畢彩紅 張秋霞 于珊珊 陳學(xué)昭 劉春影 祝茜

（山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，威海 264209）

松江鱸（Trachidermus fasciatus）髓樣分化因子MyD88基因克隆與組織表達(dá)分析

畢彩紅 張秋霞 于珊珊 陳學(xué)昭 劉春影 祝茜

（山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，威海 264209）

髓樣分化因子（MyD88）是TOLL樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-kappaB，NF-κB）而參與機(jī)體的先天免疫?？寺×怂山|的MyD88基因（命名為TfMyD88），并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示，TfMyD88 cDNA序列全長(zhǎng)1 555 bp，5' UTR長(zhǎng)89 bp，3' UTR長(zhǎng)599 bp；開放閱讀框長(zhǎng)度為867 bp，編碼288個(gè)氨基酸。SMART軟件預(yù)測(cè)TfMyD88分子的N端為一個(gè)保守的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD），C端存在典型的TIR（Toll/interleukin-1 receptor）結(jié)構(gòu)域。TfMyD88與其它脊椎動(dòng)物MyD88的氨基酸相似性達(dá)57.58%-82.64%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明TfMyD88與同屬鱸形總目的花鱸和鱖魚聚在一起，所有魚類MyD88聚為一支。Real-time PCR檢測(cè)顯示TfMyD88廣泛表達(dá)于松江鱸各組織，但在鰓中的相對(duì)表達(dá)量最高；其次為脾臟和皮膚。LPS（lipopolysaccharide）刺激后，TfMyD88在松江鱸的血液、肝臟、皮膚、脾臟均出現(xiàn)明顯上調(diào)。刺激2 h后，在血液TfMyD88表達(dá)量升高了近60倍，在皮膚中的表達(dá)量也升高了27倍。上述結(jié)果表明TfMyD88可能參與松江鱸先天免疫。

松江鱸；MyD88；基因克?。幌忍烀庖?；LPS

魚類作為低等脊椎動(dòng)物，主要依靠固有性免疫（innate immunity）抵抗外來(lái)病原微生物感染。固有性免疫是通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）特異性地識(shí)別病原體的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來(lái)啟動(dòng)的。TOLL樣受體（toll like receptors，TLRs）是迄今研究最多的模式識(shí)別受體，它們能夠特異性地識(shí)別PAMPs，并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB），介導(dǎo)和引發(fā)炎癥應(yīng)答［1］。髓樣分化因子MyD88是TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的接頭分子［2，3］，由3個(gè)功能區(qū)域組成。C端為TIR（Tolllike/IL-1 receptor）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)門oll/白細(xì)胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族成員所特有。當(dāng)機(jī)體受到刺激后，TLRs會(huì)識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的PAMP，由此導(dǎo)致TLRs的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象改變，TLRs胞漿中TIR結(jié)構(gòu)域便會(huì)與MyD88 C端的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用形成TIRMyD88復(fù)合體。MyD88 N端是一死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD），該區(qū)域參與胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)，在腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNF-R）家族的眾多成員中也有該結(jié)構(gòu)域。TIR-MyD88復(fù)合體形成后，即通過(guò)DD結(jié)構(gòu)域招募下游的IRAKs（IL-1 receptor associated kinase，IRAK），使其磷酸化而脫離MyD88，繼而與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）結(jié)合，從而啟動(dòng)下游的一系列免疫反應(yīng)［4-6］。MyD88還有一個(gè)連接DD和TIR結(jié)構(gòu)域的中間區(qū)域，這一段區(qū)域可能參與了IFN-γR信號(hào)傳導(dǎo)［7］。

目前，已有多個(gè)哺乳動(dòng)物［8，9］、禽類［10］、爬行類［11］等脊椎動(dòng)物的MyD88分子相繼被鑒別。魚類中斑馬魚（Danio rerio）［12］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［13］、大黃魚（Pseudosciaena crocea）［14］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［15］、條石鯛（Oplegnathus fasciatus）［16］、斜帶石斑（Epinephelus coioides）［17］和牙鲆（Paralichthys olivaceus）［18］等的MyD88基因也已被克隆鑒定。

松江鱸（Trachidermus fasciatus）是一種降海產(chǎn)卵洄游魚類，歷史上在我國(guó)沿海均有分布。但是近年來(lái)種群數(shù)量急劇降低，已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物。為恢復(fù)其自然種群，人工養(yǎng)殖勢(shì)在必行。然而，養(yǎng)殖過(guò)程中各種應(yīng)激刺激的存在勢(shì)必會(huì)引起各種疾病的出現(xiàn)和蔓延，鑒于這種情況，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展對(duì)松江鱸的免疫學(xué)研究，從固有性免疫的TLR信號(hào)通路入手，已對(duì)TLR信號(hào)通路中的白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）基因的性質(zhì)和表達(dá)模式進(jìn)行了研究分析［19］。本試驗(yàn)則成功地克隆了松江鱸的TfMyD88全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)對(duì)TfMyD88在松江鱸10種組織中的表達(dá)譜以及LPS刺激后的表達(dá)模式變化進(jìn)行檢測(cè)和分析，旨在為開展其功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 9-10月齡松江鱸，取自山東文登埠口松江鱸自然保護(hù)區(qū)。在試驗(yàn)開始之前，松江鱸預(yù)先在12℃-14℃的循環(huán)海水箱中飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)試驗(yàn)條件。選取體重為15-23 g的正常個(gè)體，用三卡因甲基磺酸鹽（Sigma，St. Louis，MO，USA）麻醉后先用1 mL無(wú)菌注射器進(jìn)行心臟采血，然后解剖魚體，取其心臟、肝臟、鰓、腸、皮膚、腎臟、脾臟、腦、卵等組織，立即投入液氮，爾后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于正常組織RNA提取。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒（EZNATMMicro-Elute?total RNAKit II ）為美國(guó)QMEGA公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase M-MLV）、RNA酶抑制劑、dNTP Mixture（10 mmol/L）、T4 DNA Ligase購(gòu)自TaKaRa Biotechnology產(chǎn)品（日本），Taq酶、PCR mix kit、DL2000 DNA maker為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品，PCR產(chǎn)物回收Kit購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司（下文簡(jiǎn)稱上海生工），引物合成和測(cè)序均由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 感染試驗(yàn) 健康松江鱸100尾平均分為2組，一組腹腔注射LPS（lipopolysaccharide）（0.04 mg/kg），對(duì)照組以PBS（50 μL/條）取代LPS。刺激2、6、12、24、48、72和96 h后麻醉取樣（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取6尾）。首先用無(wú)菌注射器心臟取血，然后分別取其肝臟、皮膚、脾臟。將同一組別的相同組織保存在同一凍存管中，投入液氮，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)EZNATMMicroElute?total RNA Kit II試劑盒（QMEGA，USA）的操作說(shuō)明，提取正常組織和刺激后各組織的總mRNA。cDNA的合成具體試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［20］。PCR所用引物（Smart F、Oligo-anchor R）見(jiàn)表1。

表1 本研究所用PCR引物序列

1.2.3 TfMyD88全長(zhǎng)的克隆 參照GenBank中已發(fā)表的牙鲆（AB241074.1）、條石鯛（HM035064.1）、點(diǎn)帶石斑（HM590879.1）、花鱸（Lateolabrax japonicus）（JQ228862.1）、 大 黃 魚（Larimichthys crocea）（EU978950.1）、 鮸 魚（Miichthys miiuy）（JQ17835-6.1）、羅非魚（Oreochromis niloticus）（KJ130039.1）和鱖魚（Siniperca chuatsi）（HQ014593.1）的MyD88基因序列，用DNAman進(jìn)行多序列比對(duì)，在結(jié)合Primer 5.0軟件在相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物TfMFmiddle和TfMRmiddle。以肝臟cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30次循環(huán)；72℃延伸10 min。把純化的PCR產(chǎn)物與T載體pMD 18-T連接，轉(zhuǎn)入DH5α菌株中送到上海生工測(cè)序（測(cè)序引物M13-47和RV-M，見(jiàn)表1）。經(jīng)BLAST得到中間片段后，再根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因特異性后引物TfMR，與5' primer配對(duì)進(jìn)行5' 末端的克??；設(shè)計(jì)基因特異性前引物TfMF，與3' anchor配對(duì)進(jìn)行3'末端克隆，克隆條件同前（上述各引物序列具體見(jiàn)表1）。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工測(cè)序，得到5' 末端和3' 末端序列。

1.2.4 TfMyD88序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和進(jìn)化樹構(gòu)建

TfMyD88 cDNA氨基酸的翻譯和蛋分子量及等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過(guò)ExPASy（http：//www.au.expasy.org/）完成。通過(guò)SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)?；贐LAST搜查同源序列對(duì)TfMyD88在氨基酸水平上進(jìn)行同源比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建，同源序列比對(duì)通過(guò)ClustalW和BioEdit完成，進(jìn)化樹通過(guò)MEGA4.0構(gòu)建。1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR（Qrt-PCR）分析 根據(jù)已克隆測(cè)序的TfMyD88基因設(shè)計(jì)一對(duì)qRT-PCR的引物（QTfF，QTfR），將10正常個(gè)組織和刺激后的4個(gè)免疫相關(guān)組織（血液、肝臟、皮膚、脾臟）的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR。內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin，所用引物ActinF和ActinR參考文獻(xiàn)［20］。反應(yīng)體系為10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，2 μL 1∶50稀釋的cDNA，引物各4 μL。使用7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)，Applied Biosystems）進(jìn)行松江鱸基因表達(dá)定量。PCR反應(yīng)條件為：94℃3 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)待測(cè)樣品cDNA設(shè)置3個(gè)平行。mRNA相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算［21］，使用t檢驗(yàn)的方法分析差異顯著性，P＜0.05為可接受的顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 松江鱸TfMyD88的基因克隆和序列分析

利用兼并引物克隆得到長(zhǎng)度為545 bp的cDNA序列，BLAST分析之后顯示該片段與鱖魚的MyD88有較高的同源性。利用基因特異性前引物TfMF和3' -anchor R配對(duì)克隆得到TfMyD88 cDNA序列完整的3'末端，長(zhǎng)度為591 bp。利用基因特異性前引物TfMR和5'primer配對(duì)克隆得到TfMyD88 cDNA序列完整的5'末端，長(zhǎng)度為422 bp。利用DNAman等軟件對(duì)已知中間序列、5' 末端和3'末端序列進(jìn)行拼接，得到1 555 bp的TfMyD88全長(zhǎng)cDNA序列，其中5' 非編碼區(qū)（5' UTR）長(zhǎng)89 bp，3'非編碼區(qū)（3' UTR）長(zhǎng)599 bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)867 bp，編碼288個(gè)氨基酸（TfMyD88cDNA序列全長(zhǎng)和推導(dǎo)的氨基酸序列，見(jiàn)圖1），編碼的蛋白推測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量（MW）為33 103.2，理論等電點(diǎn)（pI）為5.08。利用SMART進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，TfMyD88分子包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），C端的TIR結(jié)構(gòu)域。死亡結(jié)構(gòu)域的位置為12-103氨基酸，TIR結(jié)構(gòu)域?yàn)?52-288氨基酸（圖2）。

圖1 TfMyD88序列全長(zhǎng)及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域示意圖

2.2 TfMyD88同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將TfMyD88蛋白的氨基酸序列與人（Homo sapiens）（AAB49967.1）、家鼠（Mus musculus）（AAC-53013.1）、斑胸草雀（Taeniopygia guttata）（XP_00-2196761.1）、中華鱉（Pelodiscus sinensis）（ADR742-34.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）（NP_00108100-1.1）、斑馬魚（AAQ90476.1）、鯉魚（Cyprinus carpio）（ADE20131.1）、虹鱒（CAI48087.1）、青鳉（Oryzias latipes）（XP_004081134.1）、花鱸（AEY83971.1）和鱖魚（ADM25313.1）的MyD88氨基酸進(jìn)行序列對(duì)比，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)其相似度分別達(dá)到57.58%、59.93%、59.00%、58.8%、59.45%、68.51%、68.17%、68.51%、76.74%、78.33%和 82.64%。12個(gè)物種TIR結(jié)構(gòu)域同源性更高，尤其是位于其中的box1、box2和box3序列高度保守，而box1中的FDA基序、box2中的“VLPG”和box3中的“FW”基序在各物種均保持不變。

通過(guò)MEGA4.0的Neighbor-joining法分析，用重復(fù)1 000次的計(jì)算方法構(gòu)建了分子系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖4）顯示，松江鱸TfMyD88與同為鱸形總目的花鱸和鱖魚的MyD88關(guān)系最近，所有魚類的MyD88單獨(dú)聚為進(jìn)化樹的一大分支，其他脊椎動(dòng)物MyD88聚為一支。

2.3 MyD88基因的表達(dá)分析

2.3.1 MyD88基因在不同組織中的表達(dá)模式 以持家基因β-actin為內(nèi)參，經(jīng)qRT-PCR分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，MyD88廣泛表達(dá)于松江鱸各組織器官。其中，在鰓中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為脾臟和皮膚。

2.3.2 LPS刺激后TfMyD88的表達(dá)模式變化 用qRT-PCR的方法研究了受LPS刺激后，TfMyD88在松江鱸血液、肝臟、皮膚和脾臟中的表達(dá)模式變化。結(jié)果（圖6）顯示，TfMyD88在各器官表達(dá)均明顯上調(diào)，但上調(diào)模式有所不同。在皮膚中，LPS刺激2 h后，表達(dá)量即達(dá)到正常時(shí)的27倍，之后下調(diào)但一直高于正常值。在血液中，2 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到正常的60倍，之后表達(dá)量快速降低至低于正常，只是在24 h有小幅度的上調(diào)，為正常時(shí)的1.6倍。在肝臟中，TfMyD88的表達(dá)量也在刺激后2 h快速上調(diào)，隨后慢慢下調(diào)，到24 h時(shí)恢復(fù)到正常水平，但隨后表達(dá)量發(fā)生2次升高，至96 h達(dá)到最高值，為正常時(shí)的10倍。在脾臟中，于刺激后12 h TfMyD88表達(dá)量才緩慢上調(diào)到正常時(shí)的2.6倍，然后恢復(fù)到正常水平，在72-96 h又出現(xiàn)小幅上調(diào)。

圖3 TfMyD88蛋白序列與其他物種的MyD88的多序列比對(duì)

3 討論

本研究首次成功克隆到松江鱸TfMyD88全長(zhǎng)cDNA序列，其中ORF為867 bp，編碼288個(gè)氨基酸。用DNAman軟件分析發(fā)現(xiàn)，TfMyD88與其他硬骨魚的核苷酸序列同源性均在70%以上，其中與鱖魚的同源性高達(dá)82.64%，說(shuō)明MyD88分子在基因進(jìn)化過(guò)程中保守性較高。這可能是因?yàn)镸yD88在TLR信號(hào)通路中，作為一個(gè)關(guān)鍵的接頭分子，在機(jī)體的先天免疫中發(fā)揮重要作用。

圖4 基于TfMyD88的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖5 MyD88基因在松江鱸正常組織的表達(dá)模式

圖6 LPS刺激后MyD88在松江鱸不同組織的表達(dá)模式變化

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，TfMyD88存在N端的死亡結(jié)構(gòu)域、C端的TIR結(jié)構(gòu)域及其中間區(qū)域。TIR結(jié)構(gòu)域有137個(gè)氨基酸，具有高度的保守性，這與Jault等［12］在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，這可能是TLR信號(hào)通路中TLRs與MyD88相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其中，TfMyD88的box1序列為“FDAFICYCK”，這與其他魚類有一個(gè)氨基酸的差別，松江鱸box1最后一個(gè)氨基酸為賴氨酸（K），而其他魚類該位置是谷氨酰胺（Q），機(jī)制有待研究；box2序列為“LCVFDRDVLPGSC”，但box2的第4個(gè)氨基酸苯丙氨酸（F）在哺乳動(dòng)物中卻是絲氨酸（S），該氨基酸是否對(duì)TIR互作有影響還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。box2中第6位的精氨酸（R）、第7位的天冬氨酸（D）和第11位的甘氨酸（G）殘基能形成BB-loop區(qū)，在TIR-TIR的相互作用中十分重要［22］?？赡苷蛉绱?，這3個(gè)氨基酸在各物種均保持不變。相對(duì)于box1和box2而言，box3的保守性比較低。但是“FW”基序的保守性極高，其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是否有重要作用還需要進(jìn)一步研究。MyD88中間區(qū)域的作用已經(jīng)越來(lái)越受到關(guān)注，MyD88與干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因有關(guān)［23］，其中參與到該過(guò)程的結(jié)構(gòu)域據(jù)推測(cè)就是中間結(jié)構(gòu)域［7］。TfMyD88的中間區(qū)域較哺乳動(dòng)物少了2個(gè)氨基酸，缺失的兩個(gè)氨基酸是否影響MyD88在松江鱸IFN-γ信號(hào)通路中的作用也還需要進(jìn)一步研究。

qRT-PCR結(jié)果顯示TfMyD88廣泛表達(dá)于松江鱸的10種組織，這與之前的研究報(bào)道相似，在牙鲆［24］、點(diǎn)帶石斑［25］、鮸魚［26］和半滑舌鰨［15］中均發(fā)現(xiàn)MyD88的廣泛表達(dá)。TfMyD88在鰓中的表達(dá)量最高，Tang等［26］對(duì)鮸魚研究發(fā)現(xiàn)，其MyD88在肝臟中的表達(dá)量最高，通過(guò)對(duì)牙鲆［24］的研究，其高表達(dá)量的組織包括鰓、頭腎、皮膚、脾臟和腸。從上述研究結(jié)果來(lái)看，雖然MyD88廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi)的各器官組織，但是對(duì)于不同的物種，不同組織的表達(dá)量還是有一定的差異。相對(duì)來(lái)說(shuō)，TfMyD88在松江鱸的鰓和血液中的表達(dá)較高，可能是因?yàn)轹w和皮膚作為機(jī)體的第一道物理屏障，首先與病原體接觸，TOLL樣受體信號(hào)路徑在此處識(shí)別病原體，在免疫監(jiān)督防御中發(fā)揮重要作用。

受LPS刺激后，松江鱸皮膚和血液中的TfMyD88在刺激后2 h表達(dá)量迅速上調(diào)至最大值；肝臟中也在2 h有一個(gè)上調(diào)小高峰，在96 h達(dá)到最大表達(dá)量；脾臟中的TfMyD88是在刺激后12 h達(dá)到最大值。條石鯛受LPS刺激后，血液中的MyD88的最高表達(dá)量是出現(xiàn)在刺激后的12 h，脾臟的峰值是在刺激后3 h［16］；在牙鲆中，用LPS刺激外周血細(xì)胞，MyD88表達(dá)上調(diào)［24］。MyD88在免疫相關(guān)組織中的高量表達(dá)以及受到刺激后表達(dá)的快速上調(diào)都說(shuō)明其可能在免疫反應(yīng)中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)室曾研究發(fā)現(xiàn)，受LPS刺激后，松江鱸血液和皮膚中的IRAK4和IL-1β均在刺激后的2 h表達(dá)量上調(diào)至最大值，二者在肝臟和脾臟中的表達(dá)模式也與TfMyD88的表達(dá)模式高度相似［19］。這可能是因?yàn)榕c哺乳動(dòng)物相同，松江鱸MyD88在TLR信號(hào)通路中，也是通過(guò)招募下游的IRAKs開啟免疫應(yīng)答的。而且，受病原刺激后，TLR信號(hào)路徑于松江鱸不同的器官中啟動(dòng)時(shí)間有所不同。

總之，本研究結(jié)果表明MyD88參與松江鱸的先天免疫，對(duì)病原的侵染具有快速的應(yīng)答反應(yīng)，但是對(duì)MyD88參與抗病的機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究首次成功克隆到松江鱸TfMyD88全長(zhǎng)cDNA序列，TfMyD88 cDNA全長(zhǎng)1 555 bp，編碼288個(gè)氨基酸。TfMyD88含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：死亡結(jié)構(gòu)域（DD）和TIR結(jié)構(gòu)域。TfMyD88廣泛表達(dá)于松江鱸各組織，但在鰓中表達(dá)最為豐富。LPS刺激后，在血液、肝臟、皮膚、脾臟 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Molecular Cloning and Expression Analysis of MyD88 in Roughskin Soulpin，Trachidermus fasciatus

Bi Caihong Zhang Qiuxia Yu Shanshan Chen Xuezhao Liu Chunying Zhu Qian
（School of Marine Science，Shandong University（Weihai），Weihai 264209）

Myeloid differentiation factor 88（TfMyD88） is a key adaptor protein in the Toll-madiated signaling passway. In this study，we cloned the full-length cDNA from the roughskin soulpin， Trachidermus fasciatus. The full-length of MyD88 was 1 555 bp， which contained an open reading frame（ORF） of 867 bp encoding a polypeptide of 288 amino acids. The deduced amino acid sequence has a conserved death domain（DD） at the N-terminal and a typical Toll/interleukin-1 receptor（TIR） domain at the C-terminal. The mRNA expression patterns of TfMyD88 in healthy and LPS challenged roughskin soulpin were detected using quantitative Real-time PCR. MyD88 was expressed broadly in the blood， heart， liver， gill， intestine， skin， musle， kidney， spleen， brain， with the highest expression in the gill. The expression of TfMyD88 post challenge with LPS（lipopolysaccharide） was detected in blood， liver， gill， skin and spleen. The up-regulation of the expression levels of TfMyD88 in all the detccted tissues after chanllaged by LPS suggests that MyD88 plays an important role in roughskin soulpin defenses against bacterial infection.

Trachidermus fasciatus；MyD88；gene clone；innate immunity；LPS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.020

2014-06-24

威海市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（0000413420608），威海市科委項(xiàng)目（1070432121313）

畢彩紅，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物學(xué)；E-mail：huasa1cu@126.com

祝茜，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：海洋生物學(xué)；E-mail：qianzhu@sdu.edu.cn