黃達(dá)明 李倩 管國強(qiáng) 張志才 錢靜亞 宋慶春

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

一株解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及其溶磷培養(yǎng)條件的優(yōu)化

黃達(dá)明 李倩 管國強(qiáng) 張志才 錢靜亞 宋慶春

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

從土壤作物根際篩選分離出的一株解磷能力較強(qiáng)的溶磷菌P0417，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA基因水平上的初步鑒定，測(cè)定其溶解磷的能力，并對(duì)該菌的溶磷培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，經(jīng)序列分析，確定該菌株P(guān)0417為洋蔥伯克霍爾德氏菌。且其溶磷能力與培養(yǎng)液pH呈顯著相關(guān)性，當(dāng)培養(yǎng)基條件為葡萄糖10 g/L、草酸銨0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L時(shí)，菌株P(guān)0417對(duì)Ca3（PO4）2鹽培養(yǎng)基具有較好的解磷能力，其解磷能力可達(dá)791.84 μg/mL。

溶磷細(xì)菌；篩選；鑒定；條件優(yōu)化；解磷能力

磷（P）是植物生長必需的礦物質(zhì)元素之一，在植物體內(nèi)以多種方式參與植物體內(nèi)的光合作用和生理生化過程，對(duì)促進(jìn)植物的生長發(fā)育和新陳代謝具有重要作用［1］。在我國，有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用［2］，且施入的磷肥當(dāng)季作物利用率為5%-25%，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+和Al3+結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽［3］。

土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，又是植物營養(yǎng)元素的活性庫［4］。土壤中能解磷的微生物種類比較多，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌等［5］。目前報(bào)道的具有溶解Ca3（PO4）2的菌株主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等［6］。不同的微生物解磷能力有較大的差異［7］，其溶磷量可達(dá)142.1-643.2 μg/mL［3，7，9］。其作用途徑大多是依靠自身的代謝產(chǎn)物或與其他生物協(xié)同溶解土壤中的難溶性磷素，提高土壤中磷素的利用效率，減少化學(xué)肥料的施用量，對(duì)環(huán)境進(jìn)行微生物修復(fù)，提高作物產(chǎn)量。微生物的解磷機(jī)制復(fù)雜多樣，因菌株的不同而有所不同［8］。解磷細(xì)菌能夠增加土壤有效磷含量，有三種觀點(diǎn)：第一種觀點(diǎn)是產(chǎn)酸機(jī)制，目前被人們廣泛接受；第二種觀點(diǎn)認(rèn)為微生物的解磷作用主要是由于在其代謝過程中分泌質(zhì)子的緣故，使介質(zhì)的pH值降低；第三種觀點(diǎn)認(rèn)為微生物的解磷過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的分段過程［9］。

目前，有關(guān)溶磷微生物的分離，篩選和應(yīng)用的研究大都局限于農(nóng)作物，在林木根際篩選和應(yīng)用溶磷微生物的報(bào)道極少。許多科學(xué)家分別從不同的方面對(duì)微生物菌肥進(jìn)行研究［10，11］，如進(jìn)行高效解磷能力菌株的分離、將不同種類微生物混合而研究其組合效應(yīng)等，所以篩選出具有高效溶磷能力的菌株顯得尤為重要。本研究對(duì)篩選自桂樹根際土壤的溶磷菌鑒定并進(jìn)行溶解磷酸鈣能力的測(cè)定，并對(duì)溶磷菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開發(fā)利用林木根際溶磷微生物資源及綠色無公害微生物肥料的生產(chǎn)提供高效穩(wěn)定的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤為黑色土壤，于2013年9月采樣，采用五點(diǎn)采樣法采集桂花樹下根際粘附的土壤，充分混合后分成2份：一份4℃冷藏保存，一份土樣風(fēng)干后過2 mm篩備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基（PKO培養(yǎng)基）：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）210 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，（NH4）2SO40.5 g，瓊脂粉15 g，pH值7.0-7.2，水1 000 mL［Ca3（PO4）2單獨(dú)滅菌后加入］。保存培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，水1 000 mL，瓊脂15 g。

1.1.3 溶磷菌株的篩選分離 稱取1 g土樣溶于99 mL無菌水中，振蕩30 min后取上清液用10倍稀釋法分別配置10-3、10-4、10-5、10-6和10-7g/mL的土壤懸液，各取0.1 mL分別涂布到分離培養(yǎng)基上［12］，28℃培養(yǎng)10 d，觀察出現(xiàn)溶磷圈的菌落，并將出現(xiàn)溶磷圈的菌株利用平板劃線法分離純化后，4℃下保存于LB斜面培養(yǎng)基中［13］。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌溶磷能力的測(cè)定

1.2.1.1 定性測(cè)定 溶磷圈法。將保存于LB培養(yǎng)基中的菌株活化后，用無菌牙簽接種于含磷酸鈣的PKO固體培養(yǎng)基上，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，記錄溶磷圈直徑（D）、菌落直徑（d），并計(jì)算D/d值大小以初步確定菌株的溶磷能力。

1.2.1.2 定量測(cè)定 將菌株用LB液體培養(yǎng)基制成菌懸液（濃度約為109cell/mL，即波長660 nm，OD值1.0），按菌懸液與PKO液體培養(yǎng)基比例為 1∶100 接種，即每100 mL培養(yǎng)基接菌懸液1 mL，每菌株3次重復(fù)，以不接菌空白PKO液體培養(yǎng)基為對(duì)照。在28℃，150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)5 d后，取2 mL發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，采用鉬藍(lán)比色法［12］測(cè)定上清液有效磷含量，同時(shí)根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線［14］計(jì)算溶磷量，并測(cè)定上清液pH值。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株菌落特征觀察及生理生化性質(zhì) 將單菌株接種LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后涂布平板，30℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。采用《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步菌株鑒定。

1.2.2.2 菌株的16S rDNA序列分析 利用菌體菌懸液直接PCR擴(kuò)增16S rDNA，擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'），引物購買于南京金斯瑞生物科技有限公司。PCR反應(yīng)體系為（25 μL）：Taq DNA聚合酶 0.25 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，菌體0.2 μL，引物各0.5 μL，去離子水17.05 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果提交GenBank中的Blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，經(jīng)Clustal軟件進(jìn)行多重序列比較后，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.3.1 碳源和氮源的篩選 在原有的PKO液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上首先對(duì)碳源（葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖）和氮源［（NH4）2SO4、草酸銨、NaNO3、牛肉浸膏］進(jìn)行篩選。菌株在LB斜面上活化24 h后，按1.2.1方法制成菌懸液，按1%接種量接種于各碳、氮源培養(yǎng)基，每組3次重復(fù)，于28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d，以原PKO培養(yǎng)基不接菌為對(duì)照測(cè)溶磷量。

1.2.3.2 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化 確定最好的碳氮源后，設(shè)計(jì)了葡萄糖（5、10和15 g/L），草酸銨（0.1、0.5和1 g/L），NaCl（0.1、0.5和1 g/L）的3因素3水平的正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。選用L9（33）正交組合進(jìn)行試驗(yàn)，其因素水平見表5。測(cè)定方法同1.2.3.1。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選

在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上涂板，結(jié)果（圖1）顯示，平板上長滿各種單菌落，且有的菌落產(chǎn)生了溶磷圈，產(chǎn)生溶磷圈的大小大致可說明此溶磷菌分解無機(jī)磷能力的強(qiáng)弱，從而可初步判斷溶磷菌溶磷能力［15］。經(jīng)篩選，得到一株具有明顯溶磷圈（D/d≥2.0）的溶磷菌，標(biāo)記為P0417。

2.2 溶磷菌溶磷能力的測(cè)定

2.2.1 定性測(cè)定 經(jīng)溶磷圈法測(cè)定D/d值，在以磷酸鈣為磷源的培養(yǎng)基上出現(xiàn)了明顯且較大的透明圈，在培養(yǎng)第10 天，菌落直徑d為7.0 mm，透明圈直徑D為14.3 mm，D/d值為2.04，具有較強(qiáng)溶解難溶性磷酸鈣的能力。菌株特征見表1。

表1 菌株P(guān)0417在LB培養(yǎng)基上的菌落特征

2.2.2 溶磷菌溶磷能力的定量測(cè)定 供試菌株P(guān)0417在接種24 h后開始測(cè)定菌液中可溶性磷含量及pH值，然后每隔24 h測(cè)一次。結(jié)果（圖2）顯示，隨著接種時(shí)間的延長，pH值逐漸降低，可能發(fā)酵過程中分泌了有機(jī)酸，溶磷量隨之逐漸升高，且在120 h時(shí)溶磷量達(dá)到503.53 μg/mL，說明該菌在培養(yǎng)120 h時(shí)的溶磷效果最佳。隨后，pH值具有升高的趨勢(shì)，溶磷量也隨之降低。通過Spss16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，溶磷菌P0417的溶磷量與pH之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.940，P＜0.05），當(dāng)培養(yǎng)液酸度降到pH5.58時(shí)，才有大量磷釋放出來。

圖2 溶磷菌培養(yǎng)液中溶磷量與pH的關(guān)系

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株P(guān)0417的形態(tài)特征 菌株P(guān)0417在LB平板上30℃培養(yǎng)24 h，菌落呈黃色、圓形、光滑、不透明，革蘭氏染色呈陰性，菌體為短桿狀（圖3）。菌株淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)及氧化酶試驗(yàn)呈陰性；吲哚試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)呈陽性；能利用乳糖、葡萄糖和麥芽糖；石蕊牛奶試驗(yàn)產(chǎn)酸、胨化（表2）。

圖3 P0417菌平板形態(tài)（A）及菌株革蘭氏染色（400×）（B）

2.3.2 菌株的16S rDNA序列分析 菌株P(guān)0417經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了約1 500 bp大小的片段。將PCR產(chǎn)物寄往南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，所得基因片段為1 377 bp，經(jīng)Blast比對(duì)（表3），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可知，該菌株為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），將該序列提交到GenBank，登錄號(hào)為KJ020934。

表2 菌株P(guān)0417的生理生化特征

表3 溶磷菌P0417 的16S rDNA及ITS基因的鑒定結(jié)果

圖4 P0417的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 溶磷菌的優(yōu)化培養(yǎng)

分別選用10 g/L的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖作為碳源，以不接菌原PKO培養(yǎng)基為空白對(duì)照，培養(yǎng)120 h后計(jì)算得出溶磷菌發(fā)酵液溶磷量，結(jié)果（表4）表明，葡萄糖是溶磷菌生長最適合的碳源。以0.5 g/L的（NH4）2SO4、草酸銨、NaNO3和牛肉浸膏作為氮源供溶磷菌發(fā)酵培養(yǎng)，表5可知草酸銨能使溶磷菌達(dá)到較好的溶磷效果。

表4 不同碳源對(duì)溶磷菌P0417溶磷量的影響

表5 不同氮源對(duì)溶磷菌P0417溶磷量的影響

綜合正交試驗(yàn)（表6）結(jié)果（表7）的K值和極差R大小與方差分析（表8）可知，影響供試菌P0417溶磷量的主次順序?yàn)锽＞C＞A，即氮源＞NaCl＞碳源，其中草酸銨含量為影響溶磷菌溶磷量的主要因素，其次是NaCl含量，最后是葡萄糖含量。故本試驗(yàn)對(duì)供試菌株的理論最優(yōu)培養(yǎng)基配方為A2B2C3，即葡萄糖10 g/L、草酸銨0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L。針對(duì)該條件進(jìn)行了補(bǔ)充試驗(yàn)，對(duì)優(yōu)化培養(yǎng)配方接種活化第2代供試菌株P(guān)0417，同條件下培養(yǎng)，溶磷量為765.74 μg/mL，比原優(yōu)化前培養(yǎng)液溶磷效果高。證明通過培養(yǎng)基優(yōu)化及正交試驗(yàn)，調(diào)整后的培養(yǎng)配方更有利于該菌的溶磷效果。

表6 正交試驗(yàn)因素水平

3 討論

本試驗(yàn)從桂花樹根際粘附土壤中分離篩選出一株高效溶磷菌株P(guān)0417，經(jīng)16S rDNA序列分析，結(jié)合生理特征，初步鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），屬于伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）類。該菌群是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性桿菌，因其可以產(chǎn)生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯等多種次生代謝產(chǎn)物而被廣泛應(yīng)用于生物防治、促進(jìn)植物生長、生物修復(fù)等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［16］，展現(xiàn)了其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上良好的應(yīng)用前景。與此同時(shí)該菌又有一些種是人類的條件致病菌［17］，在醫(yī)院常污染自來水、體溫表、醫(yī)療器械等，造成醫(yī)院內(nèi)傳播，導(dǎo)致各種疾病傳染［18］。故區(qū)分環(huán)境菌和人體致病菌以及該菌是否具有致病性，這對(duì)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上的伯克霍爾德氏菌株進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估無疑是必要的。但目前為止還沒有可行的方法區(qū)分，借助細(xì)胞培養(yǎng)模型和動(dòng)物模型的突變體分析將是今后可行方法之一［19］。

表7 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 正交結(jié)果方差分析

關(guān)于伯克霍爾德氏菌的溶磷效果的研究少有報(bào)道，李紀(jì)順等［20］發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌B418同時(shí)可以刺激植物生長，固定大氣中的氮，釋放土壤中被固定的磷等重要元素，證明其綜合效果非常明顯。趙珂［21］分離出一株洋蔥伯克霍爾德氏菌YM3-2S，在磷礦粉為唯一磷源時(shí)速效磷含量最高達(dá)40.96 μg/mL。黃靜［22］分離出一株植物內(nèi)生洋蔥伯克霍爾德氏菌M2S2，在磷酸鈣磷源條件下顯著增加了玉米地上部、根部及總生物量。本試驗(yàn)在以Ca3（PO4）2作為唯一的磷源且培養(yǎng)基條件優(yōu)化后該菌P0417溶磷量最大為791.84 μg/mL。

溶磷菌種類繁多，溶磷機(jī)制復(fù)雜［23］，但大多數(shù)研究者認(rèn)為，微生物的解磷作用主要取決于其分泌有機(jī)酸量和種類，如檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸和乳酸等［24］。如彭帥［25］分離出一株解磷熒光假單胞菌能夠產(chǎn)生葡萄糖酸，解磷量達(dá)24.5 μg/mL。本試驗(yàn)菌株P(guān)0417在接種24 h后開始測(cè)定菌液中可溶性磷含量及pH發(fā)現(xiàn)，隨著接種時(shí)間的延長，pH值逐漸降低，溶磷量隨之逐漸升高，說明發(fā)酵過程中可能分泌了有機(jī)酸，菌株分泌有機(jī)酸的種類測(cè)定是后續(xù)研究的主要內(nèi)容之一。

4 結(jié)論

菌株P(guān)0417在以Ca3（PO4）2作為唯一的磷源時(shí)溶磷量為503.53 μg/mL，在培養(yǎng)基條件優(yōu)化后溶磷量最大為791.84 μg/mL，是原有PKO培養(yǎng)基溶磷量的1.57倍，推測(cè)溶磷機(jī)制可能是分泌了有機(jī)酸，初步鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），可能是一株優(yōu)良的非致病性溶磷菌株。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Selection，Identification and Medium Optimization of a Phosphatesolubilizing Bacterium

Huang Daming Li Qian Guan Guoqiang Zhang Zhicai Qian Jingya Song Qingchun
（College of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

A phosphorus-dissolving bacterial strain P0417 was isolated from crop rhizosphere soil and identified by the genetic identification of 16S rDNA， measuring capability of phosphate-solubilization and optimization of medium components here. The result demonstrated that the bacterium was identified as Burkholderia cepacia. And the capacity of dissolving the phosphate was closely correlated with the pH of its culture medium， the strain showed high phosphate-dissolving ability of 791.84 μg/mL in Ca3（PO4）2culture medium at glucose， 10 g/L；Ammonium oxalate， 0.5 g/L；NaCl， 1.0 g/L.

phosphorus-dissolving bacterial strains；selection；identification；medium optimization；phosphate-dissolving ability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.026

2014-06-10

黃達(dá)明，男，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品生物轉(zhuǎn)化及綜合利用；E-mail：damingh@163.com