高穎暉周萬紅竇鵬戚一曼王敦

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲研究所，楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)體育部，楊凌 712100）

九香蟲醇提物對運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表達(dá)水平的影響

高穎暉1，2周萬紅1，2竇鵬1戚一曼1王敦1

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲研究所，楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)體育部，楊凌 712100）

旨在探討補(bǔ)充九香蟲醇提物對運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表達(dá)水平的影響。對大負(fù)荷游泳訓(xùn)練大鼠補(bǔ)充劑量分別為各組平均體重的0.5、1.0和1.5 g/kg的九香蟲提取物，在8周大負(fù)荷訓(xùn)練結(jié)束后測定骨骼肌抗氧化酶活性與表達(dá)水平。8周大負(fù)荷訓(xùn)練后，相比單純大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，補(bǔ)充九香蟲提取物組SOD、CAT、GST三種抗氧化酶活性均顯著增加，同時(shí)3種酶的編碼基因表達(dá)水平也顯著上調(diào)。說明補(bǔ)充九香蟲提取物提高運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶系活性的機(jī)理之一是上調(diào)了編碼基因的表達(dá)水平。

九香蟲提取物；運(yùn)動(dòng)大鼠；骨骼肌抗氧化酶；表達(dá)水平；酶活性

九香蟲（Aspongopus chinensis）是常用的昆蟲源中藥材，屬于昆蟲綱、半翅目、蝽科，其生藥為干燥的成蟲蟲體。九香蟲在中醫(yī)中是一味常見的處方藥，其藥用記載最早見《本草綱目》中對其的藥效描述“治脘膈氣滯、脾腎虧損，壯元陽”［1］。目前，九香蟲在中藥中常用于治療胃寒脹痛、肝胃氣痛、腎虛陽痿和腰膝酸痛等疾病［2］。近些年隨著科技的進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)九香蟲體內(nèi)的一些藥用成分不僅對一些疑難病癥具有良好的治療作用，而且能促進(jìn)機(jī)體新陳代謝、抗癌等作用；豐富的營養(yǎng)成分還具有很好的食療滋補(bǔ)作用［3-7］。迄今，對于其上述藥理作用尚無系統(tǒng)的研究報(bào)道。我們在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，九香蟲醇提物能顯著增強(qiáng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉抗氧化酶活性，以及清除肌肉組織中過氧化物等作用［8］。本研究在我們前期研究基礎(chǔ)上，以運(yùn)動(dòng)大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，進(jìn)一步探討九香蟲醇提物對運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶的影響及其分子機(jī)制，旨在為深入理解昆蟲藥物的藥理學(xué)和研發(fā)新的運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)補(bǔ)劑提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 供試動(dòng)物為雄性SD大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，一共50只，平均體重約240 g。大鼠被隨機(jī)分為5組進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)在22-24℃常溫條件下進(jìn)行，室內(nèi)通風(fēng)、自然光照。大鼠自由飲水進(jìn)食、標(biāo)準(zhǔn)混合飼料喂養(yǎng)。1.1.2 昆蟲材料與浸膏制備 供試九香蟲A. chinensis生藥材購自西安中藥材交易中心。將購回的九香蟲材料于干燥箱中60℃干燥8 h，然后粉碎、過篩（20目），最后均勻混和后密封4℃冷藏保存。粉碎的九香蟲材料用常溫常壓冷浸法［8，9］提取，萃取液旋蒸獲得浸膏。浸膏溶解于分析純酒精中，配制成濃度為1.0 g/mL的溶液，2℃保存。

1.2 方法

1.2.1 訓(xùn)練方法 適應(yīng)性飼喂2周后，5組大鼠剔除生長不良和體重偏差較大的個(gè)體，重新隨機(jī)分為4組，參考任啟俊等［8］的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練內(nèi)容為：第1周適應(yīng)性游泳60 min，第2周逐漸增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間至150 min，每周訓(xùn)練6 d，共持續(xù)8周。4組處理中飼喂九香蟲提取物的為3組，在每次訓(xùn)練后灌服該提取物劑量分別為各組平均體重的0.5、1.0和2.0 g/kg；大負(fù)荷訓(xùn)練對照組（CK）1組，每次訓(xùn)練后灌服5%乙醇水溶液安慰劑10 mL。第8周訓(xùn)練結(jié)束后，各組大鼠進(jìn)行力竭游泳（采用大鼠開始實(shí)驗(yàn)時(shí)體重的8%為負(fù)重負(fù)荷），以大鼠沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 酶活性測定 在大鼠8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后，立即將其頸椎脫臼處死，切取其大腿部位骨骼肌，用冰浴預(yù)冷的生理鹽水沖洗一次，濾紙吸除骨骼肌表面水分，加入液氮冰浴充分研磨后待用。每組骨骼肌樣品中3 g用于RNA制備（每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)、每個(gè)重復(fù)1 g樣品）；剩余樣品用生理鹽水制成100 g/L勻漿液。隨后在4℃下對剩余樣品勻漿液離心（4 000 r/min、10 min），將上清液轉(zhuǎn)移入滅菌離心管并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3種抗氧化酶分別為過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）。它們的活性測定均根據(jù)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明完成。

1.2.3 RT-PCR分析 分別用Trizol（TaKaRa）提取前述步驟準(zhǔn)備的各組骨骼肌樣品中的總RNA，然后立即采用試劑盒RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于后續(xù)檢測。3種抗氧化酶的RT-PCR檢測采用20 μL體系，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ反應(yīng)液10 μL、引物各0.8 μL、模板DNA 2.0 μL、6.4 μL ddH2O。階段I反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；65℃ 15 s。檢測儀器為iCycler iQ5 RT-PCR儀（Bio-Rad）。內(nèi)參基因（β-actin）、3個(gè)抗氧化酶基因檢測引物序列如下：β-actin-F：5'-GAAATTGTGCGCGACATCAAGGA-3'；β-actin-R：5'-GCAATGCCCGGGTACATGGTGGT-3'。CAT-F：5'-ACAAGGCAATCCAGTCTATT-3'；CAT-R：5'-AATCGTCCAACAGGTATCAA-3'。GST-F：5'-GGGCATCTGAAACCTTTTGA-3'；GST-R：5'-GAGCCACATAGGCAGAGAGC-3'。SOD-F：5'-GCCTTGACTCTCCTGTAC-3'；SOD-R：5'-GCTCGTCCTATTATAGAATGTG-3'。

九香蟲提取物添加實(shí)驗(yàn)組3種基因表達(dá)量以CK組的測定值為基準(zhǔn)，求得倍數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 分析用試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用SPSS軟件（版本v12.0）對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為α=0.05的顯著和α=0.01的極顯著。采用EXCEL制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠骨骼肌抗氧化酶的活性的作用

由表1可知，與單純大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（CK）相比，九香蟲提取物在3種添加水平下大鼠骨骼肌SOD活性均顯著升高（P＜0.05），且隨著添加水平的增加SOD活性明顯呈極顯著遞增規(guī)律（P＜0.01）；與CK相比，CAT和GST活性均在0.5 g/kg時(shí)未發(fā)現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），但隨著添加水平的增加，在CAT和GST活性均有極顯著升高（P＜0.01）。

表1 九香蟲提取物對大鼠抗氧化酶活性的影響

2.2 對大鼠骨骼肌抗氧化酶基因表達(dá)的影響

由圖1可知，與單純的大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（CK）相比，補(bǔ)充九香蟲提取物實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的SOD基因表達(dá)水平均極顯著升高（P＜0.01），且呈遞增趨勢。與單純的大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（CK）比較，補(bǔ)充九香蟲提取物實(shí)驗(yàn)組0.5 g/kg添加水平即引起CAT表達(dá)水平的顯著升高（P＜0.05）；并在1.0 g/kg和1.5 g/kg時(shí)，呈極顯著升高（P＜0.01），且呈遞增趨勢。與單純的大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（CK）相比，當(dāng)補(bǔ)充九香蟲提取物劑量增加到1.0 g/kg以上時(shí)，GST表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），其表達(dá)水平升高程度與九香蟲提取物補(bǔ)充劑量呈正相關(guān)。

圖1 三種抗氧化酶基因表達(dá)水平分析

3 討論

在大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)等原因引起動(dòng)物體內(nèi)自由基異常增多的情況下，這些自由基會造成肌細(xì)胞傷害，進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù)、甚至造成運(yùn)動(dòng)能力下降［10］。清除自由基的抗氧化酶類是動(dòng)物體內(nèi)抗自由基、抗氧化系統(tǒng)的重要組成，這些酶類的存在使體內(nèi)過氧化自由基的形成和清除保持動(dòng)態(tài)平衡。因此，自由基拮抗劑的研究在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)領(lǐng)域中一直是備受關(guān)注的話題，國內(nèi)外很多學(xué)者先后利用天然產(chǎn)物作為自由基拮抗劑，進(jìn)而研發(fā)為抗氧化功能增進(jìn)劑或運(yùn)動(dòng)恢復(fù)補(bǔ)劑［11-16］。前期研究發(fā)現(xiàn)九香蟲提取物能夠明顯延長大鼠游泳力竭時(shí)間、提高抗氧化酶活性［8］，本研究結(jié)果證明以上作用的機(jī)理之一，是九香蟲提取物能夠上調(diào)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉中抗氧化酶編碼基因的表達(dá)水平，動(dòng)物體內(nèi)3種抗氧化酶表達(dá)水平的上調(diào)引起運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌SOD、CAT、GST活性的顯著提高。說明九香蟲提取物作為潛在的運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑，對抗肌肉細(xì)胞內(nèi)過氧化反應(yīng)的機(jī)制之一是促進(jìn)了動(dòng)物體抗氧化酶的表達(dá)水平、提高了動(dòng)物抗氧化能力。前期研究發(fā)現(xiàn)九香蟲提取物能夠增強(qiáng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力［8］，推測也與其增強(qiáng)動(dòng)物的抗氧化能力有關(guān)，這與殼聚糖對動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)的機(jī)理類似［12］。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)大鼠補(bǔ)充九香蟲提取物后，其骨骼肌中3種抗氧化酶活性均顯著升高，同時(shí)3種抗氧化酶的編碼基因表達(dá)水平也有顯著升高。這種對運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化功能促進(jìn)作用的機(jī)理之一，是上調(diào)了相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)水平。

［1］李時(shí)珍. 本草綱目［M］. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 1979：2258-2259.

［2］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2010版）［M］. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2011.

［3］ 劉倫沛， 郁建平. 九香蟲的營養(yǎng)成分分析與評價(jià)［J］. 食品科學(xué)，2008， 29（2）：406-410.

［4］劉慶芳. 九香蟲現(xiàn)代臨床研究與應(yīng)用［J］. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版， 2002， 21（4）：66-67.

［5］ Luo XH， Wang XZ， Jiang HL， et al. The biosynthetic products of Chinese insect medicine， Aspongopus chinensis［J］. Fitoterapia，2012， 83（4）：754-758.

［6］ Shi YN. Tu ZC， Wang XL. Bioactive compounds from the insect Aspongopus chinensis［J］. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2014， 24（22）：5164-5169.

［7］ Yan YM， Ai J， Shi YN， et al. （+/-）-Aspongamide A， an N-acetyldopamine trimer isolated from the insect Aspongopus chinensis is an inhibitor of p-Smad3［J］. Organic Letters， 2014， 16（2）：532-535.

［8］任齊俊， 劉?？?， 竇鵬， 等. 九香蟲醇提物對大鼠運(yùn)動(dòng)能力及骨骼肌抗氧化酶系的影響［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 22（12）：170-173.

［9］王俊儒. 天然產(chǎn)物提取分離與鑒定技術(shù)［M］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社， 2004.

［10］郭世炳， 句海松. 運(yùn)動(dòng)與氧自由基損傷［J］. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志， 1990， 9（3）：161-166.

［11］張漓， 徐建方， 馮連世， 封文平. 補(bǔ)充左旋精氨酸對耐力訓(xùn)練大鼠股外肌抗氧化酶系的影響［J］. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2007， 26（3）：308-312.

［12］高穎暉， 周萬紅， 曹軍， 王敦. 昆蟲殼聚糖對運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠肝臟抗氧化酶系與SOD基因表達(dá)的影響［J］. 體育科學(xué)， 2011，35（5）：75-78.

［13］Elena M， Loana L， Nicoleta B. New approach to prepare willow bark extract-lipid based nanosystems with enhanced antioxidant activity［J］. Journal of Nanoscience and Nanotechnology， 2015，15（6）：4080-4089.

［14］Sana OB， Nakako K， Yoshihiro K. Water-soluble extracts from defatted sesame seed flour show antioxidant activity in vitro［J］. Food Chemistry， 2014， 175（5）：306-314.

［15］Lim SJ， Aida WWM， Maskat MY， et al. Isolation and antioxidant capacity of fucoidan from selected Malaysian seaweeds［J］. Food Hydrocolloids， 2014， 42（SI）：280-288.

［16］馬蘭軍， 毛雁， 熊正英. 沙苑子對運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠肝臟自由基代謝的影響［J］. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版， 2007， 28（4）：409-410.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Effects of Ethanol Extract from Aspongopus chinensis on the Activities of Antioxidant Enzymes in Skeletal Muscle of Exercised Rats and Their Gene Expression Levels

Gao Yinghui1，2Zhou Wanhong1，2Dou Peng1Qi Yiman1Wang Dun1
（1. Institute of Entomology，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100；2. P.E. Department，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100）

The effects of ethanol extract from Aspongopus chinensis（EEAC）on the activities of antioxidant enzymes in skeletal muscle of exercised rat and their gene expression levels were analyzed in this study. The EEAC was supplemented to rats that were given heavy-load swimming training at 3 dose levels of 0.5 g/kg， 1.0 g/kg and 1.5 g/kg based on the average weight of each group. The activities and encoded genes expression levels of antioxidant enzymes in skeletal muscle were measured after 8 weeks training. The activities of SOD， CAT and GST with EEAC supplementation were increased significantly compared to non-supplemented training rats， and the encoded genes for these 3 enzymes were up-regulated also. The results suggest that the one mechanism for the increase of antioxidant enzymes activities in skeletal muscle of exercised rats is that the expression levels of encoded genes were up-regulated by EEAC supplementation.

ethanol extract from Aspongopus chinensis；exercised rat；antioxidant enzymes in skeletal muscle；expression level；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.021

2015-03-30

高穎暉，女，碩士，講師，研究方向：運(yùn)動(dòng)生理生化；E-mail：yinghuigao@aliyun.com

王敦，男，博士，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：dunwang@foxmail.com