齊琪 亓云月 楊慧 畢彩紅 韓曉弟

（山東大學，威海 264209）

松江鱸（Trachidermus fasciatus）凝血因子XI的基因克隆與表達分析

齊琪 亓云月 楊慧 畢彩紅 韓曉弟

（山東大學，威海 264209）

克隆松江鱸凝血因子XI基因cDNA序列，分析表達模式。利用RACE 技術(shù)從松江鱸中克隆獲得了凝血因子XI的cDNA全長序列（命名為TfXI），并對其進行生物信息學和表達模式分析。獲得TfXI cDNA全長1 287 bp，包括13 bp 的5'端非編碼區(qū)，1 143 bp的開放閱讀框以及131 bp 的3'端非編碼區(qū)。開放閱讀框編碼280個氨基酸的多肽鏈，預測的蛋白大小為42.9 kD。N端含有由第22-105位氨基酸，112-196位氨基酸、205-279位氨基酸和289-369位氨基酸形成的4個串聯(lián)排列的典型APPLE結(jié)構(gòu)域。NCBI Blast結(jié)果顯示TfXI與其他物種凝血因子XI的相似性為30%-63%，進化樹分析顯示，TfXI符合傳統(tǒng)進化規(guī)律。Real time PCR分析表明，經(jīng)LPS刺激96 h后，松江鱸脾臟TfXI表達量明顯提高（P＜ 0.01）。

松江鱸；凝血因子XI；基因克隆；Real time PCR

凝血因子Ⅺ（以下簡稱FXI）是機體內(nèi)源性凝血激活途徑激發(fā)過程中的重要因子，在哺乳動物中由肝臟產(chǎn)生，與高分子量激膚原（HMWK）、激肽釋放酶原（PK）和凝血因子XII（FXII）一起構(gòu)成凝血系統(tǒng)中的接觸因子。FXI活化后，可激活凝血因子IX（FIX）為FIXa，繼而引發(fā)凝血級聯(lián)反應，完成血液凝固；同時FXI還可以穩(wěn)定已經(jīng)形成的纖維蛋白凝塊。

目前人們對FXI的研究主要集中于哺乳動物。其中，人類FXI是一種血漿糖蛋白，全長23 kb，共含有15個外顯子和 14個內(nèi)含子（A-N），可編碼成熟蛋白4個串聯(lián)的蘋果結(jié)構(gòu)域（apple domain）［1，2］，又稱為PAN超家族。人體內(nèi)成熟的FXI為2個亞單位組成的同源二聚體，由位于蘋果結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Cys-321形成的二硫鍵將兩個單體連結(jié)起來。牛、豬、小鼠的FXI也均以二聚體形式存在。Wang等［3］以敲除FXI基因的小鼠為模型，在研究FXI抗體對治療和預防靜脈血栓的作用時取得一定研究成果。根據(jù)以往的研究報道，荷斯坦牛的FXI基因缺陷會引起部分患病牛繁殖性能異常，抗病力降低［4，5］。2002年，Sinha等［6］在對兔子FXI的基因生物學特性研究時發(fā)現(xiàn)，兔子FXI的Cys-321替換成His之后并不破壞其功能活性，證明了兔子FXI是以單體的形式存在于血漿中，而二聚化形式則存在于細胞內(nèi)。這也暗示了不同物種的FXI具有結(jié)構(gòu)和功能上的差異性。

FXI 在低等動物研究鮮有報道。早期的研究曾認為，F(xiàn)XI、FXII和激肽釋放酶原等基因在魚類中是不存在的。Jiang等［7］在對河豚魚參與凝血纖溶的26種蛋白的基因組進行全面鑒定后，未能發(fā)現(xiàn)FXI、FXII以及激肽釋放酶原等接觸性同源基因。所以，F(xiàn)XI究竟在生物進化的哪個階段出現(xiàn)并不明確。

松江鱸（Trachidermus fasciatus）隸屬于鲉形目（Scorpaeniformes），杜父魚科（Cottidae），松江鱸屬（Trachidermus），是在海水繁殖孵化而在淡水生長育肥的降海洄游小型魚類，曾廣泛分布于我國東部海域?，F(xiàn)今因為過度捕撈及環(huán)境污染等造成的影響，松江鱸在我國許多水域已絕跡，目前已被列為國家二級保護動物。本研究小組采用RT-PCR和RACE技術(shù)從松江鱸體內(nèi)成功克隆得到其FXI全長cDNA基因序列，對此基因進行同源序列對比和進化樹分析，并分析經(jīng)LPS刺激后脾臟內(nèi)TfFXI表達的情況。本研究旨在填補凝血因子XI在魚類中的研究空白，一方面證明低等脊椎動物也存在FXI，對進一步深入研究FXI基因進化規(guī)律也具有重要的參考價值，同時也為FXI在魚體內(nèi)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 松江鱸（體重：15-23 g，9-10月齡），取自山東文登埠口松江鱸自然保護區(qū)，將其充氣飼養(yǎng)于12-14℃海水中（每天更換海水），使其適應實驗室養(yǎng)殖環(huán)境。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌E. coli DH5α為本實驗室保存，pMD-18-T載體為TaKaRa Biotechnology（中國大連）產(chǎn)品。

1.1.3 實驗儀器與試劑 儀器：Life Express基因擴增儀（杭州博日），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），TGL-16B高速臺式離心機，DYY-12型電泳儀，水平電泳槽，WD-9403B紫外分析儀（北京六一儀器廠），KYC1112振蕩培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司），7300實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

試劑：RNA提取試劑盒（EZNATM Total RNA Kit II）為美國Omega公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse TranscriptaseM-MLV）、RNA酶抑制劑、dNTP Mixture（10 mmol/L）均為TaKaRa Biotechnology產(chǎn)品（日本）；Taq酶、PCR mix kit、DL2000 DNA maker為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收Kit及引物合成均由上海生物生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 LPS 感染試驗 松江鱸在實驗室適應1周后進行試驗，設(shè)試驗組和對照組。試驗組腹腔注射LPS（0.04 mg/kg），對照組以PBS（50 μL/條）取代LPS。分別在腹部注射后的2、6、12、24、48、72及96 h取樣（每個時間點6條松江鱸）。

組織采集：分別取正常的（6條）、對照組和試驗組各時間點松江鱸的肝臟和脾臟組織，于液氮中混勻后裝在EP管中置于-80℃冰箱凍存，以備總RNA的提取與全長cDNA克隆。

1.2.2 總RNA的提取與SMART cDNA合成 取-80℃冷凍的組織樣品約100 mg，放入組織勻漿器，加入1 mL RNA-Solv，冰浴勻漿。根據(jù)EZNATM Total RNA Kit II試劑盒（Omega）的說明，提取組松江鱸不同組織的總mRNA。1%瓊脂糖凝膠電泳確認RNA質(zhì)量后，參照CLONTECH公司SMART（Switching mechanism at 5'end of RNA template）的指導說明合成cDNA。所用引物為：Oligo-anchor R：5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACT16（A/C/G）-3'和Smart F：5'-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3'。

1.2.3 TfXI cDNA全長的基因克隆

1.2.3.1 TfXI基因中間片段的獲得 根據(jù)羅非魚 Oreochromis niloticus（XP_003448977.1）、胡瓜 魚Osmerus mordax（ACO10049.1）、伯氏樸 麗魚 Haplochromis burtoni（XP_005946660.1）、 斑 馬宮麗魚Maylandia zebra（XP_004547842.1）、劍魚Xiphophorus maculatus（XP_005811830.1） 的 凝 血因子XI同源序列設(shè)計一對特異性引物：FXI-F1/ FXI-R1，以松江鱸肝臟cDNA為模板擴增TfXI中間片段。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃復性45 s，72℃延伸45 s，30次循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠并利用柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物與T載體pMD-18-T連接，然后轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，PCR驗證后送往上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.3.2 5'端與3'端序列的獲得 根據(jù)測序得到的中間片段設(shè)計基因特異性后引物FXI-R和5'primer配對，特異性前引物FXI-F和3' anchor R配對，以正常松江鱸肝臟組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，分別擴增目的基因的5'和3'端序列。PCR反應條件同中間片段克隆，將獲得的產(chǎn)物進行回收，測序方法同前。

以上各PCR所用引物序列，見表1。各引物均由上海生工生物工程有限公司合成，用去離子雙蒸水（ddH2O）溶解至10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 序列分析 同源比對借助BLASTX http：// web.expasy.org/blast/ 進行。用ExPASy在線生物http：//web.expasy.org/translate/，對 TfXI行蛋白翻譯，并計算其分子量，等電點用http：//web. expasy.org/protparam/進行預測。TfXI二硫鍵預測在http：//prosite.expasy.org/進行。使用SMART對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預測http：//smart.embl-heidelberg.de/。用SignalP 3.0 http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 預測目的蛋白是否存在信號肽，并用http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預測。蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測則在SWISS-MODEL http：// swissmodel.expasy.org/上進行，并用PyMol軟件對預測的三維結(jié)構(gòu)進行構(gòu)建與標注。使用MEGA 4.0的Neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建進化樹，Bootstrap值為10 000（Tamura 2007）。

表1 松江鱸凝血因子XI基因克隆引物及實時定量PCR引物

1.2.5 RT-PCR檢測受LPS刺激后TfXI在松江鱸脾臟表達變化 使用7300實時定量熒光系統(tǒng)，運用實時熒光定量PCR的方法，檢測松江鱸受LPS刺激后，脾臟內(nèi)TfXI的表達模式。設(shè)計基因特異引物TfXIRT-F和TfXIRT-R用來擴增目的基因中間片段。同時選擇持家基因β-actin作為定量內(nèi)參，利用特異性引物ActinF和ActinR 擴增松江鱸β-actin產(chǎn)生207 bp的DNA片段，引物序列見表1。按照SYBR Premix Ex的說明進行試驗，反應體系（20 μL）組成為：10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，2 μL 1∶50稀釋的cDNA，4 μL FXI RTF/ActinF、4 μL FXI RTR/ActinR。反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。為保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，試驗重復進行3次，數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT進行計算，利用t檢驗的方法分析顯著性差異，P＜0.05為可接受的顯著性差異標準。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆和序列分析結(jié)果

利用引物FXI-F1/ FXI-R1克隆獲得 233 bp的cDNA片段，BLASTx比對后發(fā)現(xiàn)是脊椎動物FXI的同源序列。通過基因特異的前引物FXIF2和3'anchor擴增到了完整的3'端，包括polyA在內(nèi)長度為750 bp；通過基因特異的后引物FXIR2和5'PCR primer擴增到了完整的5'端，包括非編碼區(qū)在內(nèi)長度為400 bp 。將中間片段，5'端和3'端基因片段進行序列比對，發(fā)現(xiàn)三者重疊區(qū)基因序列一致，說明測序結(jié)果準確可靠。經(jīng)過拼接，得到松江鱸全長為1 287 bp的TfXI cDNA序列（圖1）。 其中開放閱讀框（ORF）長度為1 143 bp，編碼380個氨基酸；5'非編碼區(qū)（5'UTR）長13 bp，在序列5'端發(fā)現(xiàn)帽子結(jié)構(gòu)（5'-GGGG）；3'非編碼區(qū)（3'UTR）長131 bp，3'端有一典型加尾信號（ATTAAA），其后12 bp處找到poly（A）尾巴，由此證明所得序列為cDNA全長。

ExPASy分析顯示這一基因編碼的蛋白分子量為42.89 kD，理論等電點為6.73。使用SignalP 3.0和SMART對其進行分析后發(fā)現(xiàn)，TfFXI cDNA的開放閱讀框包括一個由19個氨基酸殘基構(gòu)成的信號肽，后面緊跟著由第22-105位氨基酸、112-196位氨基酸、205-279位氨基酸和289-369位氨基酸形成的4個串聯(lián)排列的典型APPLE結(jié)構(gòu)域（圖2）。TMHMM-2.0預測目的蛋白無跨膜區(qū)。序列分析還顯示了3個N-糖基化位點的存在：一是從31位氨基酸到34位氨基酸的NFSG序列；二是82位到85位的NPSG序列；三是330位的NATF序列。蛋白質(zhì)的糖基化是蛋白質(zhì)加工過程的重要一步，對于蛋白質(zhì)鏈形成一定的三維結(jié)構(gòu)、錨定以及轉(zhuǎn)運都起著非常重要的作用，也是蛋白質(zhì)成為有活性狀態(tài)的前提。

2.2 TfFXI基因的同源比對與進化樹構(gòu)建

經(jīng)過BLAST比對（圖3）發(fā)現(xiàn)，TfFXI與來自伯氏樸麗魚Haplochromis burtoni（XP_005946660.1）的FXI具有63%的相似性，與斑馬宮麗魚Maylandia zebra（XP_004547842.1）和羅非魚Oreochromis niloticus（XP_003448977.1）分別有62% 和61%的相似性；與劍魚Xiphophorus maculatus（XP_00581-1830.1）的相似性為57%；與亞馬遜花鳉Poecilia formosa（XP_007559857.1）有56%的相似性；與青 鳉Oryzias latipes（XP_004074442.1） 的 相 似性為55%。而與印度牛尾魚Platycephalus indicus（BAI49518.1）的皮膚凝集素和黑鮟鱇Lophiomus setigerus（BAG66037.1）的kalliklectin分別有著60%和53%的相似性。進化樹（圖4）顯示來自魚類的FXI聚為一支，兩棲類聚在一起，哺乳動物的FXI聚在一起，魚類與兩棲類和哺乳類的親緣關(guān)系較遠，看來TfXI的進化與傳統(tǒng)動物進化關(guān)系相一致。

2.3 FXI基因二級結(jié)構(gòu)和蛋白空間預測

用SWISS-MODEL程序，建立TfXI 4個APPLE結(jié)構(gòu)域（ALD）三維結(jié)構(gòu)（圖5），發(fā)現(xiàn)每個球形結(jié)構(gòu)域均含有1個α螺旋，ALD1、ALD2、ALD4結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)相似，均含6個β片層，而ALD3只含4個β片層。用PROSITE 軟件對TfXI進行二硫鍵預測顯示，共形成9個結(jié)構(gòu)域內(nèi)部二硫鍵（ALD1：Cys48和 Cys77，Cys52和 Cys58；ALD2：Cys138和 Cys167，Cys142和 Cys148；ALD3：Cys205和Cys279，Cys231和 Cys253，Cys235和 Cys241；ALD4：Cys311和Cys340，Cys315和Cys321）。

2.4 LPS刺激后脾臟內(nèi)TfFXI表達的變化

用RT-PCR的方法研究了受LPS刺激后，TfFXI在松江鱸脾臟中不同時間段的表達譜變化（圖6）。在最初的6 h，松江鱸TfFXI 表達下降，刺激后12 h表達量明顯上調(diào)。隨后又突然下調(diào)且低于對照組，72 h至最低值。但到96 h，F(xiàn)XI表達量大幅度上調(diào)并達到最高點。

3 討論

圖1 松江鱸FXIcDNA全長序列以及由此推測的氨基酸序列

FXI是一種通過活化凝血因子IX從而參與血液凝固的蛋白酶原，是一種獨特的二聚體蛋白，其特殊的空間結(jié)構(gòu)使其區(qū)別于其他依賴于維生素K的凝血酶原［8，9］。早期的研究認為，F(xiàn)XI基因在魚類中缺失［7］；隨后，Ponczek等［10］研究認為，F(xiàn)XI等接觸因子最早是在兩棲類生物中出現(xiàn)。但通過對NCBI數(shù)據(jù)庫的搜索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XI基因在魚類中已出現(xiàn)，通過本次試驗首次得到松江鱸的FXI。對FXI進行進化分析發(fā)現(xiàn)松江鱸FXI與其他魚類聚為一支，說明FXI基因符合傳統(tǒng)進化規(guī)律，這一結(jié)果填補了FXI在生物進化分析中的空白。本研究通過同源序列比對發(fā)現(xiàn)，松江鱸FXI與兩種魚類的皮膚凝集素相似度分別達到60%和53%，且進化樹顯示二者在進化歷程上有較大的相似性，因而推測二者可能來自于同一個祖先，在進化的某一時期分離，也暗示了FXI可能具有凝集素的功能。此前已有研究表明FXI與激肽釋放酶原（PK）序列相似，且進化具有一定的同步性。而后者在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為有活性的激肽后，形成的激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein kinin system，KKS）作為一個復雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，與心臟病、腎病、炎癥反應、癌癥等疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系，這暗示了FXI可能具有類似功能，有待于進一步研究［11］。

圖2 松江鱸凝血因子XI的結(jié)構(gòu)域

對TfFXI的基因進行蛋白結(jié)構(gòu)預測與分析，發(fā)現(xiàn)其同其他物種的凝血因子一樣，都含有4個APPLE結(jié)構(gòu)域，同屬于PAN/APPLE-LIKE超家族成員。 與其他魚類的同源氨基酸之間的多重序列比對結(jié)果顯示，主要的序列基序很保守，這體現(xiàn)了其序列在進化中的重要性。目前研究認為人類FXI的4個球型結(jié)構(gòu)域的功能分別為：A1結(jié)構(gòu)域與高分子量激肽原、凝血酶原和凝血酶的結(jié)合有關(guān)；A2和A3結(jié)構(gòu)域是FIX結(jié)合部位，A3結(jié)構(gòu)域還與血小板的結(jié)合有關(guān)；A4結(jié)構(gòu)域中第321位游離的半胱氨酸是FIX兩條多肽鏈間形成二硫鍵的部位，A4結(jié)構(gòu)域還是活化的凝血因子Ⅻ（FⅫa）結(jié)合的區(qū)域。越來越多的對人類FXI缺陷癥的研究表明，大多數(shù)突變是錯義點突變和發(fā)生在個體的FXI基因簇的第4個APPLE結(jié)構(gòu)域［1，12］。目前，魚類凝血因子XI的蛋白結(jié)構(gòu)域具體功能未知，而本研究成功克隆松江鱸FXIcDNA全長序列，對于其蛋白結(jié)構(gòu)域功能的研究具有推動作用。

考慮到FXI與皮膚凝集素有一定的同源性，所以通過RT-PCR檢測TfFXI是否參與松江鱸的先天免疫。結(jié)果顯示，LPS刺激12h后，松江鱸FXI表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），96 h出現(xiàn)二次上調(diào)（P＜0.01），揭示了FXI很可能在魚類抗細菌侵染的免疫反應中起作用。類似的現(xiàn)象也在魚類的其他凝血因子中發(fā)現(xiàn)，如香魚在鰻利斯頓氏菌感染下，其肝臟中FX的表達量明顯升高［13］。說明凝血系統(tǒng)與炎癥反應及免疫應答之間存在一定的聯(lián)系。但是由于魚類的凝血與免疫系統(tǒng)同哺乳動物相比，都更加原始，需要更進一步的研究來闡明魚類凝血因子的作用，從而為理解凝血因子在脊椎動物的進化奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用RACE 技術(shù)從松江鱸中克隆獲得了凝血因子XI的cDNA全長序列（命名為TfXI），該序列全長1 287 bp，其開放閱讀框長1 143 bp，編碼280個氨基酸，預測的蛋白大小為42.9 kD，具有4個串聯(lián)排列的典型APPLE結(jié)構(gòu)域。TfXI與其他物種凝血因子XI的同源性較高，進化樹分析顯示TfXI符合傳統(tǒng)進化規(guī)律。RT-PCR分析表明，經(jīng)LPS刺激96 h后，松江鱸脾臟TfXI表達量明顯提高，預示其可能在免疫反應中發(fā)揮作用。

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圖3 TfFXI與其他物種FXI的多序列比對

圖4 松江鱸FXI 的系統(tǒng)進化樹分析

圖5 通過SWISS-MODEL預測的FXI的APPLE結(jié)構(gòu)域空間結(jié)構(gòu)

圖6 Real-time PCR檢測LPS刺激后不同時間段凝血因子XI在脾臟中的表達差異

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（責任編輯 李楠）

Songjiang Sea Bass（Trachidermus fasciatus）Analysis of Gene Cloning and Expression of Coagulation Factor XI

Qi Qi Qi Yunyue Yang Hui Bi Caihong Han Xiaodi
（Shandong University， Weihai 264209）

It was to clone the full length cDNA encoding coagulation factor XI（FXI）of Trachidermus fasciatus. A TfXI gene from Trachidermus fasciatus（TfXI）was cloned and characterized by RACE technology. The TfXI cDNA composed of 1 287 bp with a 13 bp of 5'-UTR， 1 143 bp open reading frame（ORF）and 131 bp 3'-UTR， encoded a polypeptide of 280 amino acids. Sequence alignment of TfXI showed the highest similarity of 63% with Haplochromis burtoni FXI protein. After LPS stimulation， transcripts of TfXI were significantly increased and reached to peak at 96 h p.i. It indicated that TfXI may play an important role in immune response of T. fasciatus during pathogen challenge.

Trachidermus fasciatus；coagulation factor XI；cloning；real time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.029

2014-08-26

威海市科委項目（1070432121313）

齊琪，研究方向：魚類免疫；E-mail：530287931@qq.com

韓曉弟，副教授，研究方向：海洋生物學；E-mail：hanxiaodi@sdu.edu.cn