崔學(xué)強(qiáng)張樹珍沈林波馮翠蓮

（1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

轉(zhuǎn)基因甘蔗植株Southern雜交體系的優(yōu)化

崔學(xué)強(qiáng)1，2張樹珍2沈林波2馮翠蓮2

（1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

對甘蔗Southern雜交體系的優(yōu)化，旨為轉(zhuǎn)基因甘蔗Southern雜交鑒定分析提供參考。以轉(zhuǎn)基因甘蔗為材料，就探針不同標(biāo)記方法的比較、甘蔗基因組DNA的提取、基因組DNA酶切量、酶切時間及雜交過程等方面，對地高辛標(biāo)記的Southern雜交技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明，改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能滿足后期實(shí)驗(yàn)的要求；PCR法標(biāo)記探針的效率較隨機(jī)引物法標(biāo)記探針的效率高，更適合用于Southern雜交；40 μg的DNA在400 μL酶切體系中，酶切10 h可獲得良好的酶切效果；雜交溫度40℃，雜交18 h，可獲得清晰的雜交條帶。

甘蔗；Southern雜交；地高辛；PCR法標(biāo)記探針；酶切

Southern印跡雜交是一種在分子生物學(xué)研究中用來檢測基因組DNA中特定序列的通用方法，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。在遺傳病診斷、外源基因檢測、轉(zhuǎn)基因植株鑒定與育種等方面均有著重要的價值［1］。Southern雜交中根據(jù)探針標(biāo)記的種類不同，可分為同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記兩大類［2］。早期主要以同位素標(biāo)記為主，該方法雖然靈敏度較高，但由于同位素具有放射性和半衰期，對實(shí)驗(yàn)人員身體素質(zhì)及實(shí)驗(yàn)條件都提出了嚴(yán)格要求，因此使得該方法的運(yùn)用受到了一定的限制。非同位素標(biāo)記則克服了同位素標(biāo)記法的缺點(diǎn)，使非同位素標(biāo)記得到了更廣泛的運(yùn)用［3］。非同位素標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記物的不同，分為地高辛標(biāo)記和生物素標(biāo)記。地高辛標(biāo)記探針的方法主要有PCR摻入法、隨機(jī)引物法、切口平移法等［4］。目前地高辛標(biāo)記的Southern雜交技術(shù)已成功運(yùn)用到棉花［5］、煙草［6］、水稻［7］、玉米［8］、油菜［9］、小麥［10］等農(nóng)作物中并取得了良好的雜交效果。然而甘蔗是高度雜合的無性繁殖作物，其遺傳背景十分復(fù)雜，表現(xiàn)為異源多倍體和多倍的非整倍體，具有染色體數(shù)目多，基因組龐大的特點(diǎn)。根據(jù)不同的栽培種，染色體數(shù)目從80-130條不等，基因組高達(dá)10 Gb，是水稻基因組的10倍以上［11］，這使得轉(zhuǎn)基因甘蔗外源基因的Southern雜交分析較其它作物困難。

本研究以轉(zhuǎn)基因甘蔗及受體為材料，參考前人成功經(jīng)驗(yàn)，從甘蔗基因組DNA提取，探針標(biāo)記、基因組DNA使用量及雜交過程等對甘蔗地高辛標(biāo)記探針的Southern雜交方法進(jìn)行優(yōu)化，旨在為轉(zhuǎn)基因甘蔗的Southern雜交分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因甘蔗植株由本課題組利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得，導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株的骨架載體為pCAMBIA3300，篩選基因?yàn)锽ar基因，對照植株為非轉(zhuǎn)基因ROC-22植株。

1.2 方法

1.2.1 地高辛標(biāo)記探針及標(biāo)記效率檢測 隨機(jī)引物法標(biāo)記探針：用Xho I酶切質(zhì)粒載體pCAMBIA3300，切出564 bp的Bar基因片段，回收純化，取純化后的1 μg目的基因片段用于標(biāo)記探針，具體標(biāo)記的過程參考地高辛試劑盒I（Roche Cat. #REF 11 585 614 910）說明書。PCR法標(biāo)記探針：以pCAMBIA3300質(zhì)粒為PCR模板，具體標(biāo)記過程參照PCR法DIG探針合成試劑盒（Roche Cat. #REF 11 636 090910）說明書。PCR法標(biāo)記結(jié)束后取2 μL標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測探針標(biāo)記效率及產(chǎn)量，最后按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行標(biāo)記效率的檢測，比較兩種探針標(biāo)記DNA稀釋樣品與對照的顯色強(qiáng)度。

1.2.2 甘蔗基因組DNA酶切 DNA的提取采用改良CTAB法［12］進(jìn)行提取。對甘蔗基因組DNA酶切量、酶切時間進(jìn)行了比較，旨在對酶切條件進(jìn)行優(yōu)化。酶切量的比較：分別取同一樣品30、40、50和60 μg DNA在400 μL體系中進(jìn)行酶切，酶切12 h，取5 μL檢測酶切是否徹底。其余沉淀回收，溶解于35 μL的ddH2O中，18 V跑膠過夜，觀察跑膠情況。酶切時間的比較：取40 μg DNA樣品在400 μL體系中進(jìn)行酶切，酶切時間分別設(shè)置為：6、8、10和12 h，酶切結(jié)束后，取5 μL檢測酶切效果。根據(jù)酶切量及酶切時間的比較結(jié)果，選取5個轉(zhuǎn)基因株系和1個非轉(zhuǎn)基因株系作為實(shí)驗(yàn)樣品。每個樣品取40 μg DNA進(jìn)行酶切，酶切體系為400 μL，120 U的限制內(nèi)切酶HindⅢ，37℃酶切10 h，酶切結(jié)束后用無水乙醇沉淀DNA，沉淀溶解于35 μL的ddH2O中，65℃水浴10 min，迅速至冰上2-5 min，后18 V電泳過夜（13-16 h）。

1.2.3 真空轉(zhuǎn)膜及固定 對凝膠進(jìn)行變性和中和處理，處理過程參照地高辛試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜用785型真空轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）進(jìn)行，參照周長發(fā)等［5］的方法。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后采用紫外交聯(lián)（1200 J）固定膜上DNA。

1.2.4 雜交及顯影 雜交具體過程參照試劑盒說明書，雜交液用量5 mL，42℃預(yù)雜交1-3 h。探針使用量10 μL，雜交液用量5 mL，于40℃雜交18 h。雜交結(jié)束后進(jìn)行洗膜處理，使用洗液II（0.5×SSC，0.1% SDS）時，于64℃洗膜。封閉液孵育時間為30 min，抗體工作液孵育時間為1 h，其余過程與試劑盒說明書相同。最后顯影過程于黑暗靜置，顯影時間30 min-12 h，顯影結(jié)束后，尼龍膜照相留存。

1.2.5 探針洗脫及再次雜交 探針的洗脫和再次雜交參照試劑盒說明書進(jìn)行。第二次雜交采用PCR法標(biāo)記探針1.5 μL，具體操作同上。

2 結(jié)果

2.1 探針標(biāo)記效率的檢測

2.1.1 PCR法探針標(biāo)記 采用電泳法對PCR標(biāo)記的探針進(jìn)行檢測，未標(biāo)記的Bar基因大小為423 bp，而地高辛標(biāo)記探針后，由于地高辛分子的影響，使得標(biāo)記的探針比相應(yīng)未標(biāo)記的Bar基因片段分子量大，電泳時遷移速率相對較慢，如圖1所示。

2.1.2 探針標(biāo)記效率比較 隨機(jī)引物法與PCR法探針標(biāo)記效率的比較結(jié)果如圖2所示，陽性對照DNA顯示6個稀釋點(diǎn)，隨機(jī)引物法顯示3個稀釋點(diǎn)，PCR法顯示5個稀釋點(diǎn)。經(jīng)顯色亮度比對（圖中箭頭所示）PCR法標(biāo)記探針稀釋濃度為0.3 pg/μL時，其顯色強(qiáng)度與隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針稀釋濃度為3 pg/μL時的顯色亮度一致。由此可見PCR法標(biāo)記探針的效率高于隨機(jī)引物法一個數(shù)量級。

圖1 PCR法標(biāo)記Bar基因探針的電泳檢測結(jié)果

圖2 隨機(jī)引物法和PCR法標(biāo)記探針效率的比較

2.2 甘蔗基因組DNA酶切

甘蔗基因組不同DNA量酶切結(jié)束后，取5 μL電泳檢測，酶解效果較好，差異并不明顯。其余酶切產(chǎn)物回收后進(jìn)行電泳檢測如圖3所示，甘蔗基因組DNA量為30 μg 、40 μg時，泳道自上而下成均勻彌散狀，電泳效果最好。但DNA量為30 μg時，由于DNA量少，泳道亮度較暗。當(dāng)DNA量增加到50 μg、60 μg時，隨著DNA量的增加，泳道兩側(cè)邊緣出現(xiàn)高亮度的軌道就越明顯，泳道中間DNA片段就越少。

圖3 甘蔗基因組DNA量酶切效果檢測

40 μg DNA在400 μL體系中進(jìn)行酶切時間比較，酶切6 h和8 h，酶切不充分，條帶并沒有成均一的彌散狀。酶切10 h和12 h 的酶切效果最好，酶切產(chǎn)物成均勻的彌散狀，酶切10 h和12 h效果較接近（圖略）。根據(jù)甘蔗基因組不同DNA量的酶切及不同酶切時間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后確定酶切體系為：40 μg DNA在400 μL體系中加入8 μL的限制性內(nèi)切酶，酶切10 h。對不同樣品按此酶切體系進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物沉淀溶解后，低壓過夜電泳。

2.3 Southern雜交檢測結(jié)果

圖4-A顯示，采用隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針雜交結(jié)果很不理想，特異性差，幾乎無目的帶，背景深。圖4-B顯示，PCR法標(biāo)記的探針雜交背景淺，雜交條帶清晰，能直觀的看出轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，雜交效率較高。

圖4 不同探針標(biāo)記方法的雜交結(jié)果

3 討論

隨機(jī)引物法可標(biāo)記的DNA長度范圍為：300-1 500 bp，一般每隔20-25個核苷酸摻入一個標(biāo)記的核苷酸，標(biāo)記效率低［13］。標(biāo)記所需DNA量較多，一般20 μL體系需1 μg（至少300 ng）模板DNA，標(biāo)記耗時，且探針需要純化，否則容易造成雜交背景過深，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和研究。PCR標(biāo)記法一般適合于小片段標(biāo)記，標(biāo)記效率較高，標(biāo)記需要模板量較少，如基因組DNA 1-50 ng，質(zhì)粒DNA 10-100 pg即可。對模板純度要求不高，標(biāo)記操作方便快捷，標(biāo)記的探針無需純化即可用于Southern雜交，該方法采用專一的酶進(jìn)行標(biāo)記，價格相對昂貴，但是每次雜交加入的探針量較少。本研究就隨機(jī)引物法和PCR法標(biāo)記探針的效率進(jìn)行了比較，PCR法標(biāo)記探針稀釋濃度為0.3 pg/μL時，其顯色強(qiáng)度與隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針稀釋濃度為3 pg/μL時的顯色亮度一致，表明PCR法標(biāo)記探針的標(biāo)記效率顯著高于隨機(jī)引物法，兩者相差一個數(shù)量級，該結(jié)論與之前報道的文獻(xiàn)結(jié)果相符［14］。從本研究的探針標(biāo)記結(jié)果及最后兩者的雜交結(jié)果分析，Southern雜交采用PCR標(biāo)記法標(biāo)記探針更為靈敏。

酶切是做好Southern雜交的前提，本實(shí)驗(yàn)就甘蔗基因組DNA酶切量和酶切時間進(jìn)行了研究?；蚪MDNA酶切量依據(jù)植物基因組特性不同，使用基因組DNA量也不同，一般植物用于Southern雜交的DNA量在5-15 μg左右便可取得良好的雜交效果。本實(shí)驗(yàn)甘蔗基因組DNA酶切量選擇在30-60 μg，主要是由于甘蔗具有染色體數(shù)目多，基因組龐大的特點(diǎn)，因此常規(guī)的DNA量是無法滿足甘蔗Southern雜交，本團(tuán)隊(duì)曾用過10、20和30 μg的DNA，雜交效果都不理想，條帶較弱，無法分辨植株的拷貝數(shù)。一般用于雜交的甘蔗基因組DNA酶切時間為12 h以上，時間較長［15］。為了節(jié)約時間加快整個實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度，因此本實(shí)驗(yàn)在采用400 μL的大酶切體系前提下，進(jìn)行了酶切時間為6、8、10和12 h的酶切效果比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了甘蔗基因組盡管在400 μL的大酶切體系下，仍然需要較長的酶切時間才能徹底酶解。

雜交過程中雜交溫度、探針加入量是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，不同基因的雜交溫度需根據(jù)試劑盒雜交溫度計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，雜交溫度過高和過低都不利于探針與目的片段的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)試劑盒說明書雜交溫度計(jì)算公式得出Bar基因的雜交溫度為38-42℃，實(shí)驗(yàn)取中間值40℃作為雜交溫度。探針加入量根據(jù)試劑盒說明書如果要檢測復(fù)雜基因組中的單拷貝基因，探針濃度為25 ng/mL計(jì)算加入。在5 mL雜交液中PCR法標(biāo)記的探針加入量為1.5 μL，隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針加入量為10 μL。為了減少探針的損失，本實(shí)驗(yàn)將探針加入到100 μL預(yù)雜交液中，進(jìn)行沸水處理變性。本實(shí)驗(yàn)就隨機(jī)引物法與PCR法兩種探針雜交結(jié)果比較，采用隨機(jī)引物法探針的雜交結(jié)果背景較采用PCR法探針深，雜交條帶不清晰這與之前報導(dǎo)的相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果相符［5，10］，采用隨機(jī)引物法探針進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生雜交背景高，雜交條帶不清晰的原因可能是由于探針沒有純化。之前有相關(guān)文獻(xiàn)報導(dǎo)隨機(jī)引物法如果想要獲得低背景的雜交條帶可以通過對標(biāo)記的探針進(jìn)行純化處理［10］。

4 結(jié)論

本研究以轉(zhuǎn)基因甘蔗為材料，就探針不同標(biāo)記方法的比較、甘蔗基因組DNA的提取、基因組DNA酶切量、酶切時間及雜交過程等方面，對地高辛標(biāo)記的Southern雜交技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究。使用改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能滿足后期實(shí)驗(yàn)的要求，PCR法標(biāo)記的探針較隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針更適合用于甘蔗Southern雜交，40 μg高純度的甘蔗基因組DNA在400 μL酶切體系中，酶切10 h可獲得良好的酶切效果。雜交溫度40℃，雜交18 h，可獲得雜交背景清晰的雜交條帶。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Optimization of Southern Blot for Transgenic Sugarcane Plants

Cui Xueqiang1，2Zhang Shuzhen2Shen Linbo2Feng Cuilian2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Sugarcane Research Center，Ministry of Agriculture Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops，Haikou 571101）

Using sugarcane as materials， the DIG-labeled Southern blot was optimized through several key aspects：the comparison of different-labeled probe methods， extraction of sugarcane genome DNA， the amount of enzyme digestion of genome DNA， enzyme digestion time and a serial of procedures in the process of the hybrid. The results showed that sugarcane DNA extracted by the improved CTAB method met the requirements of the latter experiments， the efficiency of PCR-labeled probe was higher than that of random primer-labeled probe， so PCR-labeled probe method was suitable for the Southern blot， 40 μg DNA samples in enzyme digestion system of 400 μL for 10 hours could achieved desirable digestion result；while hybrid temperature was 40℃ and hybridizing time was 18 h， a clear hybridization band could be observed. The optimization of sugarcane Southern blot provides a reference for the analysis of Southern blot of transgenic sugarcane.

sugarcane；Southern blot；digoxigenin；PCR-labeled probe；enzyme digestion

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.015

2015-05-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101197），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金（CARS-20-2-5）

崔學(xué)強(qiáng)，男，碩士研究生，研究方向：植物細(xì)胞與分子生物學(xué)；E-mail：yncuixueqiang@126.com

馮翠蓮，女，博士，助理研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：fengcuilian @126.com