徐安書，郭健，殷永玲

（1.重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶408000；2.重慶市涪陵區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測管理站，重慶408000）

莖瘤芥乳酸菌飲料穩(wěn)定性研究及工藝條件優(yōu)化

徐安書1，郭健2，殷永玲1

（1.重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶408000；2.重慶市涪陵區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測管理站，重慶408000）

基于莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料穩(wěn)定性研究基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，進(jìn)一步研究發(fā)酵過程中酸度對感官品質(zhì)和組織狀態(tài)的影響，采用四因素三水平正交實驗，研究菌種比例、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對發(fā)酵過程中穩(wěn)定性的影響，根據(jù)沉淀率的大小判定其穩(wěn)定性，試驗結(jié)果：保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌比例為1∶1，母發(fā)酵劑接種量3%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間12 h，均質(zhì)壓力20 MPa，均質(zhì)溫度在30℃～40℃之間，2次均質(zhì)，效果更好，最后添加復(fù)合穩(wěn)定劑耐酸羧甲基纖維素鈉CMC0.3%+黃原膠0.01%。

莖瘤芥；胡蘿卜；乳酸菌；穩(wěn)定性；優(yōu)化工藝

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）為十字花科（Cruciferae）芥屬（Brassica）芥菜種的一個變種，是榨菜加工的原料作物。莖瘤芥乳酸菌飲料是以涪陵地產(chǎn)的莖瘤芥為主要原料、添加胡蘿卜汁（兩種汁比例6∶4），脫脂乳4%，母發(fā)酵劑接種量3%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間12h，兩次均質(zhì)，均質(zhì)壓力20MPa，均質(zhì)溫度30℃～40℃，殺菌溫度100℃，殺菌時間10min，最后添加殺菌后的穩(wěn)定劑［1］。綜合蔬菜原料的營養(yǎng)、保健成分與乳酸菌的獨特的保健功能，制成一種既營養(yǎng)又能提高莖瘤芥附加值的一種營養(yǎng)保健食品，該飲料既具有蔬菜天然色素和營養(yǎng)、較高活性乳酸菌數(shù)量，又具有乳酸發(fā)酵的風(fēng)味和特點［2］。糖酸比合適，口感協(xié)調(diào)，衛(wèi)生指標(biāo)合格，制品可保持一年以上。

通過添加乳酸菌發(fā)酵后的莖瘤芥胡蘿卜乳酸菌飲料綜合蔬菜原料的營養(yǎng)、保健成分與乳酸菌的獨特的保健功能，制成一種既營養(yǎng)又能提高莖瘤芥附加值的一種營養(yǎng)保健食品，深受消費者的喜愛。然而，我們在莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復(fù)合乳酸菌飲料的穩(wěn)定性研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對發(fā)酵過程中酸度的控制及發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，得到穩(wěn)定性較強的發(fā)酵工藝參數(shù)，為該類型產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)與研究提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中酸度是主要影響穩(wěn)定性的因素之一，而酸度的產(chǎn)生又跟菌種種類及比例、發(fā)酵溫度和時間、接種量等因素有直接關(guān)系，其中發(fā)酵時間影響最大。

1材料與方法

1.1材料

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）簡寫St、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp）簡寫Ld：購于中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院；MRS培養(yǎng)基：市售；涪陵地產(chǎn)莖瘤芥；胡蘿卜、食用級蔗糖和葡萄糖、脫脂奶粉：市售；氫氧化鈉，碳酸鈉，pH緩沖液（鄰苯二甲酸氫鉀）、羧甲基纖維素鈉果膠酶（活力≥500 000 U/g）：成都科龍；穩(wěn)定劑均為食品級；檸檬酸、VC、黃原膠、氯化鈉：均由重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系實驗室提供。

1.2儀器

PX-300B型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HG72-1恒溫干燥箱：北京市朝陽區(qū)來廣營醫(yī)療器械廠；梅特勒AR2140電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；生物顯微鏡（重慶奧特（B203LED）10×、40×、100×（平常消色差目鏡）；CD-222KSA低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；pHS-25數(shù)字式pH計：上海日島科學(xué)儀器有限公司；GYB60-6S高壓均質(zhì)機：上海東華高壓均質(zhì)機廠；飛利浦HR1871榨汁機、HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機等。

1.3方法

1.3.1菌種活化和馴化

將Ld和St按Ld∶St（1∶1、1∶2、2∶1）混合菌種分別接種到已滅菌并冷卻的10%脫脂乳（NFM）培養(yǎng)基中，放置43℃培養(yǎng)24 h～48 h，傳代3次～4次，取4 h內(nèi)凝乳的酸奶。此時乳酸菌活力已達(dá)要求（平板計數(shù)法測定乳酸菌活菌數(shù)）。

將3種比例的混合菌種分別在脫脂乳和混合果蔬汁比例為9∶1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再至兩者比例為8∶2的培養(yǎng)基培養(yǎng)。直到兩者比例為1∶9的培養(yǎng)基培養(yǎng)，最后用純混合蔬菜汁培養(yǎng)。每次培養(yǎng)后均測定其乳酸菌數(shù)達(dá)到1.0×107CFU/mL以上，反復(fù)多次，至產(chǎn)酸較快生長良好為止，即得到3種比例混合種子液。

1.3.2蔬菜汁制備

1.3.2.1莖瘤芥汁

選擇無病蟲害的莖瘤芥（青菜頭）→清洗→去皮筋→榨汁→四層以上沙布過濾→離心機離心→取上清液。

1.3.2.2胡蘿卜汁

選擇無霉?fàn)€、色澤橙紅、肉厚、飽滿的胡蘿卜→清洗→切塊→0.2%檸檬酸+0.1%VC混合液煮沸6 min→加入新鮮1/2質(zhì)量的水→打漿→0.05%果膠酶在50℃保溫液化酶解1 h→4層以上沙布過濾→離心機離心→取上清液［2］。

1.3.3母發(fā)酵劑的制備

蔬菜汁制備（莖瘤芥胡蘿卜混合汁配比6∶4）+4%蔗糖+4%脫脂乳→攪拌溶解→高溫殺菌（100℃，10 min）→迅速冷卻至40℃→分別接種（5%經(jīng)馴化后Ld∶St按1∶1、1∶2、2∶1比例混合種子液）→恒溫培養(yǎng)（37℃，24 h）→分別測定其乳酸菌數(shù)達(dá)到要求→存放冰箱備用

1.3.4莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料工藝流程

1.3.5試驗設(shè)計方案

選取菌種比例（球菌：桿菌）、母發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為研究因素，4種因素采用正交L9（34）試驗進(jìn)行篩選，取樣品10 mL，經(jīng)3 500 r/min離心15 min，測定沉淀量的多少判定其穩(wěn)定性。設(shè)計結(jié)果見表1。

表1　莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料發(fā)酵L9（34）正交試驗因素水平表Table 1Tumorous stem mustard carrot juice beverage of lactobacillus fermentation for L9（34）orthogonal test table level factors

1.2.6穩(wěn)定性測試方法［3］

離心沉淀率檢測：準(zhǔn)確量取樣品10 mL加入離心管中，在3 500 r/min離心15 min，棄去上部溶液，準(zhǔn)確稱取沉淀物重量，利用下列公式計算沉淀率。根據(jù)沉淀量的多少判定其穩(wěn)定性，沉淀率越低，穩(wěn)定性越好。

1.3.7乳酸菌數(shù)

MRS培養(yǎng)基平板計數(shù)法

1.3.8酸度

GB/T12456-2008食品中總酸的測定酸堿滴定法（°T測定：用0.1 mol/LNaOH直接滴定）。

1.3.9pH值

pHS-25數(shù)字式pH計直接計數(shù)。

1.3.10飲料基本參數(shù)

蛋白質(zhì)含量≥0.7%，可溶性固形物13%，酸度DT=50，組織狀態(tài)呈均勻細(xì)膩的乳淡黃色渾濁液，無異物，無分層現(xiàn)象。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵過程中酸度對穩(wěn)定性的影響

將蔬菜汁（莖瘤芥汁∶胡蘿卜汁=6∶4）按比例混合后調(diào)pH6.3，殺菌（100℃，10 min），冷卻至40℃加入馴化后母發(fā)酵劑（Ld∶St=1∶1），接種量5%，設(shè)置6個恒溫發(fā)酵溫度，分別為37、38、39、40、41、42℃，分別測定12、24、36 h后的pH、滴定酸度，并進(jìn)行感官品質(zhì)和組織狀態(tài)評定，結(jié)果見表2。

表2　莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料發(fā)酵過程感官品質(zhì)與組織狀態(tài)Table 2Tumorous stem mustard carrot juice mixed fermentation of lactic acid bacteria beverage process sensory quality and structure

由表2得知，隨著發(fā)酵時間延長，產(chǎn)酸量增多，pH下降，沉淀越多，流動性越來越差；飲料顏色由淡乳黃變黃褐色，香氣由榨菜香變酸餿氣味。在莖瘤芥乳酸菌發(fā)酵過程中，乳酸菌利用原料中乳糖作為其生長增殖的能量來源，在乳酸菌增殖過程中，其中的各種酶和酸將乳糖轉(zhuǎn)化成乳酸。乳酸的形成使乳清蛋白和酪蛋白復(fù)合體越來越不穩(wěn)定。當(dāng)體系內(nèi)的pH達(dá)到酪蛋白的等電點時（pH4.6～4.7），酪蛋白膠粒開始聚集沉降，逐漸形成一種蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)立體結(jié)構(gòu)，其中包含乳清蛋白、脂肪和水溶液部分。這種變化使原料乳變成了半固體狀態(tài)的凝膠體—酸乳，使乳飲料粗糙、不細(xì)膩，有沙礫狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生［4］。因此，影響莖瘤芥乳酸菌飲料穩(wěn)定性因素之一是控制好發(fā)酵過程中酸度，而酸度的控制又與原料殺菌溫度、菌種種類與接種量、發(fā)酵溫度等因素有關(guān)［5］，所以說發(fā)酵過程的好壞直接影響到乳酸菌乳飲料的風(fēng)味和穩(wěn)定性。

2.2莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料最佳發(fā)酵液正交試驗結(jié)果

通過正交試驗確定莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料發(fā)酵過程中最佳菌種比例、母發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間，試驗結(jié)果見表3和圖1。

表3　莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料最佳發(fā)酵液正交試驗表Table 3Tumorous stem mustard carrot juice beverage fermented liquid of lactic acid bacteria optimum orthogonal test table

圖1　正交試驗K值線形圖Fig.1Orthogonal test K value of linear

由表3可以看出，方差分析結(jié)果優(yōu)水平配方為A2B1C1D1，即菌種比例為∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1，母發(fā)酵劑接種量為3%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間12 h。從極差分析中可見，影響試驗的4個因素的大小順序是D>A>B>C，即對莖瘤芥乳酸菌飲料風(fēng)味穩(wěn)定性影響最大的是發(fā)酵時間（RD=9.4），其次是菌種比例（RA=1.2），而接種量和發(fā)酵溫度有一定溫度，但影響不是很大。正交試驗K值線性圖如圖1。

由圖1可以看出，隨著發(fā)酵溫度的增高和發(fā)酵時間的延長，沉淀率明顯增大，而且增減幅度較大，說明發(fā)酵時間是影響莖瘤芥乳酸菌飲料穩(wěn)定性最大因素之一；隨著桿菌和球菌比例的增大，沉淀率逐漸下降，直到相等，當(dāng)桿菌大于球菌時，沉淀率又會上升，接種量在一定量內(nèi)隨著接種量增大，沉淀率有一定程度上升，但變化不大。

綜上所述，最有利于莖瘤芥乳酸菌飲料穩(wěn)定性的發(fā)酵條件是A2B1C1D1，即菌種比例為∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1，母發(fā)酵劑接種量為3%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間12 h。添加復(fù)合穩(wěn)定劑（CMC0.3%+黃原膠0.01%），均質(zhì)壓力15 MPa～25 MPa，均質(zhì)溫度在30℃～40℃之間，兩次均質(zhì)，效果更好。

3結(jié)果與討論

3.1發(fā)酵過程中酸度對穩(wěn)定性的影響

乳酸菌乳飲料發(fā)酵過程中，當(dāng)pH降至4.6～5.3時，酪蛋白就失去穩(wěn)定性，酪蛋白粒子發(fā)生凝集，分子團變大，最后形成沉淀。整個發(fā)酵過程的好壞直接影響酪蛋白顆粒的大小，而乳酸菌乳飲料與酸奶粒子直徑的大小有關(guān)。

3.2發(fā)酵時間和溫度對穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵時間和溫度是影響莖瘤芥乳酸菌飲料穩(wěn)定性的重要因素之一，溫度低，發(fā)酵飲料細(xì)膩，有利于穩(wěn)定性的提高。但發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵速度過慢，會引起污染，產(chǎn)生異味，導(dǎo)致發(fā)酵失敗，采用37℃發(fā)酵12 h，飲料的安全性和穩(wěn)定性較好。

3.3菌種比例、種子液接種量對穩(wěn)定性影響

菌種比例對乳酸菌飲料的穩(wěn)定性影響較小，乳酸菌種一般含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，球菌和桿菌的比例大多為1∶1或2∶1，由于桿菌分解蛋白質(zhì)的活性強，產(chǎn)酸能力也強，使乳酸菌飲料酸度上升過快，牛乳中的結(jié)合水就會減少，蛋白質(zhì)粒子凝集過快，造成發(fā)酵乳飲料的組織結(jié)構(gòu)粗糙，顆粒大小不均勻［4］。經(jīng)過實踐證明，球菌與桿菌比例以1∶1更好。

接種量大小直接影響發(fā)酵周期。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵周期，減少染菌的機會，這是由于種子量多，同時種子液中含有大量體外水解酶類，有利于對基質(zhì)的利用和產(chǎn)物的合成，并且生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個培養(yǎng)環(huán)境，減少了雜菌生長的機會。但是，如果接種量過大，往往使菌絲生長過快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足，穩(wěn)定性下降，從而影響產(chǎn)物的合成。因此，采用適宜接種量，即可以縮短發(fā)酵時間，提高飲料穩(wěn)定性，同時減少染菌的機會。

［1］徐安書，張洪禮，何軍.莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料穩(wěn)定性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2013，13（34）：62-66

［2］徐安書，胡敏，何軍.莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料的研制［J］.食品科學(xué)，2012，14（33）：321-325

［3］王善松，丁泉水.乳酸菌飲料穩(wěn)定性研究［J］.中國乳品工業(yè)，2006，34（6）：58-60

［4］張洪穎，秦立虎.乳酸菌乳飲料的不穩(wěn)定性及其解決對策［J］.乳品工業(yè)，2006（6）：52-54

［5］王帥.酸度對發(fā)酵奶品質(zhì)的影響［J］.科技信息、基礎(chǔ)理論研究，45-46

Tumorous Stem Mustard Lactic Acid Bacteria Beverage Stability Research and Process Conditions Optimization

XU An-shu1，GUO Jian2，YIN Yong-ling1
（1.Biochemistry Engineering Department，Chongqing Industry&Trade Polytechnic，Chongqing 408000，China；2.Fuling Wahaha Beverage Company Limited，Chongqing 408000，China）

Tumorous stem mustard carrot juice lactic acid bacteria beverage stability study on the basis of the optimization of process conditions based on the further study of the effect of acidity and fermentation process on the sensory quality and organizational status，using four factors and three levels orthogonal experiment to study the effect of proportion，strain，inoculation，fermentation temperature and fermentation time on the stability of the fermentation process，according to the precipitation the size of rate to determine its stability，the results show that：the Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus ratio 1∶1，mother culture inoculation amount 3%，fermentation temperature of 37℃，fermentation time 12 h，homogenization pressure 20 MPa，homogeneous temperature between 30℃-40℃，the better the two homogeneous，effect，finally adding compound stabilizer acid Suo Jiaji cellulose sodium CMC0.3%+0.01%xanthan gum.

tumorous stem mustard；carrot；lactic acid bacteria；stability；process optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.017

2015-02-09

重慶市教委2014年度科學(xué)技術(shù)研究項目（KJ1403401）

徐安書（1964—），女（漢），教授，學(xué)士，研究方向：微生物及微生物發(fā)酵技術(shù)，食品加工。