劉國(guó)紅 劉波 林營(yíng)志 唐建陽(yáng)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003）

基于脂肪酸生物標(biāo)記與16S rRNA的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析比較

劉國(guó)紅 劉波 林營(yíng)志 唐建陽(yáng)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003）

旨在探究脂肪酸作為一種有效的芽胞桿菌分類標(biāo)記，以25種芽胞桿菌模式菌株為研究對(duì)象，對(duì)芽胞桿菌進(jìn)行脂肪酸組分和16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析比較。結(jié)果表明，脂肪酸系統(tǒng)發(fā)育分析能充分體現(xiàn)芽胞桿菌種類間的親緣關(guān)系，并且按生物學(xué)特性進(jìn)行聚類分群，而16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育僅完美體現(xiàn)出種間的親緣關(guān)系。利用脂肪酸分析可將25種芽胞桿菌完全準(zhǔn)確分開，且將生物學(xué)特性相同的芽胞桿菌種類聚為一類，如堿性條件下生長(zhǎng)良好的4種芽胞桿菌（B. agaradhaerens、B. alacalphilus、B. alkalitelluris和B. fastidiosus）聚為一類，芽胞桿菌為圓形的芽胞桿菌（B. fusiformis、B. odysseyi 和B. sphaericus）聚為一類。結(jié)果表明，脂肪酸分析不僅根據(jù)親緣關(guān)系進(jìn)行聚類，還可以根據(jù)生物學(xué)特性對(duì)芽胞桿菌進(jìn)行分類。

芽胞桿菌；脂肪酸生物標(biāo)記；16S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育分析

芽胞桿菌屬（Bacillus）屬于細(xì)菌界（Bacteria），厚壁菌門（Firmicutes），桿菌綱（Bacilli），芽胞桿菌目（Bacillales），芽胞桿菌科（Bacillaceae），是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌。由于大多數(shù)芽胞桿菌種類可以產(chǎn)生多種多樣的活性物質(zhì)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等領(lǐng)域有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此研究它們的分類地位對(duì)其應(yīng)用有著更重要的研究意義［1，2］。

在研究微生物進(jìn)化分類時(shí)，人們通常根據(jù)一些相對(duì)保守的序列進(jìn)行分析，如rRNA序列、蛋白質(zhì)的氨基酸序列、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。原因一方面是由于這些保守的序列會(huì)帶來相對(duì)可靠的結(jié)果；另一方面是由于在數(shù)據(jù)庫(kù)中，這些序列可以比較方便的得到。細(xì)菌分類及系統(tǒng)發(fā)育分析常借助16S rRNA作為標(biāo)尺，但16S rRNA序列的保守性使得某些親緣關(guān)系密切的種類無(wú)法區(qū)分開，在系統(tǒng)進(jìn)化分析上存在一些缺陷［3］。鑒于芽胞桿菌分類的復(fù)雜性，使得尋找和建立這類細(xì)菌準(zhǔn)確的分類方法頗受關(guān)注。由于細(xì)菌不同屬、種，甚至不同株之間脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵位置、取代基團(tuán)等都存在差異，脂肪酸是細(xì)胞膜的重要遺傳表達(dá)產(chǎn)物，與DNA具有同源性，因此脂肪酸分析技術(shù)在細(xì)菌分類中具有重要作用［4］。1963年，Able等［5］首次提出證據(jù)表明細(xì)胞脂肪酸可以成功的鑒定細(xì)菌。Kaneda［6］將22株芽胞桿菌分為6個(gè)群，K?mpfer［7］證明脂肪酸生物標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定性，可以作為芽胞桿菌屬種類分類鑒定的一種有效手段。張曉霞等［8］利用脂肪酸成分對(duì)不動(dòng)桿菌進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果表明脂肪酸鑒定結(jié)果和16S rRNA基因分析結(jié)果一致，在種水平上利用16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與脂肪酸組分分析的結(jié)果可互為補(bǔ)充，相互印證。目前隨著脂肪酸分析技術(shù)的日益成熟，基于脂肪酸分析技術(shù)的氣相色譜Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)，使脂肪酸分析更加快速、準(zhǔn)確，在細(xì)菌分類中被廣泛應(yīng)用。脂肪酸分析可區(qū)分屬、種并進(jìn)行聚類。本研究對(duì)25種芽胞桿菌屬模式菌株進(jìn)行脂肪酸組成分析，并與16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)行比較，旨在為揭示基于脂肪酸生物標(biāo)記的芽胞桿菌鑒定的準(zhǔn)確性，基于脂肪酸生物標(biāo)記的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育與芽胞桿菌生物學(xué)演化的關(guān)系，與16S rRNA芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育的差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 所有供試菌株來自于本實(shí)驗(yàn)室福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源所農(nóng)業(yè)生物研究中心，分別引自德國(guó)微生物菌種保藏中心（DSMZ）、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）和瑞典Geborg大學(xué)菌物保藏中心（CCUG），詳見表1。

表1 供試菌株信息

1.1.2 主要試劑和儀器 皂化試劑（試劑I）：150mL去離子水和150 mL甲醇混勻合，加入45 g NaOH，同時(shí)攪拌至完全溶解；甲基化試劑（試劑II）：325 mL 6 mol/L的鹽酸加入到275 mL甲醇中，混合均勻；萃取試劑（試劑III）：加200 mL甲基叔丁基醚到200 mL正己烷中，混合均勻；洗滌試劑（試劑IV）：在900 mL去離子水中加入10.8 g NaOH，攪拌至完全溶解；飽和NaCl溶液：在100 mL去離子水中加入40 g NaCl。以上所有有機(jī)試劑均為色譜（HPLC）級(jí)，購(gòu)于Sigma公司，無(wú)機(jī)試劑均為優(yōu)級(jí)純。安捷倫7890 N型氣相色譜、Sherlock MIS、振蕩器、水浴鍋、10 mL帶蓋試管、玻璃量筒等。所有的玻璃器皿均須烘干后使用。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和保存 所有供試菌株均采用TSA（BD，US）培養(yǎng)基進(jìn)行活化，28℃培養(yǎng)2 d。采用-80℃甘油冷凍法保存供試菌株，進(jìn)一步試驗(yàn)備用。

1.2.2 芽胞桿菌脂肪酸的提取、檢測(cè)及分析

1.2.2.1 菌體獲取及脂肪酸的提取 參照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行。在TSB培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌株按四區(qū)劃線接種至新鮮TSB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h。刮取20 mg菌體，置于試管，加入1 mL溶液I，100℃水浴30 min。冰浴中迅速冷卻后加入2 mL溶液II，混勻后80℃水浴作用10 min。迅速冷卻，加入1.25 mL溶液III。震蕩10 min，吸棄下層溶液。然后中加入3 mL溶液IV及兩滴飽和NaCl溶液，震蕩5 min。靜止，待溶液分層后，吸取上層液體于GC樣品管中待測(cè)。

1.2.2.2 細(xì)菌脂肪酸成分檢測(cè) 采用美國(guó)Agilent 7890 N型氣相色譜系統(tǒng)，包括全自動(dòng)進(jìn)樣裝置、石英毛細(xì)管柱及氫火焰離子化檢測(cè)器；通過細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分進(jìn)行細(xì)菌鑒定的分析軟件采用Sherlock MIS6.0（Microbial Identification System）（美國(guó)MIDI公司產(chǎn)品）。在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170℃起始，每分鐘升溫5℃，升至260℃，而后再每分鐘升溫40℃，升至310℃，維持90 s；汽化室溫度250℃、檢測(cè)器溫度300℃；載氣為氫氣（2 mL/ min）、尾吹氣為氮?dú)猓?0 mL/min）；柱前壓68.95 Kpa；進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣分流比100∶1。

1.2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用林營(yíng)志等［9］編程軟件PLFAEco處理后提取出脂肪酸數(shù)據(jù)，然后利用生物統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析 芽胞桿菌模式菌株序列來自EzTaxon網(wǎng)站［10］。16S rRNA序列經(jīng)過ClustalX2［11］程序多重比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Jukes-Cantor模型［12］估計(jì)，利用Mega4.0軟件［13］采用鄰接法（Neighbour-Joining）［14］進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)采用1 000次自展值（Bootstrap value）分析來評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［15］。

2 結(jié)果

2.1 芽胞桿菌的脂肪酸成分分析

對(duì)25種芽胞桿菌進(jìn)行了脂肪酸成分的測(cè)定，檢測(cè)出22種已知脂肪酸和4種Summed Feature型，每種芽胞桿菌的具體脂肪酸成分見表 2。

表2顯示，芽胞桿菌的脂肪酸主要以支鏈脂肪酸為主，少數(shù)種類含有不飽和脂肪酸，主要類型即脂肪酸含量大于10%的為15：0 iso、15：0 anteiso、17：0 iso、14：0 iso、16：0、16：0 iso和 17：0 anteiso。不同芽胞桿菌種類的脂肪酸成分和含量不同，如蠟狀芽胞桿菌類群主要脂肪酸類型為15：0 iso、17：0 iso、16：0、13：0 iso和Summed Feature 3（16：1 ω6c and/or 16：1 ω7c），其次為15：0 anteiso、17：1 iso ω5c、14：0 iso、17：0 anteiso和13：0 anteiso。球形芽胞桿菌類群B. fusiformis、B. odysseyi、B. sphaericus主要脂肪酸為15：0 iso、15：0 anteiso和16：0 iso，其次為17：0 iso、17：0 anteiso、16：1 ω7c alcohol、14：0 iso和16：0?？莶菅堪麠U菌類群B. vallismortis、B. atrophaeus和B. mojavensis脂肪酸主要為15：0 iso、15：0 anteiso和17：0 anteiso，其次為17：0 iso、16：0 iso、16：0和14：0 iso。酸性芽胞桿菌B. acidicola和B. acidiproducens主要脂肪酸為15：0 anteiso和17：0 anteiso。嗜堿芽胞桿菌類群B. agaradhaerens、B. alacalphilus、B. alkalitelluris和B. fastidiosus脂肪酸主要為16：0、15：0 iso、15：0 anteiso和17：0 iso。短小芽胞桿菌類群B. altitudinis、B. pumilus和B. safensis脂肪酸主要為15：0 iso和15：0 anteiso， 其 次 為17：0 anteiso、17：0 iso、16：0 iso、16：0和14：0 iso。簡(jiǎn)單芽胞桿菌類群B. koreensis、B. aryabhattai、B. megaterium、B. muralis、B. simplex和B. novalis的主要脂肪酸為15：0 iso和15：0 anteiso，其次為17：0 anteiso、17：0 iso、16：0 iso、16：0、14：0和14：0 iso。

表2 供試菌株的脂肪酸含量

2.2 基于脂肪酸生物標(biāo)記的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

利用生物統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0采用歐式距離對(duì)25種芽胞桿菌進(jìn)行脂肪酸聚類分析，可以分為兩大類，具體見圖 1。第一類包含13種菌，進(jìn)一步可分為4個(gè)小分支：B. safensis、B. pumilus和B. altitudinis聚為一個(gè)分支，B. aryabhattai、B. novalis和B. koreensis聚為一個(gè)分支，B. odysseyi、B. sphaericus和B. fusiformis聚為一個(gè)分支，B. mycoides、B. thuringiensis、B. cereus和B. pseudomycoides聚為一個(gè)分支。第二類包含12種菌，可分為兩個(gè)小分支：B. alcalophilus、B. fastidiosus、B. alkalitelluris、B. vallismortis和B. agaradhaerens聚為一個(gè)分支，B. acidicola和B. acidiproducens、B. atrophaeus和B. mojavensis、B. megaterium、B. simplex和B. muralis聚為一個(gè)分支。

圖1 基于脂肪酸生物標(biāo)記的芽胞桿菌聚類分析

2.3 基于16S rRNA基因芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

25種芽胞桿菌采用ClustalX 2軟件進(jìn)行多序列分析，并通過Mega4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，芽胞桿菌16S rRNA分類將芽胞桿菌分為兩大類，第一類包含4個(gè)小分支，分別為：B. fastidiosus、B. alkalitelluris、B. megaterium、B. aryabhattai和B. koreensis聚為一個(gè)分支，B. novalis、B. simplex和B. muralis聚為一個(gè)分支，B. odysseyi、B. sphaericus和B. fusiformis聚為一個(gè)分支，B. mycoides、B. thuringiensis、B. cereus和B. pseudomycoides聚為一個(gè)分支。第二類包含3個(gè)小分支，分別為：B. acidicola和B. acidiproducens聚為一個(gè)分支，B. alcalophilus和B. agaradhaerens聚為一個(gè)分支，B. safensis、B. pumilus和 B. altitudinis，B. atrophaeus、B. vallismortis和 B. mojavensis聚為一個(gè)分支。

2.4 芽胞桿菌脂肪酸與16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析比較

基于脂肪酸生物標(biāo)記的芽胞桿菌聚類與16S rRNA聚類分析相比有一些差異，表 3顯示，脂肪酸聚類結(jié)果與16S rRNA不同的是B. novalis和B. megaterium在聚類樹中的位置互換，B. fastidiosus、B. alkalitelluris、B. alcalophilus和B. agaradhaerens在脂肪酸聚類分析中僅聚為一個(gè)分支，而非16S rRNA進(jìn)化樹中的兩個(gè)獨(dú)立分支，B. vallismortis與后4種芽胞桿菌聚在一起。脂肪酸分類主要依據(jù)是生物學(xué)特性，而16S rRNA分類則主要依據(jù)DNA堿基相似性。

圖2 基于16S rRNA芽胞桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

本研究針對(duì)25個(gè)芽胞桿菌種類進(jìn)行了基于16S rRNA基因和脂肪酸生物標(biāo)記系統(tǒng)發(fā)育分析的比較，結(jié)果表明，脂肪酸生物標(biāo)記可以如16S rRNA基因一樣為研究近親緣物種之間的進(jìn)化關(guān)系提供有用的信息，而且在有些種類的分群上脂肪酸更具有優(yōu)勢(shì)。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)中芽胞桿菌脂肪酸數(shù)據(jù)的增加，可以進(jìn)行更深入的研究。盡管脂肪酸提取分析需要較嚴(yán)格的操作標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)需要實(shí)驗(yàn)室具備專門的儀器，這些局限性隨著科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展都已逐步得到改善。脂肪酸鑒定已發(fā)展一種相對(duì)成熟的鑒定方法，在許多菌株中都曾有過應(yīng)用。Abel 等［5］早在1963年就指出脂肪酸可用于細(xì)菌鑒定，細(xì)胞脂肪酸分析（Microbial identification system，MIDI）鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用使微生物脂肪酸分析標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果迅速而準(zhǔn)確，且費(fèi)用低廉，因此近些年被廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定中［16］。吳愉萍等［17］也將Sherlock MIS系統(tǒng)應(yīng)用于土壤細(xì)菌鑒定的研究，結(jié)果表明該系統(tǒng)可以將分離菌株準(zhǔn)確地鑒定到種，甚至可以進(jìn)行種下分化鑒定分析。Whittaker等［18］研究證明脂肪酸分析可以快速靈敏地鑒定Francisella tularensis。劉波［19］出版的《微生物脂肪酸生態(tài)學(xué)》中，以本實(shí)驗(yàn)室分離芽胞桿菌為例，比較了脂肪酸鑒定與16S rRNA分子鑒定，結(jié)果表明，98%的芽胞桿菌種類用脂肪酸鑒定結(jié)果與16S rRNA分子鑒定結(jié)果相同，說明脂肪酸組成分析可快速而準(zhǔn)確地對(duì)芽胞桿菌類群的菌株進(jìn)行初步的鑒定。黃朱梁［20］用Sherlock微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定了從貽貝中分離的蠟樣芽胞桿菌，并用生理生化鑒定和PCR鑒定驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性。同時(shí)，通過對(duì)芽胞桿菌模式菌株的脂肪酸分析，我們首次報(bào)道了芽胞桿菌脂肪酸聚類分析與16S rRNA聚類結(jié)果的比較分析。

另外，由于16S rRNA基因高度保守，親緣關(guān)系在種以上水平的菌株具有很高的分辨率，但對(duì)親緣關(guān)系比較近的種分辨率不高。一般來講，菌株之間16S rRNA基因序列相似性＞97%，可能屬于同一種；但16S rRNA基因序列相似性在99%以上，仍可能屬于不同的種，需要DNA-DNA雜交等試驗(yàn)來進(jìn)一步確定?；?6S rRNA的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育，唯一依據(jù)就是基因序列相似性，這一結(jié)果無(wú)法完美地體現(xiàn)芽胞桿菌生物學(xué)特性與系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，如喜酸環(huán)境生存的芽胞桿菌B. acidicola、B. acidiproducens、B. atrophaeus和B. mojavensis等，喜堿環(huán)境生存的芽胞桿菌B. alcalophilus、B. fastidiosus、B. alkalitelluris和B. agaradhaerens等，不能聚為同一個(gè)分支。

表3 芽胞桿菌脂肪酸和16S rRNA分類結(jié)果比較

本研究選取了25種芽胞桿菌模式菌株作為研究對(duì)象，比較分析了芽胞桿菌脂肪酸聚類和16S rRNA聚類分析的差異。研究發(fā)現(xiàn)利用脂肪酸組成分析也可以成功將供試菌株完全準(zhǔn)確地區(qū)分開，這一點(diǎn)與16S rRNA的分類結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)在芽胞桿菌“種”的分類地位上，脂肪酸聚類結(jié)果比16S rRNA基因進(jìn)化分析更具有優(yōu)勢(shì)，不僅可以根據(jù)進(jìn)化關(guān)系確定種的分類地位，還根據(jù)生物學(xué)特性將相同的菌株聚在一起，如本研究的供試菌株4種芽胞桿菌均為嗜堿菌，在16S rRNA進(jìn)化分析中聚類為兩個(gè)獨(dú)立分支，而脂肪酸則根據(jù)其相同的生物學(xué)特性將其聚為一個(gè)分支。

本研究?jī)H以芽胞桿菌屬的種類為研究對(duì)象進(jìn)行分析，對(duì)脂肪酸生物標(biāo)記在芽胞桿菌近緣屬上的應(yīng)用是否具有同樣的效果需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究比較分析了25種芽胞桿菌模式菌株脂肪酸組分和16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化，結(jié)果表明脂肪酸分析可將25種芽胞桿菌完全準(zhǔn)確地分開，且將生物學(xué)特性相同的芽胞桿菌種類聚為一類，如堿性條件下生長(zhǎng)良好的4種芽胞桿菌（B. agaradhaerens、B. alacalphilus、B. alkalitelluris和B. fastidiosus）聚為一類，芽胞桿菌為圓形的芽胞桿菌（B. fusiformis、B. odysseyi 和B. sphaericus）聚為一類。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Comparsion of Bacillus Species Classification Based on Fatty Acid and 16S rRNA Gene

Liu Guohong Liu Bo Lin Yingzhi Tang Jianyang
（Agricultural Bio-resource Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003）

In order to explore the application of fatty acid composition in taxonomy of Bacillus species， the fatty acid constitutions of 25 strains were detected by Microbial Identification System（MIDI）. The clusters of fatty acid profiles and 16S rRNA gene sequences were analyzed by SPPS16.0 and Mega4， respectively. The results showed that phylogeny analysis based on the fatty acid biomarkers could not only fully reflect the relationships among the Bacillus species， but also group the Bacillus species according to the biological characteristics. However，16S rRNA phylogeny only perfectly showed the relationships among the species. For example， four species growing well under the alkaline conditions and three species round spore-forming were clustered together， respectively. Result showed that Bacillus species can be clustered together not only according to the related ship， but also classified by the biological characteristics.

Bacillus；fatty acid profile；16S rRNA；phylogeny

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.021

2014-08-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370059），“973”前期研究專項(xiàng)（2011CB111607），農(nóng)業(yè)部“948計(jì)劃”（2011-G25）

劉國(guó)紅，博士，研究方向：芽胞桿菌資源分類及功能研究；E-mail：Liuguohong624@sina.com

劉波，博士，研究員，研究方向：微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物；E-mail：fzliubo@163.com