李娜娜 吳曉英 吳振強

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006）

液態(tài)烷烴氧載體對粘紅酵母發(fā)酵產番茄紅素的影響

李娜娜 吳曉英 吳振強

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006）

研究正己烷、正十二烷、正十六烷3種液態(tài)烷烴作為氧載體對粘紅酵母生長和番茄紅素合成的影響，發(fā)現(xiàn)氧載體不僅使菌體生物量提高，同時使單位細胞的番茄紅素產率增大，從而提高粘紅酵母合成番茄紅素的能力。3種液態(tài)烷烴中正十二烷作為氧載體效果較好，試驗結果表明，在發(fā)酵第0 h時添加4%的正十二烷，細胞生物量達到16.49 g/L，番茄紅素合成量達到42.32 mg/L分別比對照組提高了26.2%和50.17%。

粘紅酵母；番茄紅素；液態(tài)烷烴；氧載體；傳遞效率

番茄紅素是一種具有11個共軛雙鍵和兩個非共軛雙鍵的不飽和碳氫化合物，是許多類胡蘿卜素生物合成的中間體，其經過環(huán)化后可形成其他種類的類胡蘿卜素，如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等［1］。番茄紅素具有很強的抗氧化作用，其對單線氧的清除能力是β-胡蘿卜素的2倍，在類胡蘿卜素中最強［2］，同時番茄紅素還具有對自由基的清除、抵擋UV導致的皮膚光傷害［3-5］、阻斷形成亞硝胺、抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化、減少 DNA 損傷以及促進細胞間隙連接通訊等作用［6，7］，故其在淬滅單線態(tài)氧、消除氧自由基、降低癌癥發(fā)病率、增強人體免疫功能以及防治心血管疾病方面具有良好的應用前景［8-12］。

目前，生產天然類胡蘿卜素的主要菌種為三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）和紅酵母（Rhodotorular）。雖然與三孢布拉氏霉相比，紅酵母的單位產量比較低，但由于其具有營養(yǎng)要求簡單、生長周期短、易于放大培養(yǎng)、菌體營養(yǎng)豐富等許多優(yōu)點，具有很高的實用價值。

粘紅酵母發(fā)酵生產番茄紅素是好氧發(fā)酵過程，溶氧水平會影響細胞類胡蘿卜素的產率，為了保證發(fā)酵中氧的供應，通常是采用大通氣量及高攪拌輸出功率相結合的方法，造成動力成本上升，并因剪切力過大，泡沫增多，不易控制等從而不利于發(fā)酵生產。

近來年，新的強化傳氧技術的發(fā)展方向之一就是向發(fā)酵液中引入一種新的液相，以減少氣液傳氧阻力，從而提高傳氧效率［13］。這種液相一般具有比水更高的溶氧能力，且與發(fā)酵液互不相溶，稱為氧載體。有文獻報道［14］加入諸如煤油、正己烷、正十二烷等氧載體后，可提高同一反應系統(tǒng)的Kla（傳氧系數(shù)）值30%-300%，或達到同一混合效果降低攪拌功率30%以上的優(yōu)點。目前，國內用液態(tài)烷烴作為氧載體發(fā)酵粘紅酵母產類胡蘿卜素鮮有報道，本研究主要研究不同液態(tài)烷烴氧載體對粘紅酵母液態(tài)發(fā)酵生產番茄紅素的影響，旨在探討氧載體在相應發(fā)酵體系中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實驗室保藏的粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）2.27，-80℃冷凍保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 番茄紅素標準品（≥95%），上海融合科技發(fā)展有限公司；煙堿（95%），西安天則生物技術有限責任公司。

SHP-450D型生化培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；SKYB2112B型恒溫搖床，廣州科橋實驗技術設備有限公司；LD5-2A低速離心機，背景醫(yī)用離心機廠；2802S型紫外分光光度計，尤尼科（上海）儀器有限公司；Waters高效液相色譜儀1525、Waters紫外分光檢測器2487。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法 斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉10 g/L，核黃素0.5 mg/L，初始pH5。

種子斜面活化培養(yǎng)：挑取一環(huán)粘紅酵母接入斜面活化培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h。

液體種子培養(yǎng)：從活化了的斜面種子中挑取兩環(huán)黏紅酵母接種于裝有30 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內，28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：以5%的接種量，將液體種子接入到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)96 h。

1.2 方法

1.2.1 氧載體試驗 選擇正己烷、正十二烷、正十六烷作為待測氧載體，通過0.22 μm濾膜過濾除菌。篩選氧載體試驗中，在接種的同時分別進行添加濃度同為2%（V/V）的正己烷、正十二烷、正十六烷，在發(fā)酵24 h添加環(huán)化酶抑制劑煙堿，繼續(xù)發(fā)酵至96 h?？疾炀哂胁煌琇ogP值的氧載體對粘紅酵母產番茄紅素的影響。所有試驗均做3個平行。

1.2.2 生物量的測定 發(fā)酵結束后，取10 mL液體發(fā)酵液轉入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀水洗離心兩次，得到酵母泥，于60℃下過夜烘干，稱干重量。

1.2.3 番茄紅素的提取 發(fā)酵結束后，參照文獻［15］采用熱酸法破壁。

丙酮浸提：取發(fā)酵液10 mL轉入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，沉淀水洗后得到酵母泥；加入3 mol/L的HCl溶液5 mL，混合均勻后浸泡90 min，然后沸水浴6 min，迅速冷卻，再4 000 r/min離心10 min，得沉淀水洗2次，離心后得到菌體殘片；加入丙酮9 mL，混合均勻，浸提60 min，4 000 r/min下離心10 min，得到色素丙酮浸提液。

1.2.4 番茄紅素含量測定方法 將色素提取液用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，以高效液相色譜法（HPLC）測定提取液中番茄紅素的含量。同時配制不同濃度的標準品溶液，在相同條件下測定，根據(jù)峰面積制備標準曲線定量。

Waters-1525高效液相色譜儀；色譜柱為：Agilent HCC18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；Binary高效泵；檢測器為：Waters-2487，Double Absorbance Detector；數(shù)據(jù)分析軟件：Breeze。

高效液相色譜條件：流動相為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（二氯甲烷）=21∶21∶8，檢測波長為472 nm，流速為1.5 mL/min，柱溫為28℃，進樣量為10 μL。

2 結果

2.1 番茄紅素標準曲線

準確稱量2.0 mg的番茄紅素標準品，用丙酮溶解，定容于10 mL的棕色容量瓶中，質量濃度為200 μg/mL。再分別稀釋成150、100、50、25和12.5 μg/mL的質量濃度梯度，經0.22 μm濾膜過濾后HPLC檢測，數(shù)據(jù)處理，得到峰面積與質量濃度的關系，如圖1所示。

圖1 番茄紅素的標準曲線

2.2 對氧載體的篩選

有機溶劑對細胞生長的影響與其在辛醇-水系統(tǒng)中的分配系數(shù)LogP密切相關，即LogP越高，對細胞的刺激性或者毒性越小，生物相容性越好。Laane等［16］曾提出生物相容性較好的溶劑其LogP應該大于4。參照表1中的相關數(shù)據(jù)，本試驗考察了正己烷、正十二烷、正十六烷作為氧載體對粘紅酵母產番茄紅素的影響，結果如表2所示。

表1 有機溶劑的物理性質

本試驗考察的3種液態(tài)烷烴氧載體中，正十六烷對細胞生長最有利，但正十二烷對粘紅酵母合成番茄紅素最有利（表2）。當正十二烷的添加體積分數(shù)為2%時，生物量和番茄紅素產量達到16.6 g/L和46.9 mg/L，分別比對照組增長了25.37%和46.9%。正己烷對粘紅酵母生長和番茄紅素合成也都有一定的促進作用，但效果不顯著。綜合考慮，正十二烷是粘紅酵母生長和番茄紅素合成的最佳氧載體。

表2 不同有機溶劑作為氧載體對粘紅酵母生長和番茄紅素合成的影響

2.3 正十二烷不同添加濃度的影響

表2的結果已經證實正十二烷是粘紅酵母生長和番茄紅素合成的最佳氧載體，因此對其添加濃度和添加時間作了進一步優(yōu)化考察。在發(fā)酵的初始，向發(fā)酵液中分別添加0%，1%、2%、4%、8%和12%不同濃度的正十二烷，發(fā)酵結束后使用高效液相色譜（HPLC）測定番茄紅素含量以確定氧載體的最優(yōu)加入時間。試驗結果（圖2）顯示，添加正十二烷的試驗組的生物量和番茄紅素產量都高于未添加的對照組，隨著正十二烷濃度的不斷增大，粘紅酵母的生物量和番茄紅素產量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當正十二烷的濃度為2%時，生物量達到最大值16.9 g/L，比對照組增加29.4%，番茄紅素產量則在正十二烷的添加濃度為4%時達到最大值42.32 mg/L，比對照組提高了50.17%。從發(fā)酵液的表觀上可以看出，加入8%和12%的正十二烷時，搖瓶中存在顯著的較大油滴易于浮于表面，而正十二烷的加入量為2%和4%的搖瓶中則分散乳化效果較好，從而更有利于油-水兩相間的接觸與物質傳遞?？梢?，正十二烷作為氧載體有利于菌體的生長，并能提高單位細胞番茄紅素的合成能力，二者的共同作用使番茄紅素的產量顯著增加。究其原因可能是一方面液態(tài)烷烴起到了分散劑的作用，增加氧氣界面的傳遞面積，從而利于粘紅酵母細胞的生長，另一方面液態(tài)烷烴作為氧載體，可以刺激粘紅酵母合成積累番茄紅素。

圖2 不同濃度的正十二烷對粘紅酵母的生長和產番茄紅素的影響

2.4 4%的正十二烷不同添加時間對發(fā)酵的影響

使用氧載體的時間應該是發(fā)酵體系出現(xiàn)溶氧限制時，此時加入氧載體可以解決溶氧不足的限制，提高發(fā)酵生產能力。液體發(fā)酵粘紅酵母生產番茄紅素的過程中，分別在不同的時間點加入4% 的正十二烷，發(fā)酵結束后使用高效液相色譜（HPLC）測定番茄紅素含量以確定氧載體的最優(yōu)加入時間。試驗結果（圖3）顯示，隨著添加4%的正十二烷的時間的推移，粘紅酵母的生物量和番茄紅素產量都呈一個下降的趨勢，在發(fā)酵開始添加4%的正十二烷的生物量為17.015 g/L，比在發(fā)酵84 h時添加4%的正十二烷的生物量13.17 g/L提高了29.1%，番茄紅素的產量達到最大43 mg/L，比在84 h添加獲得的番茄紅素產量30.6 mg/L提高了40.52%。在發(fā)酵初期加入正十二烷作為氧載體對粘紅酵母的生長效果明顯，可能因為早期加入的正十二烷，可以及時緩解粘紅酵母培養(yǎng)過程中氧氣不足的問題。

圖3 4%的正十二烷的不同添加時間對粘紅酵母的生長和產番茄紅素的影響

2.5 添加氧載體對粘紅酵母發(fā)酵過程的影響

在液體發(fā)酵粘紅酵母生產番茄紅素的過程中的0 h時添加氧載體正十二烷4%，定時取樣測量相關參數(shù)，試驗組與對照組中粘紅酵母的生物量、番茄紅素產量、pH、殘?zhí)呛康淖兓Y果如圖4所示。

從圖4中可以看出，添加氧載體有利于菌體生長（圖4-A）并提高了單位細胞類胡蘿卜素的合成能力（圖4-E），兩者的共同作用促使番茄紅素產量顯著增加（圖4-B）。發(fā)酵液的pH的變化趨勢基本一致，但添加氧載體的發(fā)酵液稍低于對照組試驗（圖4-C），這與劉元帥等［17］研究添加液態(tài)烷烴氧載體對法夫酵母發(fā)酵生產蝦青素的影響中發(fā)現(xiàn)添加正十六烷的試驗組的pH值稍微低于對照組的結果一致?；谠囼灲Y果推測這可能是由于正十二烷的添加，促進菌體的生長，從而加快對氮源的吸收利用。添加氧載體還增大了細胞對葡萄糖的利用率，葡萄糖消耗明顯加快（圖4-D），這可能也是氧載體促進細胞生長和番茄紅素合成的一個重要原因。

3 討論

氧載體雙液相發(fā)酵，強化發(fā)酵過程中的氧傳遞，主要來自兩個方面：一是氧在氧載體中的溶解度大大高于氧在水中的溶解度，如據(jù)Wang等［14］報道的有機溶劑正十二烷，氧載體的添加實際是增大了氧傳遞的總推動力（C*-C）；另一方面是由于氧載體在培養(yǎng)基中的分散、乳化，增大了氧傳遞的相面積，從而大大提高了氧的體積傳遞系數(shù)，有利于氧傳遞［13］。因此可將這些有機溶劑作為氧載體加入發(fā)酵液以提高溶氧濃度，對于某些對氧濃度要求高的發(fā)酵過程，添加適宜濃度的有機溶劑可大幅度提高目的產物的合成水平［18］。

雖然國內外已有大量試驗證明，向發(fā)酵液中添加液態(tài)烷烴作為氧載體確實能促進代謝產物的合成。Da Silva、 Mendes等［19，20］研究正十二烷對隱甲藻發(fā)酵產DHA產量的影響中，發(fā)現(xiàn)正十二烷作為一種便宜的有機溶劑被添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中時，一方面可以作為氧載體來增強氧的傳遞；另一方面作為一種有機相，可以增加DHA產量和濃縮脂肪酸。Xu等［21］向培養(yǎng)基中添加氧載體正十二烷和正十六烷能提高三胞布拉氏霉菌合成番茄紅素的能力。

圖4 添加氧載體（4%，正十二烷 ）對細胞生長（A）、番茄紅素合成（B）、pH值（C）、葡糖糖消耗的影響（D）和單位細胞番茄紅素的合成量（E）

但目前為止國內對氧載體的研究較少，本研究利用正己烷、正十二烷、正十六烷3種液態(tài)烷烴作為氧載體，考察其對粘紅酵母生長和番茄紅素合成的影響，發(fā)現(xiàn)氧載體正十二烷是一種經濟的提高粘紅酵母生物量和番茄紅素產量的有機溶劑。但不同氧載體對菌體生長促進程度和對粘紅酵母合成積累番茄紅素促進效果不同，一方面可以考慮把不同氧載體組合優(yōu)化，考察其對粘紅酵母產番茄紅素的影響；另一方面利用表面活性劑可以改變發(fā)酵液流體特性和菌體通透性，構建氧載體偶聯(lián)表面活性劑體系研究其對粘紅酵母產番茄紅素的影響。

4 結論

本研究首次將液態(tài)烷烴氧載體應用于粘紅酵母產番茄紅素的研究中，考察正己烷，正十二烷、正十六烷對粘紅酵母合成積累番茄紅素的影響，發(fā)現(xiàn)氧載體不僅使菌體生物量提高，同時使單位細胞的番茄紅素產率增大，從而提高粘紅酵母合成番茄紅素的能力。結果表明，3種液態(tài)烷烴中正十二烷作為氧載體效果較好，在發(fā)酵第0 h時添加4%的正十二烷，細胞生物量達到16.49 g/L，番茄紅素合成量達到42.32 mg/L分別比對照組提高了26.2%和50.17%。正十二烷價格低廉并且可重復利用，作為粘紅酵母發(fā)酵產番茄紅素的氧載體具有較高的工業(yè)應用價值和潛力。

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（責任編輯 馬鑫）

A Effect of Liquid Alkane Oxygen-vectors on Rhodotorula Fermentations and Lycopene Production

Li Nana Wu Xiaoying Wu Zhenqiang
（School of Bioscience&Bioengineering，South China University of Techology，Guangzhou 510006）

Addition of oxygen-vectors（n-hexane， n-dodecane， hexadecane）to fermentation medium was recognized as a method of enhancing oxygen transfer and promoting lycopene yield by Rhodotorula fermentation. n-dodecane as an oxygen-vector is the best in three kinds of liquid alkane. Experimental results show that the biomass of Rhodotorula attained 16.49 g/L and the yield of lycopene biosynthetic reached 42.32 mg/L by adding 4% n-dodecane in the 0 h， which was 26.2% and 50.17% higher than the control group， respectively.

Rhodotorula；lycopene；liquid alkane；oxygen-vectors；oxygen transfer

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.029

2014-08-19

李娜娜，女，碩士研究生，研究方向：生物活性物質的研究；E-mail：759365635@qq.com

吳曉英，女，副教授，碩士生導師，研究方向：生物制藥與生物資源的綜合利用；E-mail：xywu@scut. edu. cn