黃微　宋云駿　姜林鶴　劉運(yùn)江

1.河北省承德市腫瘤醫(yī)院，河北承德067000；2.河北省承德市中心醫(yī)院，河北承德067000

CD44V6在結(jié)腸癌組織和外周血中的表達(dá)及其臨床意義

黃微1宋云駿2▲姜林鶴1劉運(yùn)江1

1.河北省承德市腫瘤醫(yī)院，河北承德067000；2.河北省承德市中心醫(yī)院，河北承德067000

目的檢測結(jié)腸癌組織和外周血中CD44V6的表達(dá)，分析與結(jié)腸癌的臨床病理學(xué)特征和患者預(yù)后的關(guān)系。方法收集2011年1月～2012年12月在承德市中心醫(yī)院腫瘤科手術(shù)治療的57例患結(jié)腸癌者，收集其手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織和外周血血清標(biāo)本，另取10例健康者外周血作為對照。分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP）和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測CD44V6的表達(dá)，分析其與結(jié)腸癌的臨床病理特征之間的關(guān)系以及與患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果CD44V6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（63.16%）明顯高于其在癌旁正常組織的表達(dá)水平（10.00%），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。患者血清中CD44V6為（14.62±3.34）ng/mL，而健康者血清中為（3.22±1.65）ng/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)腸癌中的CD44V6表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)（P＜0.05）。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，CD44V6高表達(dá)的患者5年生存率（47.22%）明顯低于低表達(dá)患者（73.91%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CD44V6在結(jié)腸癌組織和血清中高表達(dá)，并可能成為預(yù)測結(jié)腸癌浸潤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)。

結(jié)腸癌；CD44V6；免疫組化；酶聯(lián)免疫吸附實驗

結(jié)腸癌是全世界常見的一種消化道惡性腫瘤，可發(fā)生在結(jié)腸的任何部位。近年來，該病在我國發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢［1］。結(jié)腸癌的治療手段主要是手術(shù)和輔助治療，盡管這些年得到了很大發(fā)展，但患者的遠(yuǎn)期生存率卻無明顯提高，這主要是由于術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所致。因此，人們期望通過研究結(jié)腸癌的腫瘤分子，尋找能夠預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移侵襲和預(yù)后的指標(biāo)，為臨床病理診斷和治療提供更多的幫助。

CD44V6是目前研究較多的關(guān)于結(jié)腸癌的蛋白黏附因子，其在肺癌、食管癌及乳腺癌等多種實體癌中均有明顯表達(dá)。Bendardaf等［2］報道CD44V6與腫瘤分級和浸潤的深度呈相關(guān)性，提示黏附分子在局部侵襲和轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中與腫瘤分化、浸潤有關(guān)。Heider等［3］研究發(fā)現(xiàn)，CD44V6的表達(dá)多發(fā)生于腫瘤晚期，且在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中表達(dá)更強(qiáng)，密度更大。Gurtne［4］和Gkrause［5］等研究都發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期胃癌、結(jié)直腸癌患者血清中CD44V6水平增高，但當(dāng)腫瘤切除后血清中CD44V6水平下降，提示血清CD44V6水平有可能作為惡性腫瘤患者腫瘤負(fù)荷及轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。因此，CD44V6的表達(dá)與患者臨床病理特征和生存率的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測CD44V6在結(jié)腸癌組織和血清中的表達(dá)，并分析CD44V6的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性以及與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，為CD44V64作為臨床判斷預(yù)測結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后指標(biāo)提供參考。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2011年1月～2012年12月在承德市中心醫(yī)院腫瘤科手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者57例，所有患者術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療?；颊吣挲g36～70歲，中位年齡47歲；其中男35例，女22例。手術(shù)切除組織，4%多聚甲醛固定并進(jìn)行石蠟包埋。同時收集距離癌組織15 cm遠(yuǎn)處的腸黏膜組織作為正常對照。根據(jù)第6版的惡性腫瘤TNM分類進(jìn)行臨床分期，并由兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行準(zhǔn)確的確診。其中結(jié)腸癌38例、直腸癌19例。按照浸潤深度分為：浸潤至漿膜及漿膜外32例、未超過肌層25例；根據(jù)腫瘤分化程度分為：高分化腺癌11例、中分化腺癌34例，低分化腺癌12例。Duke's分期：A期6例、B期18例、C期33例；按照是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性33例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性24例。同時在術(shù)前取患者空腹靜脈血2～3 mL，待血液凝固后分離上清液，在-70℃下冰凍保存。另取10例健康者外周血作為正常對照。

1.2免疫組織化學(xué)染色法

免疫組織化學(xué)染色（SP兩步法）熱修復(fù)抗原后采用兩步法檢測結(jié)腸癌和癌旁組織中CD44V6的表達(dá)。實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。CD44V6單克隆抗體為北京中杉金橋生物科技有限公司產(chǎn)品，工作濃度均為1∶100。染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：按Heider等［3］的標(biāo)準(zhǔn)，選擇5個具有代表性的高倍視野（400×），以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色為陽性染色，不著色為陰性（-），著色為（+）。通過電話或書信方式隨訪患者生存情況。

1.3 ELISA

CD44V6 ELLSA試劑盒購買北京金杉公司，實驗方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清中CD44V6的含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩獨(dú)立樣本的計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan-Meier法計算生存率。

2　結(jié)果

2.1 CD44V6在結(jié)腸癌患者組織和血清中的表達(dá)

CD44V6陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)（圖1）。57例結(jié)腸癌組織中36例CD44V6的表達(dá)為陽性，陽性表達(dá)率為63.16%（36/57）；在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)為8.77%（5/57）。在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于正常組織，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 9.722，P=0.002）。

結(jié)腸癌患者血清中CD44V6表達(dá)水平為（14.62± 3.344）ng/mL，而正常對照組血清中CD44V6表達(dá)水平為（3.22±1.65）ng/mL，結(jié)腸癌組表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　免疫組化檢測結(jié)腸癌組織中CD44V6的表達(dá)（sp法，400×）

2.2 CD44V6在結(jié)腸癌組織和血清中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

CD44V6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤的直徑大小無相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤的浸潤深度（P=0.034）、組織學(xué)分化程度（P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）及臨床病理分期（P=0.000）有關(guān)。見表1。

CD44V6在結(jié)腸癌血清中的表達(dá)水平在患者不同性別及年齡間無明顯差異（P＞0.05），而與腫瘤的直徑大?。≒=0.037）、浸潤深度（P=0.001）、組織學(xué)分化程度（P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.000）及臨床病理分期（P=0.000）有關(guān)。見表1。

表1　CD44V6在結(jié)腸癌組織和血清中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CD44V6在結(jié)腸癌患者組織中的表達(dá)與生存率的關(guān)系

在57例結(jié)腸癌患者中，5年后生存的患者34例，其中17例CD44V6表達(dá)陽性，陽性率為50.00%；死亡患者23例，其中19例CD44V6表達(dá)陽性，陽性率為82.61%。CD44V6陰性表達(dá)組平均生存時間為（55.810±2.046）個月，CD44V6陽性表達(dá)組平均生存時間為（49.361±2.136）個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 5.543，P=0.019）。見圖2。

圖2　Kaplan-Meier生存分析CD44V6表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系

3　討論

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中位居第3位。目前結(jié)腸癌的治療主要采用以手術(shù)為主結(jié)合放化療的綜合治療。但結(jié)腸癌的遠(yuǎn)期生存率并不高，其中肝轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因之一［6］。隨著對結(jié)腸癌病因、發(fā)病機(jī)制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)了眾多結(jié)腸癌早期診斷和預(yù)后有意義的腫瘤標(biāo)志物，其中最廣泛的就是CD44V6。

CD44是一種廣泛分布的多功能、多結(jié)構(gòu)的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白［7］，屬于未分類的細(xì)胞粘附分子，主要參與腫瘤的異質(zhì)性黏附，即腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和宿主基質(zhì)的黏附，腫瘤的異質(zhì)性黏附在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程起促進(jìn)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD44能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，并促進(jìn)與基底膜的浸潤，同時影響細(xì)胞骨架蛋白的分布及構(gòu)型，增加癌細(xì)胞的運(yùn)動能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［8-9］。CD44V6是CD44的外顯子不能表達(dá)方式體現(xiàn)一種變異蛋白，參與了腫瘤細(xì)胞的黏附，生長調(diào)控，逃逸，分化以及游動［10］。CD44V6是一組跨膜糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)ECM家族中一個重要成員的受體，主要在結(jié)腸癌中表達(dá)［11］。CD44V6參與了很多重要的細(xì)胞活動過程，如黏附，生長調(diào)控，逃逸，分化以及游動，也因此被認(rèn)為既是一種腫瘤抑制因子又是一種生長侵襲促進(jìn)因子。有學(xué)者［12］通過免疫組織化學(xué)法檢測直腸癌組織中的CD44V6的表達(dá)情況，結(jié)果表明CD44V6能夠提示癌癥的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可以作為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的重要指標(biāo)。郭慶喜等［13］研究也發(fā)現(xiàn)CD44V6、MMP-7和E-cadherin與結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移性有關(guān)，對結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷有重要意義。黃榮暉等［14］研究也表明在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中CD44V6的表達(dá)水平要明顯增高。陳兵［15］研究發(fā)現(xiàn)CD44V6表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤深度T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床腫瘤TNM分期密切相關(guān)。

本研究采用免疫組化法檢測結(jié)腸癌及癌旁組織中CD44V6蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在57例結(jié)腸癌組織中CD44V6的表達(dá)率明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)。隨浸潤程度的加重，CD44V6蛋白的陽性表達(dá)率明顯增加（P=0.034）；在腫瘤細(xì)胞的不同分化程度間，CD44V6的表達(dá)差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。在臨床分期上，Duke's C期病例組的陽性率高于Duke's A、B期，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率也明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組（P=0.001）。以上結(jié)果提示CD44V6蛋白表達(dá)的結(jié)腸癌具有更強(qiáng)的侵襲力，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在結(jié)腸癌的臨床病理進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用［16-18］。另外，本研究還通過ELISA法測定了結(jié)腸癌患者血清中的CD44V6的表達(dá)水平，并探討其表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示CD44V6在結(jié)腸癌患者血清中的表達(dá)均明顯高于正常血清，這提示CD44V6和MMP-2可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)血清中的CD44V6表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤大小，浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在密切的關(guān)系。Bendardaf等［12］在早期的研究報道稱CD44V6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管受侵明顯相關(guān)，這與本研究結(jié)果相一致。以上研究都提示CD44V6與結(jié)腸癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，有可能成為判斷結(jié)腸癌浸潤轉(zhuǎn)移的一個指標(biāo)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)CD44V6表達(dá)程度越高預(yù)示著患者的預(yù)后越差，提示CD44V6也可作為結(jié)腸癌的一個預(yù)后指標(biāo)，一定程度上可以反映病情的進(jìn)展，為臨床評價療效、評估病情及指導(dǎo)治療提供參考依據(jù)。

［1］Kroemer G，Pouyssegur J.Tumor cell metabolism:cancer's Achilles'heel［J］.Cancer Cell，2008，13（6）：472-482.

［2］Bendardaf R，Elzagheid A，Lamlum H，et al.E2 cadherin，CD44s and CD44v6 correlate with tumour differentiation in colon rectal cancer［J］.Oncol2 Rep，2005，13（5）：831-835.

［3］Heider KH，Kiefer K，Zenz T，et al.A novel Fc-engineered monoclonal antibody to CD37 with enhanced ADCC and high proapoptotic activity for treatment of B-cell malignancies［J］.Blood，2011，118（15）：4159-4168.

［4］Gurtner K，Hessel F，Eicheler W，et al.Combined treatment of the immunoconjugate bivatuzumab mertansine and fractionatedirradiation improves local tumour control in vivo［J］.Radiother Oncol，2012，102（3）：444-449.

［5］Gkrause G，Patz M，Isaeva P，et al.Action of novel CD37 antibodies on chronic lymphocytic leukemia cells［J］.Leukemia，2012，26（3）：546-549.

［6］BourguignonLY，WongG，EarleC，etal.Hyaluronan-CD44v3 interaction with Oct4-Sox2-Nanog promotes miR-302 expression leading to self-renewal，clonal formation，and cisplatin resistance in cancer stem cells from head and neck squamous cell carcinoma［J］.J Biol Chem，2012，287（39）：32800-32824.

［7］Nurwidya F，Murakami A，Takahashi F，et al.Molecular mechanisms contributing to resistance to tyrosine kinasetargeted therapy for non-small cell lung cancer［J］.Cancer Biol Med，2012，9（1）：18-22.

［8］Heider K H，Kiefer K，Zenz T，et al.A novel Fc-engineered monoclonal antibody to CD37 with enhanced ADCC and high proapoptotic activity for treatment of B-cell malignancies［J］.Blood，2011，118（15）：4159-4168.

［9］張曄.骨橋蛋白與CD44v6在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)及其臨床意義［D］.承德：承德醫(yī)學(xué)院，2014.

［10］Liu YJ，Yan PS，Li J，et al.Expression and significance of CD44s，CD44V6，and nm23 mRNA in human cancer［J］. World J Gastroenterology，2005，11（42）：6601-6606.

［11］高艷薇.喉和下咽鱗癌中CD44V6的表達(dá)及意義［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6（1）：76-78．

［12］Bendardaf R，Algars A，Elzagheid A，et al Comparison of CD44 expression in primary tumors and metastases of colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2006，16（4）：741-746.

［13］郭慶喜，蒲霞，王璽皓，等.結(jié)直腸癌組織中CD44V6、MMP-7和E-cadherin表達(dá)及臨床意義［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（23）：4478-4481.

［14］黃榮暉.CD133與CD44v6在新輔助放化療后直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［D］.福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2014.［15］陳兵.CD44v6在胃癌、癌前病變及癌旁組織中的表達(dá)及其臨床意義［D］.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2014.

［16］彭土生，楊啟君，余桂芳，等.三氧化二砷對HBx-Hep G2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響［J］.疑難病雜志，2014，13（5）：506-508，512.

［17］陳秋梅，郭華，黃艷萍，等.CD44v6與MMP-7在子宮內(nèi)膜異位癥r-AFs分期中表達(dá)的相關(guān)性研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，12（2）：85-87.

［18］Du L，Wang H，He L，et al.CD44 is of functional importance for colorectal cancer stem cells［J］.Clin Cancer Res，2008，14（21）：6751-6760.

Expression of Cd44V6 in colorectal cancer tissue and serum and its clinical significance

HUANG Wei1SONG Yunjun2▲JIANG Linhe1LIU Yunjiang1
1.Tumour Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China；2.Central Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China

Objective To investigate the expression of CD44V6 in colorectal cancer tissue and serum，and analyze its relationship with clinicopathological parameters and prognosis.Methods From January 2011 to December 2012，in Tumour Hospital of Chengde City，57 patients with coloreactal cancer underwent surgery were selected，the samples of colorectal cancer tissues，para-carcinoma tissue and serum were collected，and serum samples from 10 healthy persons were selected as control.The CD44V6 expression in tissue was detected by immunohistochemistry and the expression in serum was detected by ELISA.The relationship between CD44V6 expression and colorectal cancer patient clinicopathological parameters and prognosis were analyzed.Results The expression of CD44V6（63.16%）in colorectal cancer tissue was obviously higher than that in para-carcinoma normal tissue（10.00%），the difference was statistically significant（P＜0.01）.The expression levels of CD44V6 in serum from patients［（14.62±3.34）ng/mL］was higher than that from normal healthy persons［（3.22±1.65）ng/mL］，the difference was statistically significant（P＜0.05）.There were relationship between the expression of CD44V6 and tumor depth，the degree of differentiation，lymph nodes and pathological degree（P＜0.05）.Kaplan-Meier survival analysis showed that the 5-year survival rate in CD44V6 of high expression patients（47.22%）was significantly lower than that of low expression patients（73.91%），the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The expression of CD44V6 was upregulated in tissue and serum of colorectal cancer patients.CD44V6 may be used as an important marker to predict invasion，metastasis and prognosis in colorectal cancer.

Colorectal cancer；CD44V6；Immunohistochemistry；ELISA

R735.3

A

1673-7210（2015）12（b）-0083-04

2015-08-03本文編輯：蘇暢）

河北省承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（20142116）。