翟曉鑫 張秀娟 楊杰 高鳳山

（大連大學生命科學與技術學院，大連 116622）

大腸桿菌表達托佩克豬SLA-1胞外區(qū)的研究

翟曉鑫 張秀娟 楊杰 高鳳山

（大連大學生命科學與技術學院，大連 116622）

為構建托佩克豬SLA-1重鏈基因原核重組表達載體并研究其在pET-21a（+）中的表達，設計引物，PCR擴增托佩克豬SLA-1基因胞外區(qū)（命名為SLA-1-TPKe），并克隆至pMD19-T Simple Vector，經酶切鑒定后將SLA-1-TPKe基因與表達系統(tǒng)pET-21a（+）連接，轉化到BL21（Rosseta）菌進行誘導表達，SDS-PAGE檢測目的蛋白。提取SLA-1-TPKe包涵體，并經SDSPAGE檢測。PCR結果顯示，SLA-1-TPKe大小為851 bp，成功克隆到pMD19-T Simple Vector，酶切鑒定大小為831 bp，連接到pET-21a（+）并轉化到BL21（Rosseta）菌，經誘導表達和SDS-PAGE檢測目的蛋白的大小為31 kD。目的蛋白以包涵體形式存在，純化后蛋白純度達到90%以上。

托佩克豬；SLA-1；重鏈基因；表達；包涵體

SLA-1屬于豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA），亦稱為豬主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）I類分子重鏈的功能基因，是重要的免疫應答基因群，分為SLA-I、SLA-II和SLA-III三類分子［1，2］。SLA-I類分子分為重鏈和輕鏈，重鏈分子含有3個功能基因，分別稱為SLA-1、SLA-2和SLA-3。輕鏈分子只有一個等位基因β2m。重鏈與輕鏈非共價結合構成SLA-I類分子，在體內結合和遞呈抗原表位［3-6］。在3個SLA-I類分子功能基因中，SLA-1基因多態(tài)性最強，目前已經可查到的SLA-1等位基因序列達到140多個，高于SLA-2和SLA-3，推測SLA-1在SLA-I類分子中利用率可能高于其他兩個功能基因［7］。而事實證明，動物MHC I類分子的重鏈、多肽及輕鏈的結合不僅在體內可以進行，在體外也可以完成［8］。本試驗所用托佩克豬是世界第二大種豬公司荷蘭國際種豬公司在20世紀60年代培育的品系，該品系豬生長快、抗病力強、遺傳性能穩(wěn)定，是目前歐美“當家”豬種［9］。目前，該品系豬已經在國內大量飼養(yǎng)，其相關的基因表達研究等正在國內外展開［10，11］。本課題組已經克隆了多個國內外品系豬的SLA-1等位基因，包括托佩克豬。托佩克豬是我國目前引進的主要飼養(yǎng)品系，研究該品系豬SLA-1的結構和功能對于今后制定針對性的疾病防治策略及種間遺傳育種具有指導意義。本研究擬在前期研究的基礎上，選取托佩克豬的SLA-1等位基因，構建其pET-21a（+）的原核表達載體，并獲得表達蛋白，旨在為今后對托佩克豬SLA-1的晶體結構解析、多肽結合等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質粒SLA-1-TPK/pMD19-T simple為大連大學分子免疫實驗室構建并保存，表達載體pET-21a（+）及菌株 Escherichia coli BL21（Rosseta）來自于中國科學院微生物研究所；Escherichia coli Top10菌株為大連大學分子免疫學實驗室保存?？寺≥d體 pMD19-T Simple Vector購自大連寶生物公司。

限制性內切酶XhoⅠ和NdeⅠ、PCR擴增酶Ex Taq、連接酶T4 DNA Ligase、低分子量蛋白Marker、DL2000 DNA Marker均購買自大連寶生物公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、IPTG、胰化蛋白胨、甘氨酸酵母提取物、NaCl、瓊脂粉、過硫酸銨、二甲基甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、三羥甲基氨基甲烷等購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計 托佩克豬SLA-1基因胞外區(qū)表達引物設計pTPK21F-SLA-1-T：5'-GGGAATTCCAT ATGGGCCCGCATTCTCTGAGCCATTTC-3'；pHB21RSLA-1-276：5'-AGTCTCGAGTTAAGGGTCCCATCTCA GGGTGAGG-3'。

1.2.2 SLA-1-TPKe基因的亞克隆 以重組質粒SLA-1-TPK/pMD19-T simple為模板，以pTPK21F-SLA-1-T/pHB21R-SLA-1-276為引物對，擴增基因鏈SLA-1-TPKe，PCR擴增條件為：94℃ 3 min；94℃ 45 s，68℃ 30 s，72℃ 45 s，33個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR結束后將產物進行核酸電泳，電泳完畢后使用凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR產物，最后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產物［12］。

SLA-1-TPKe回收產物連接pMD19-T Simple并轉化大腸桿菌Top10，37℃過夜培養(yǎng)，通過SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒抽提質粒，酶切篩選陽性克隆菌種，送至生工生物公司進行測序。

1.2.3 表達載體的構建 將篩選的陽性克隆菌抽提質粒，然后用NdeⅠ、XhoⅠ對其進行雙酶切，酶切后通過凝膠純化回收SLA-1-TPKe基因，然后與表達載體pET-21a（+）連接，轉化至感受態(tài)細胞BL21（Rosseta），涂布到含氨芐霉素的平板中，37℃過夜培養(yǎng)，挑選菌落至新鮮LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后抽提質粒，然后用NdeⅠ、XhoⅠ對其進行雙酶切篩選陽性質粒，并命名為pET-21a（+）/SLA-1-TPKe（圖1），送生物公司測序。

1.2.4 SDS-PAGE檢測SLA-1-TPKe蛋白表達 將陽性重組菌種100 μL接種5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，170 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600達0.4-0.6之間，加入IPTG 至終濃度達到1 mmol/L，37℃，170 r/min，誘導5 h后，取菌液1 mL，12 000 r/min，2 min，去上清，菌體經TE溶解并經5×SDS樣品buffer處理，SDS-PAGE測蛋白表達［13］。

1.2.5 SLA-1-TPKe包涵體的提取 表達后的SLA-1-TPKe重組菌按1%比例接種后擴大培養(yǎng)，相同方法誘導表達，6 000 r/min離心收集菌體，洗滌后采用超聲波冰浴破碎，6 000 r/min離心后，進行SDSPAGE電泳，并保存包涵體。

圖1 SLA-1-TPKe表達載體的構建

2 結果

2.1 SLA-1-TPKe基因的擴增

經PCR和瓊脂糖電泳檢測到一條約850 bp的條帶（圖2），與理論設計值851 bp相符。

圖2 SLA-1-TPKe的PCR擴增結果

2.2 SLA-1-TPKe基因亞克隆到pMD19-T Simple Vector

經連接轉化后，挑取單菌落培養(yǎng)，提取質粒，用Nde I、Xho I進行雙酶切，電泳顯示插入片段約為850 bp左右的條帶（圖3），與理論設計值831 bp大小相符。

圖3 pMD19-T Simple Vector/ SLA-1-TPKe重組質粒雙酶切鑒定

2.3 SLA-1-TPK基因亞克隆到pET-21a（+）

將與pMD19-T Simple載體連接的重組質粒雙酶切，回收目的片段后與 pET-21a（+）連接，轉化至感受態(tài)細胞BL21（Rosseta），再經雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)插入片段大小為830 bp左右（圖4），與理論值831 bp相符。

圖4 重組質粒pET-21a（+）/SLA-1-TPKe雙酶切鑒定

2.4 序列分析pET-21a（+）/SLA-1-TPK

經序列測定分析，pET-21a（+）/SLA-1-TPKe編碼的氨基酸序列與原序列100%同源（圖5）。

2.5 SDS-PAGE分析pET-21a（+）/SLA-1-TPK中的表達

將鑒定陽性的重組表達菌再經IPTG誘導，SDSPAGE檢測目的基因的表達，結果（圖6）顯示重組菌表達出一條約30 kD的蛋白，與目的蛋白理論值31 kD相符。

2.6 SLA-1-TPKe包涵體提取

SDS-PAGE檢測包涵體蛋白，發(fā)現(xiàn)包涵體蛋白的大小約30 kD，與目的蛋白大小一致，而且在包涵體提取過程中，去除了大部分雜蛋白，目的蛋白得到了純化（圖7）。

3 討論

托佩克豬是來自于荷蘭20世紀60年代培育的優(yōu)質高產品系，目前該品系豬已經在我國廣泛飼養(yǎng)。然而，對于該品系豬的基因資源了解的不多，尤其是涉及到與免疫應答有關的基因，如SLA-I類分子，對這些基因的研究將有利于針對該品系豬制定科學的免疫治療手段和策略。SLA-I類分子包括3個功能基因，SLA-1、SLA-2和SLA-3。其中SLA-1基因的多態(tài)性比較豐富，目前對其研究報道較多。然而，目前國內還沒有展開對托佩克豬SLA-1的報道研究。

圖5 亞克隆SLA-1-TPKe及序列分析

圖6 SDS-PAGE分析pET-21a（+）/SLA-1-TPKe中的表達

圖7 SDS-PAGE檢測pET-21a（+）/SLA-1-TPKe包涵體

SLA-1基因表達的重鏈可以與抗原肽及輕鏈β2m組成復合體，然后經過高爾基體加工后被遞呈到細胞表面與CD8+T細胞的TCR結合，刺激CD8+T細胞活化，分泌細胞因子，從而殺死被感染的靶細胞［14］。而事實證明，動物MHC I類分子的重鏈、多肽及輕鏈的結合不僅可以在體內進行，在體外也可以完成［15］。在體外研究MHC I類分子表達時，為了提高表達效果，一般要去掉信號肽及胞內區(qū)，而集中選擇胞外區(qū)，因為只有胞外區(qū)涉及到多肽結合等功能。

本研究以托佩克豬的SLA-1基因胞外區(qū)為研究對象，構建了原核重組表達載體并獲得表達蛋白，旨在為今后研究SLA-1分子與抗原肽以及輕鏈β2m的結合提供參考。本研究結果顯示，原核重組表達載體構建成功，插入片段大小與理論設計值831 bp相符。在插入片段的兩端，設計了Nde I和Xho I酶切位點，因為這兩個位點在pET-21a（+）載體位于多克隆位點兩端，而且Nde I本身包含起始密碼子ATG，因此表達出的目的蛋白不帶有其他標簽，非常適合于做蛋白的結構研究，也有利于其功能研究［16］。初步的誘導表達顯示，目的基因SLA-1-TPKe成功表達，大小約為30 kD，與理論設計值31 kD相符。由于目前沒有市售的SLA-1單抗，而表達蛋白不帶有任何標簽，因此蛋白不能用Western blot鑒定。但課題組通過酶切鑒定及測序初步證明表達的蛋白為SLA-1-TPK。包涵體提取，證明該重組蛋白主要以包涵體的形式存在，而且包涵體蛋白含量和純度均較高，適合進行下一步結構和功能的研究。

4 結論

本研究成功克隆及表達了托佩克豬SLA-1-TPKe，并得到其包涵體蛋白。

［1］ Vaiman M， Renard C， LaFage P， et al. Evidence for a histocompatibility system in swine（SL-A）［J］. Transplantation，1970， 10（2）：155-164.

［2］ Ando A， Kawata H， Shigenari A， et al. Genetic polymorphism of the swine major histocompatibility complex（SLA）class I genes， SLA-1， -2 and -3［J］. Immunogenetics， 2003， 55（9）：583-593.

［3］ Chardon P， Renard C， Gaillard CR， Vaiman M. The porcine major histocompatibility complex and related paralogous regions：a review［J］. Genet Sel Evol， 2000， 32（2）：109-28.

［4］ Oleksiewicz MB， Kristensen B， Ladekjaer-Mikkelsen AS， Nielsen J. Development of a rapid in vitro protein refolding assay which discriminates between peptide-bound and peptide-free forms of recombinant porcine major histocompatibility class I complex（SLAI）［J］. Vet Immunol Immunopathol， 2002， 86（1-2）：55-77.

［5］ 馮磊， 趙德， 高鳳山. 豬主要組織相容性復合體研究進展［J］.生命科學， 2012， 24（7）：686-690.

［6］ Velten FW， Renard C， Rogel-Gaillard C， et al. Spatial arrangement of pig MHC class I sequences［J］. Immunogenetics， 1999， 49（11-12）：919-930.

［7］ Gao C， Jiang Q， Guo D， et al. Characterization of swine leukocyte antigen（SLA）polymorphism by sequence-based and PCR-SSP methods in Chinese Bama miniature pigs［J］. Dev Comp Immunol，2014， 45（1）：87-96.

［8］ 于輝， 李彬， 李華， 等. SLA與免疫抗病的研究進展［J］. 中國畜牧雜志， 2009， 45（5）：60-64.

［9］ 張敬雄， 施文華， 楊昆祥. 優(yōu)良瘦肉型豬品種-托佩克配套系［J］. 云南農業(yè)， 2008（2）：18.

［10］ 白婧， 許崇波， 張強， 等. 托佩克豬SLA-2基因克隆及功能區(qū)生物信息學分析［J］. 生物技術通報， 2011（8）：133-139.

［11］ 劉騰飛， 馮磊， 田永發(fā)， 等. 托佩克豬SLA-2基因克隆與表達［J］. 動物醫(yī)學進展， 2013， 34（1）：19-23.

［12］ 劉筏， 楊金剛， 翟曉鑫， 等. 煙臺黑豬SLA-I重鏈末端生物素修飾及表達［J］. 生物技術通報， 2014（1）：191-195.

［13］ 高鳳山， 夏春， 張強， 等. 大腸桿菌表達的重組豬β2微球蛋白二級結構的圓二色譜分析［J］. 微生物學報， 2009， 49（12）：1596-1600.

［14］ Rodriguez A， Ley V， Ortuno E， et al. A porcine CD8+ T cell clone with heterotypic specificity for foot-and-mouth disease virus［J］. J Gen Virol， 1996， 77（Pt 9）：2089-2096.

［15］ Gao FS， Bai J， Zhang Q， et al. Construction of multiple recombinant SLA-I proteins by linking heavy chains and light chains in vitro and analyzing their secondary and 3-dimensional structures［J］. Gene， 2012， 502（2）：147-153.

［16］ 嚴婷婷， 茍東州， 董宋鵬， 等. 地方三品系豬SLA-1原核表達載體構建及表達研究［J］. 生物技術， 2014， 24（1）：16-19.

（責任編輯 馬鑫）

Expression of the Extracellular Domain of SLA-1 Derived from Topigs Pig in Escheichia coli

Zhai Xiaoxin Zhang Xiujuan Yang Jie Gao Fengshan
（College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622）

In order to construct the recombinant prokaryotic expressed vector of the heavy chain of SLA-1 derived from Topigs pig and to study its expression in pET-21a（+）， a pair of primers was designed to amplify the extracellular domain of SLA-1-TPK gene（named SLA-1-TPKe）followed by sub-cloning the gene into pMD19-T Simple Vector. After identification by cleavage with Nde I and Xho I， the SLA-1-TPKe was ligated to pET-21a（+）and transformed into BL21（Rosseta）to be induced to express followed by analysis of the expressing products by SDS-PAGE. Finally， the inclusion bodies of the SLA-I-TPKe was isolated and detected by SDS-PAGE. The PCR result was shown that the length of the SLA-1-TPKe was about 851 bp which was consistent with the calculated value. Then， the SLA-1-TPKe was successfully cloned into the pMD19-T Simple Vector and identified by cleavage with Nde I and Xho I and the inserted fragment was about 831 bp. In succession， the gene was successfully inserted into pET-21a（+）followed by transforming into Escherichia coli BL21（Rosseta）. After induction and expression，the SLA-1-TPKe was successfully expressed with the interest of protein about 31 kD. The protein was expressed mainly as inclusion body protein with the purity of 90%.

Topigs pig；SLA-1；the heavy chain gene；expression；inclusion protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.019

2014-07-30

國家自然科學基金項目（31172304），大連大學本科生創(chuàng)新項目（2013249）

翟曉鑫，男，研究方向：動物分子免疫學；E-mail：1689616387@qq.com

高鳳山，男，博士，副教授，研究方向：基因工程和動物分子免疫學；E-mail：gfsh0626@126.com