Jing1Wang Ruiming1Wang Junqing1Wang Xingji2Wang Zhengxiang3
（1. Institute of Biological Engineering of Qilu University of Technology，Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering，Jinan 250353，2. Linyi Longkete Enzyme Preparation Co. Ltd，Linyi 276000，3. Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300222）

In order to improve the limitation of dissolved oxygen and increase β-mannanase production in the process of high-density fermentation， the β-mannanase gene and Vitreoscilla hemoglobin gene（VHb）were co-expressed in Pichia pastoris under the control of AOX1 promoter. The VHb gene was synthesized by codon optimization and inserted into expression vector pPICZαA， then integrated into the engineering bacterium of β-mannanase gene， P. pastoris GS115/Ppic9K-β-MAN. The recombinant P. pastoris of co-expressing VHb was selected by G418 and Zeocin resistance screening. Finally， the discrepancies in β-mannanase expression between the co-expressed strain VHb+and initial strain VHb-were analyzed in 30 L fermenter. The results showed as below， compared with the controlled strain， the expression of β-mannanase by VHb+strain was increased by 90% under oxygen-limited condition. Furthermore， Vitreoscilla hemoglobin was improved on the methanol tolerance， and fermentation period was shorted about 40 h， which could be an important industrial value.

Vitreoscilla hemoglobin；β-mannanase；Pichia pastoris；high-density fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.028

2015-04-23

山東省輕工生物基產品清潔生產與煉制協(xié)同創(chuàng)新中心項目（03082001）

張曉龍，男，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物酶技術；E-mail：qingshuang0302@163.com

肖靜，女，博士，副教授、研究生導師，研究方向：微生物酶技術；E-mail：xiaojing8168@163.com