韓瑋　于明鑫　唐暉　李常蘭　賀敏　任素萍　焦章平　于群

1.北京市公安局豐臺分局物證鑒定所，北京100072；2.北京十一學(xué)校，北京100850；3.北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心，北京100192；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850

人離體紅細(xì)胞ATP含量與死亡時間和環(huán)境溫度的關(guān)系

韓瑋1，4▲于明鑫2▲唐暉3李常蘭4賀敏4任素萍4焦章平3于群4

1.北京市公安局豐臺分局物證鑒定所，北京100072；2.北京十一學(xué)校，北京100850；3.北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心，北京100192；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850

目的研究通過紅細(xì)胞ATP含量推斷早期死亡時間的適用溫度范圍和時間范圍。方法采集12名健康捐血者全血各40 mL，分裝后分別保存于15、20、25、30℃的恒溫箱中，以4 h間隔取血樣，采用生物發(fā)光法檢測ATP含量，各組進行統(tǒng)計學(xué)分析，推導(dǎo)線性回歸方程，計算各時間點的偏離時間。結(jié)果4組平均偏離時間差距較大，15、20、25、30℃組平均偏離時間分別為4.80、2.04、1.77、5.71 h，而30℃組隨著統(tǒng)計時間段的縮短平均偏離時間從5.71 h縮短至1.67 h。結(jié)論紅細(xì)胞ATP含量這一參數(shù)最佳適用溫度范圍為20～30℃，有效評估時間20℃為64 h，25℃為40 h，30℃為28 h。

死亡時間；紅細(xì)胞ATP含量；環(huán)境溫度

死亡時間推斷（estimation of the time since death）在刑事案件的偵破工作中具有非常重要的意義，在一定的溫度范圍內(nèi)，紅細(xì)胞ATP含量與保存時間具有直線相關(guān)性，可以作為死亡時間推斷的一種客觀參數(shù)［1］，常用死后間隔時間（postmortem intervals，PMI）來表達死亡時間［2］。本研究通過在不同溫度下縮短紅細(xì)胞ATP檢測時間間隔（4 h），分析離體紅細(xì)胞中ATP含量變化與PMI和環(huán)境溫度之間的關(guān)系，以評估測定紅細(xì)胞ATP含量用于推斷早期死亡時間的有效時間范圍和溫度范圍。

1　材料與方法

1.1材料

選取健康捐血者12名，均來自北京市公安局豐臺分局，男、女各6名，無血液疾病或代謝性疾病，年齡25～40歲，采血前均告知采血量、可能風(fēng)險并簽訂捐血志愿書。嚴(yán)格依照無菌操作規(guī)程，2010年3月由執(zhí)業(yè)護士用EDTA真空采血管各采集全血40 mL。

1.2方法

1.2.1血樣分組及保存將全血搖勻后，即刻將各個血樣以每份500 μL分裝到EP管中，而后分成4組，分別置于15、20、25、30℃的恒溫箱中保存。各組樣本分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h時間點取1份待檢，其中15、20℃組樣本增加52、56、60、64、68、72 h時間點。

1.2.2血紅蛋白含量測定將血樣搖勻，然后將EP管放入Sysmex-Poch-100i血液分析儀（Sysmex公司，日本）樣品槽中，測定血紅蛋白濃度（g/L）并記錄。

1.2.3紅細(xì)胞ATP待檢標(biāo)本處理取40 μL血樣加入裝有1000 μL等滲PBS緩沖液的EP管中，搖勻，置于干熱器中100℃加熱10 min，自然冷卻后13 000 r/min離心3 min，取上清液即為ATP待檢標(biāo)本。

1.2.4 ATP含量測定采用改良后生物發(fā)光法［3］。熒光素酶系緩沖液用50 mL蒸餾水溶解，標(biāo)準(zhǔn)ATP加1 mL熒光素酶系緩沖液溶解成50 μmol/L，用熒光素酶系緩沖液將熒光素-熒光素酶粉劑配成濃度3 g/L；取0.2 mL待測ATP樣品于反應(yīng)杯中，放入WDD-1型發(fā)光光度計（北京第二光學(xué)儀器廠）的反應(yīng)暗室中，注入0.8 mL熒光素酶液，記錄1 s積分最大發(fā)光強度；取ATP標(biāo)準(zhǔn)液從1∶2～1∶128倍比稀釋，同樣方法測定最大發(fā)光強度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品ATP濃度值（μmol/L）。全部試劑為中國科學(xué)院上海植物生理研究所生產(chǎn)。

1.2.5紅細(xì)胞ATP含量計算紅細(xì)胞ATP含量（μmol/ gHb）=26×樣本ATP濃度值/血紅蛋白濃度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對不同溫度組紅細(xì)胞ATP含量（［ATP］）隨保存時間（PMI）的變化進行線性回歸分析，推導(dǎo)回歸方程，并對相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性檢驗。根據(jù)不同溫度組的回歸方程進行各時間點殘差計算。30℃組另選取0～24、28、32、36、40、44 h計6個時間段進行線性回歸分析，并分別計算殘差。以環(huán)境溫度和保存時間為自變量，將不同溫度組、不同保存時間下全部數(shù)據(jù)匯總采用最小二乘法進行曲線擬合，擬合形式分別為二元一次方程、二元二次方程和二元三次方程，并對擬合結(jié)果進行AIC檢驗，AIC值越小適合度越高。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1紅細(xì)胞ATP含量隨保存時間的變化

紅細(xì)胞ATP含量隨保存時間的變化見表1，其變化趨勢見圖1。紅細(xì)胞ATP含量隨保存時間的延長呈下降趨勢。

2.2不同溫度組線性回歸分析及決定系數(shù)情況

不同溫度組線性回歸分析及決定系數(shù)（r2）情況見表2、3。各組r2差距較大，15、20、25、30℃組分別為0.961、0.988、0.994、0.936，30℃組不同時間段進行統(tǒng)計，r2值隨時間段的縮短而增大，0～24 h段為0.991。相關(guān)分析顯示，紅細(xì)胞ATP含量與保存時間呈負(fù)相關(guān)（r均為負(fù)值），各組相關(guān)分析結(jié)果顯示，ATP含量與保存時間的相關(guān)性差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　不同溫度下紅細(xì)胞ATP含量隨保存時間的變化（μmol/gHb，n=12，

表1　不同溫度下紅細(xì)胞ATP含量隨保存時間的變化（μmol/gHb，n=12，

注：“-”表示無數(shù)據(jù)

保存時間（h）15℃20℃25℃30℃0481 2 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 2.89±0.24 2.80±0.25 2.70±0.29 2.58±0.25 2.51±0.24 2.47±0.20 2.38±0.20 2.32±0.19 2.22±0.17 2.09±0.20 1.97±0.18 1.86±0.19 1.74±0.15 1.61±0.16 1.36±0.14 1.21±0.11 1.00±0.09 0.70±0.06 0.65±0.06 2.89±0.24 2.59±0.23 2.41±0.21 2.27±0.19 2.13±0.18 2.01±0.18 1.90±0.15 1.84±0.14 1.71±0.17 1.58±0.14 1.45±0.12 1.31±0.13 1.17±0.12 1.00±0.10 0.86±0.07 0.75±0.08 0.52±0.05 0.40±0.05 0.35±0.04 2.89±0.24 2.52±0.23 2.23±0.20 2.12±0.21 1.84±0.16 1.63±0.17 1.37±0.11 1.05±0.10 0.90±0.08 0.72±0.06 0.57±0.05 0.37±0.04 0.30±0.03 2.89±0.24 2.50±0.23 2.15±0.20 1.89±0.14 1.38±0.10 1.03±0.07 0.87±0.06 0.61±0.05 0.51±0.02 0.35±0.02 0.22±0.03 0.13±0.01 0.11±0.02 ------------

圖1　不同溫度下紅細(xì)胞ATP含量隨保存時間的變化

表2　不同溫度條件下紅細(xì)胞ATP含量與保存時間的線性回歸分析

表3　30℃組不同時間段紅細(xì)胞ATP含量與保存時間的線性回歸分析

2.3不同溫度組偏離時間分析

不同溫度組偏離時間情況見表4、5。以各指標(biāo)原始數(shù)據(jù)分別代入線性回歸方程，計算殘差（估計保存時間與實際保存時間之差），同一時間點上12個殘差絕對值的均值為各時間點推測的平均偏離時間。表4、5結(jié)果顯示，各組平均偏離時間亦差距較大，15、20、25、30℃組總體平均值分別為4.80、2.04、1.77、5.71 h，而30℃組隨著統(tǒng)計時間段的縮短總體平均值從5.71 h縮短至1.67 h。

表4　不同溫度下平均偏離時間的比較（h）

表5　30℃組不同時間段平均偏離時間的比較（h）

2.4紅細(xì)胞ATP含量與保存時間和保存溫度關(guān)系的擬合方程

紅細(xì)胞ATP含量與保存時間和保存溫度關(guān)系的擬合方程顯示，二元三次方程的AIC值最小。見表6。

3　討論

死亡時間常通過死后尸體現(xiàn)象、體液化學(xué)變化、直腸溫度、昆蟲學(xué)原理等方法進行分析推斷［4-6］。隨著DNA技術(shù)的發(fā)展，一些研究嘗試?yán)肈NA降解和蛋白質(zhì)降解規(guī)律推斷死亡時間［7-15］，但迄今為止，仍沒有一種方法已在法醫(yī)學(xué)實踐中得到廣泛應(yīng)用。

表6　紅細(xì)胞ATP含量與保存時間和保存溫度關(guān)系的擬合方程

學(xué)者們很早就發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度對死亡時間推斷的明顯影響［16-20］，玻璃體液鉀離子濃度與死亡時間關(guān)系的研究，是近半個世紀(jì)以來法醫(yī)病理學(xué)者們一直研究的熱點。學(xué)者們選用不同的檢測方法和實驗對象，用所得實驗數(shù)據(jù)建立了各自的死亡時間與玻璃體液鉀離子濃度變化的回歸方程。但由于各自研究中的影響因素有差異，造成了直線回歸方程斜率和截距的不同。學(xué)者們提出用玻璃體液鉀離子濃度推斷死亡時間，應(yīng)考慮尸溫因素。研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境溫度為26～29℃時的回歸方程的直線斜率，要比環(huán)境溫度為13～17℃時的回歸方程的直線斜率大［16-20］。這就說明了環(huán)境溫度對玻璃體液中鉀離子濃度變化的影響。環(huán)境溫度越高，死后玻璃體液中鉀離子濃度上升的速度越快。

利用血液體外保存測定紅細(xì)胞ATP含量變化，證實紅細(xì)胞ATP含量的下降在一定溫度范圍內(nèi)與保存時間線性相關(guān)，說明利用紅細(xì)胞ATP這一參數(shù)推斷PMI具有較好的應(yīng)用情景；但同時也發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度對紅細(xì)胞ATP含量變化有較大影響，因此應(yīng)進一步探討和建立環(huán)境溫度等對紅細(xì)胞ATP含量變化的影響模型［1］。張艷苓等［21］曾探討人離體肝組織胺類產(chǎn)生與死亡時間和環(huán)境溫度的關(guān)系。

至于如何判斷某回歸方程的應(yīng)用價值，龔志強等［22］認(rèn)為r2＞0.9的離子，其方程可用于PMI的推斷。但是劉茜等［23］認(rèn)為評價方程不應(yīng)僅考慮r2的值，還應(yīng)該注意評價方程在推斷PMI時產(chǎn)生的預(yù)測偏離時間。筆者較為認(rèn)同劉茜等［23］的觀點，根據(jù)法醫(yī)辦案經(jīng)驗，對死亡時間推斷其誤差應(yīng)控制在2 h左右為佳，否則其實際應(yīng)用意義將大打折扣。

實驗結(jié)果顯示，紅細(xì)胞ATP含量變化具有與死亡時間直線相關(guān)性，且相關(guān)性差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因而這一參數(shù)可以用于死亡時間的推斷。r2從高到低依次為25℃、20℃、15℃和30℃組，但30℃組縮短時間決定系數(shù)明顯升高，筆者分析，30℃下紅細(xì)胞ATP下降過快，較快進入極低水平（平臺期），因此其適用范圍應(yīng)在進入平臺期之前。而在較低溫度（15℃組）下ATP下降速度過于緩慢，在此情況下檢測相對誤差較大，很難保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

以AIC值最小為標(biāo)準(zhǔn)，Z=2.689-0.009X-0.00006Y2X為最佳擬合方程（其中Z為紅細(xì)胞ATP含量，X為保存時間，Y為保存溫度）。該方程提示，紅細(xì)胞ATP含量與保存時間呈線性關(guān)系，而與保存溫度呈指數(shù)關(guān)系。當(dāng)然，上述擬合方程還較為粗糙，不夠精細(xì)，通過進一步縮短檢驗間隔時間及擬合層次，將可以推倒出更為精確的擬合方程。

綜上所述，以偏離時間2 h左右為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表4、5的實驗結(jié)果，筆者認(rèn)為，紅細(xì)胞ATP含量這一參數(shù)最佳適用溫度范圍為20～30℃，有效評估時間20℃為64 h，25℃為40 h，30℃為28 h，30℃以上進一步縮短，而15℃以下預(yù)測平均偏離時間較大，不宜采用此參數(shù)。

［1］韓瑋，程羲，唐暉，等.紅細(xì)胞ATP含量變化與早期死亡時間相關(guān)性的研究［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（增刊）：29-31.

［2］包容，閆平，屈雪菊，等.用流式細(xì)胞術(shù)檢測白細(xì)胞DNA含量推測死亡時間［J］.武漢大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，28（1）：89-92.

［3］畢蔚茹，韓瑋，于洋.生物發(fā)光法測定紅細(xì)胞三磷酸腺苷含量的優(yōu)化與評價［J］.山西醫(yī)藥雜志，2005，34（5）：421.

［4］Madea B，Rodig A.Time of death dependent criteria in vitreous humor-Accuracy of estimating the time since death［J］.Forensic Sci Int，2006，164（2）：87-92.

［5］Honjyl K，Yonemitsu K，Tsunenari S.Estimation of early postmortem intervals by a multiple regression analysis using rectal temperature and non-temperature based postmortem changes［J］.J Clin Forensic Med，2005，12（5）：249-253.

［6］Turchetto M，Vanin S.Forensic entomology and climatic change［J］.Forensic Sci Int，2004，146（2）：207-209.

［7］Shu X，Liu Y，Ren L，et al.Correlative analysis on the relation between PMI and DNA degradation of cell nucleus in human different tissue［J］.J Huazhong Univ Sci Tecnolog Med Sci，2005，25（4）：423-426.

［8］Di Nunno NR，Costantinides F，Bernasconi P，et al.Is flow cytometric evaluation of DNA degradation a reliable method to investigate the early postmortem period？［J］. Am J Forensic Med Pathol，1998，19（1）：50-53.

［9］Marchevsky AM，Truong H，Tolmachoff T.A rule-based expert system for the automatic classification of DNA“Ploidy”histograms measured by the cas200 image analysis system［J］.Cytometry，1997，30（1）：39-44.

［10］Parafiniuk M.Phenomenon of karyolysis in cytophotomorphometric examinations［J］.Ann Acad Med Stetin，1998，43（1）：1-5.

［11］Robert K，Sable S.Charaterization of factors in routine laboratory proctols that significantly influence the Feulgen reaction［J］.J Histolchem Cytochem，1993，41（6）：935-945.

［12］劉良，張力，劉亞玲，等.大鼠腦細(xì)胞DNA含量與死亡時間關(guān)系的圖像分析［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2000，15（1）：1-3.

［13］劉良，彭東兵，劉艷，等.大鼠腎細(xì)胞核DAN含量與死亡時間關(guān)系的研究［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2001，17（2）：65-68.［14］王成毅，任亮，徐洪新，等.死亡方式對大鼠DNA降解影響的圖像分析研究［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2001，16（s）：1-4.

［15］王慧君，饒廣勛，黃光照，等.死后組織DNA含量與死亡時間關(guān)系的研究［J］.刑事技術(shù)，2000，25（1）：9-11.

［16］Gardiner EE，Newberry RC，Keng JY.Avian vitreous humor concentrationsofinosine，hypoxanthine，xanthine，uric acid，uracil and uridine as influenced by age and sex：their relevance as indicators of ante-mortem hypoxia［J］.Forensic Sci Int，1990，47（2）：123-127.

［18］James RA，Hoa-Ley PA，Sampson BG，et al.Determination of postmortem interval by sampling vitreous humour［J］. Am J Forensic Med Pathol，1997，12（6）：1158-1162.

［19］Munoz JI，Suarez-Penaranda JM，Otero XL.A new perspective in the estimation of postmortem interval（PMI）based on vitreous［J］.Forensic Sci，2001，46（2）：209-214.

［20］Munoz Barus JI，Suarez-Penaranda J，Otero XL，et al. Improved estimation of postmortem interval based on differential behaviour of vitreous potassium and hypoxantine in death by hanging［J］.Forensic Sci Int，2002，125（1）：67-74.

［21］張艷苓，鄧小軍，盧延旭，等.人離體肝組織胺類產(chǎn)生與死亡時間和環(huán)境溫度的關(guān)系［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2002，17（6）：14-15.

［22］龔志強，曾憲斌，孫躍剛，等.家兔眼玻璃體液21種元素含量與PMI關(guān)系的研究［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（2）：67-69.

［23］劉茜，武盛國，汪嵐，等.雙眼交替微量取樣檢測兔玻璃體液鉀鎂離子濃度推測死亡時間［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（1）：32-34.

Correlation of ATP content in RBCs with both postmortem intervals and temperature of surroundings

HAN Wei1，4▲YU Mingxin2▲TANG Hui3LI Changlan4HE Min4REN Suping4JIAO Zhangping3YU Qun4
1.Forensic Science Identification Institute，F(xiàn)engtai Sub-Bureau of Beijing Municipal Public Security Bureau，Beijing 100072，China；2.Beijing National Day School，Beijing100850，China；3.Forensic Inspection Appraisal Center，Beijing Municipal Public Security Bureau，Beijing100192，China；4.Institute of Field Operations Blood Transfusion，A-cademy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China

Objective To estimate suitable temperature and time scales about postmortem interval（PMI）in early stage by calculating ATP of RBCs.Methods 40 mL blood collected from 12 healthy donors were stored at 15，20，25，30℃respectively.Technical parameter as ATP content in RBCs was tested every 4 hours using bioluminescence assay.By statistical analysis，the regression equations and deviations of time point were obtained.Results There was a large gap on mean time deviation among 4 groups.The mean time deviation was 4.80 h in the 15℃group，2.04 h in the 20℃，1.77 h in the 25℃and 5.71 h in the 30℃.Meanwhile，the mean time deviation was reduced from 5.71 h to 1.67 h over time in the 30℃group.Conclusion The best suitable temperature scale of ATP content in RBCs is during 20-30℃. Effective time scale is 64 h at 20℃，40 h at 25℃，28 h at 30℃.

Postmortem intervals；ATP content in RBCs；Temperature of surroundings

ea B，Henssg C，Honig W.

for determing the time of death by potassium in vitreous humor［J］. Forensic Sci Int，1989，40（3）：231-243.

R446.11

A

1673-7210（2015）12（b）-0008-04

2015-09-10本文編輯：程銘）

公安部應(yīng)用創(chuàng)新計劃項目（2009YYCXBJSJ002）?！⒘械谝蛔髡?/p>

焦章平（1971-），男，主任法醫(yī)師；研究方向：法醫(yī)物證檢驗及研究。于群（1970-），男，研究員；研究方向：蛋白質(zhì)修飾在疾病防治中的應(yīng)用。