曹陽(yáng)理惠 李勇 孔穩(wěn)穩(wěn) 李晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

西蘭花CYP83A1基因的克隆及序列分析

曹陽(yáng)理惠 李勇 孔穩(wěn)穩(wěn) 李晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

為深入研究西蘭花4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷的合成代謝途徑，對(duì)關(guān)鍵合成酶基因CYP83A1進(jìn)行了克隆與生物信息學(xué)分析。根據(jù)前期西蘭花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作中獲得的序列數(shù)據(jù)，同時(shí)參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥、小白菜和油菜等7種植物的CYP83A1基因CDS序列與西蘭花進(jìn)行比對(duì)，確定西蘭花CYP83A1基因（BoCYP83A1）的CDS序列。采用RT-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了克隆，獲得BoCYP83A1基因的CDS區(qū)序列，其全長(zhǎng)為1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的分子量為57.47 kD，理論等電點(diǎn)為7.1，包含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，且整個(gè)序列中不含信號(hào)肽，具有一個(gè)典型的P450結(jié)構(gòu)域。氨基酸同源性分析表明，西蘭花與油菜、大白菜的CYP83A1的相似性較高，均為98%。首次獲得BoCYP83A1的CDS序列，其登錄號(hào)為KM111290。

西蘭花；CYP83A1基因；芥子油苷；序列分析；抗癌活性

芥子油苷（Glucosinolates，GS）又名硫代葡萄糖苷，是由氨基酸衍生而來(lái)的一類含氮、硫的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要存在于十字花科（Brassicaceae）植物中［1］，如模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）、西蘭花、油菜、白菜及蘿卜等植物。芥子油苷由3個(gè)基本結(jié)構(gòu)組成，即β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團(tuán)和可變的非糖側(cè)鏈R［2］，目前已發(fā)現(xiàn)的芥子油苷至少有120種［3］。根據(jù)氨基酸來(lái)源的不同，芥子油苷可分為脂肪族芥子油苷（來(lái)源于亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸或丙氨酸）、芳香族芥子油苷（來(lái)源于酪氨酸或苯丙氨酸）和吲哚族芥子油苷（來(lái)源于色氨酸）［4］。脂肪族芥子油苷的合成過(guò)程共分為3步：氨基酸側(cè)鏈的延長(zhǎng)、核心結(jié)構(gòu)的形成和葡萄糖配基側(cè)鏈的次級(jí)修飾［4］。在植物體中，芥子油苷起到防御昆蟲咬食以及病原菌侵害的重要作用［5］。同時(shí)，芥子油苷與十字花科蔬菜的特殊風(fēng)味有著密切的關(guān)系，如蘿卜的辛辣味［6，7］。

經(jīng)前人研究，模式植物擬南芥基因組測(cè)序完成，在芥子油苷生物合成途徑中的代謝調(diào)控基因陸續(xù)被鑒定出來(lái)。MAM基因負(fù)責(zé)調(diào)控側(cè)鏈的延長(zhǎng)，CYP79酶負(fù)責(zé)催化芥子油苷核心結(jié)構(gòu)形成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，即氨基酸轉(zhuǎn)化為乙醛肟。CYP83酶催化核心結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵步驟，即乙醛肟轉(zhuǎn)化為芥子油苷［8，9］。CYP83酶屬于細(xì)胞色素P450家族，是眾多代謝途徑中催化關(guān)鍵步驟的單氧化酶。眾所周知，細(xì)胞色素P450家族是最大的酶蛋白家族之一［10］。P450s幾乎存在于所有生物體中，且在植物體中大量存在，其氨基酸序列十分多樣化［11］。盡管擬南芥中芥子油苷合成途徑已經(jīng)基本建立，但作為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜西蘭花，其芥子油苷合成代謝相關(guān)基因的報(bào)道卻很少。

西蘭花（Brassica oleracea var. italica）又名花椰菜、綠花菜、青花菜，是十字花科（Brassicaceae）蕓薹屬（Brassica）甘藍(lán)變種，為一、二年生草本植物，原產(chǎn)于意大利［12］。西蘭花營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素和胡蘿卜素，營(yíng)養(yǎng)成份位居同類蔬菜之首，被譽(yù)為“蔬菜皇冠”。西蘭花中含有豐富的芥子油苷［13］，而西蘭花花球中的脂肪族芥子油苷所占比例最高［14］。其中4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷屬于脂肪族芥子油苷，其降解產(chǎn)物中的蘿卜硫素具有抗癌活性［15］，因此備受關(guān)注。西蘭花中含有的蘿卜硫素（glucoraphanin）是異硫氰酸酯衍生物中具有最強(qiáng)抗癌活性的一種物質(zhì)［16］，對(duì)肺癌、食管癌、前胃癌作用明顯。目前，美國(guó)已經(jīng)將富含蘿卜硫素的西蘭花幼苗應(yīng)用于腫瘤的臨床治療中［17］。

由此可見(jiàn)，芥子油苷對(duì)于十字花科植物響應(yīng)外界蟲害是極其重要的，并使其具有特殊風(fēng)味。因此，充分研究十字花科植物中調(diào)控芥子油苷合成的基因就顯得十分重要。由于西蘭花在生活、科研和醫(yī)療等方面具有重要作用，因而本研究將西蘭花作為試驗(yàn)材料。介于CYP83A1調(diào)控基因僅對(duì)脂肪族乙醛肟具有高親和性，且將脂肪族乙醛肟轉(zhuǎn)變?yōu)橄N基芥子油苷、羥烷基芥子油苷和甲磺基芥子油苷進(jìn)而生成脂肪族芥子油苷［18］。因此本研究以CYP83A1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，旨在克隆和分析西蘭花芥子油苷合成途徑中的CYP83A1基因。目前為止，CYP83A1已分別在擬南芥、油菜、蘿卜、苜蓿、白菜和小白菜等植物中被成功克隆，而西蘭花CYP83A1基因的研究?jī)H限于已知599 bp的部分CDS序列，其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等信息尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究根據(jù)前期西蘭花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作中獲得的序列數(shù)據(jù)，同時(shí)參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥、小白菜和油菜等7種植物的CYP83A1基因CDS序列與西蘭花進(jìn)行比對(duì)，確定西蘭花CYP83A1基因的CDS序列。Mizutani和Müller 等［19，20］發(fā)現(xiàn)模式植物擬南芥CYP83A1基因優(yōu)先在葉片中表達(dá)，因此本研究參照模式植物擬南芥以西蘭花葉片為試驗(yàn)材料，克隆得到CYP83A1基因的CDS全長(zhǎng)序列并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。為深入研究西蘭花芥子油苷合成提供參考數(shù)據(jù)，為培育具有較高抗癌、抗病活性的優(yōu)良西蘭花品種提供基因資源和數(shù)據(jù)參考，本研究中將西蘭花中的CYP83A1基因命名為BoCYP83A1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 西蘭花（Brassica oleracea var. italica）為“青秀”一代自交品系，將種子置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中3-4 d，24 h光照。經(jīng)種子萌發(fā)后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1，光暗周期24 h/0 h。待4周后，取西蘭花的幼葉作為試驗(yàn)材料。

1.1.2 菌株與試劑 西蘭花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物次生代謝實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌DH5α、Not I和Pst I限制性內(nèi)切酶、植物總RNA提取試劑盒、克隆載體pEASY-T5 Zero 試劑盒、LA Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTP購(gòu)自TIAGEN生物科技公司；凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Bioteke公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 西蘭花葉片總RNA的提取和cDNA的合成用TIANGEN公司植物RNA提取試劑盒（Easy Pure Plant RNA Kit）提取西蘭花總RNA，提取方法參照說(shuō)明書。cDNA的合成參照Bioteke公司的supermoIII RT Kit 說(shuō)明書。

1.2.2 西蘭花CYP83A1基因的克隆及測(cè)序 將西蘭花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與大白菜（FJ376049.1）、油菜（JX01730-1.1）、苜蓿（JX946192.1）、蘿卜（KF682449.1）、黑芥菜（KF146937.1）、擬南芥（MM117451.3）和小白菜（HM347235.1）CYP83A1基因同源的序列。根據(jù)該序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物（F：5'-ATGGTGCGGACACCATGTT-3'，R：5'-TCATGC AAAATAGTTGTCAATATCTT-3'），以西蘭花cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)贈(zèng)。PCR反應(yīng)體系參見(jiàn)LA Taq DNA聚合酶（TIANGEN）說(shuō)明書。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，53℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min 4 0 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Bioteke）回收目的條帶。將回收的目的片段與克隆載體pEASY-T5（TIANGEN）連接，連接反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2 μL，pEASY-T5載體1 μL，25℃反應(yīng)15 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性克隆于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用M13通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，將酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒交由博士生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 西蘭花CYP83A1基因的生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，確定西蘭花CYP83A1基因的CDS序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastx和Blastp搜索引擎對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。利用DNAMAN軟件對(duì)其他物種的同源氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。利用MEGA 5.03軟件構(gòu)建不同植物CYP83A1氨基酸序列進(jìn)化樹。根據(jù)Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析。根據(jù)NetPhos 2.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件對(duì)氨基酸翻譯后修飾進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)ExPASy的 ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/ proscale.pl）程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHM M/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)。利用SOPMA在線軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。利用SignalP軟件2.0版（http：//www.cbs.dtu.dk /services/SignalP/） 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用PSORT（http：//psort.nibb. ac.jp/）II 軟件進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測(cè)。利用SMAR（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)功能域的預(yù)測(cè)。利用SWISS-MODEL和Swiss-pdb軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。將正確的基因序列登陸到GenBank中并獲取登錄號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 西蘭花CYP83A1基因的克隆

根據(jù)西蘭花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥、小白菜和油菜等CYP83A1基因的CDS序列進(jìn)行比對(duì)，獲得其同源保守區(qū)域并設(shè)計(jì)特異性引物。以西蘭花4周大葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。通過(guò)PCR反應(yīng)，得到一條1 500 bp左右的條帶，與預(yù)測(cè)目的基因長(zhǎng)度一致（圖1）。

圖1 西蘭花CYP83A1基因的擴(kuò)增

2.2 陽(yáng)性單菌落的篩選與檢測(cè)

將上述PCR產(chǎn)物用凝膠試劑盒回收后連接到pEASY-T5載體上，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)M13載體通用引物進(jìn)行PCR鑒定后，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2），進(jìn)一步確定擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與目的片段長(zhǎng)度一致。將PCR和雙酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒測(cè)序，利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）表明該基因全長(zhǎng)為1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸。GenBank登錄號(hào)為：KM111290。

圖2 EASY-T5-T-BoCYP83A1的質(zhì)粒雙酶切圖

2.3 同源性及進(jìn)化樹分析

利用NCBI中的BLASTN和BLASTP程序，分析西蘭花CYP83A1基因與其他植物CYP83A1的核苷酸同源性及氨基酸同源性。BLASTN分析表明，西蘭花CYP83A1基因CDS與大白菜（FJ376049.1）、油菜（JX017301.1）、苜蓿（JX946192.1）、蘿卜（KF-682449.1）、黑芥菜（KF146937.1）、擬南芥（MM11-7451.3）和小白菜（HM347235.1）的核酸同源性分別為97%、97%、95%、95%、93%、88%和87%；BLASTP分析表明，西蘭花CYP83A1基因編碼的氨基酸序列與油菜（AGD95055.1）、大白菜（ACR10-257.1）、苜蓿（AGS49167.1）、蘿卜（AHB11194.1）、黑芥菜（AGO37753.1）、擬南芥（AAA79982.1）和小白菜（ADK32329.1）的氨基酸同源性分別為98%、98%、97%、97%、92%、88%和86%（圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果（圖4）也表明，西蘭花CYP-83A1基因在進(jìn)化樹上與大白菜、油菜等最接近，與擬南芥、小白菜等關(guān)系較遠(yuǎn)。同時(shí)圖4顯示，西蘭花CYP83A1基因與油菜（AGD95055.1）、大白菜（ACR10257.1）一致性較高，與小白菜（ADK32329.1）的一致性較低，說(shuō)明西蘭花CYP83A1基因在進(jìn)化過(guò)程中可能存在功能上的分支。

2.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

根據(jù)Protparam軟件分析，西蘭花CYP83A1蛋白由8 097個(gè)原子組成，分子質(zhì)量為57.47 kD，分子式為C2600H4058N674O736S29，理論等電點(diǎn)pI=7.1；丙氨酸和亮氨酸含量分別為34和41個(gè)，占總數(shù)的6.8%和8.2%；帶正電荷殘基總數(shù)為64，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)為64。分析結(jié)果顯示，該蛋白在離體試驗(yàn)條件下的哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，在離體試驗(yàn)的酵母中半衰期為＞ 20 h，在離體試驗(yàn)的大腸桿菌中半衰期為＞10 h；脂肪族指數(shù)為80.80，不穩(wěn)定指數(shù)為33.23，屬于穩(wěn)定類蛋白。

根據(jù)TMHMM軟件分析，西蘭花CYP83A1蛋白的氨基酸序列上共發(fā)現(xiàn)2個(gè)跨膜區(qū)域，分別位于氨基酸第4-21位（由外向內(nèi)）和294-316位（由內(nèi)向外），N端在膜外側(cè)，說(shuō)明該蛋白屬于跨膜蛋白（圖5-A）。用ProtScale對(duì)西蘭花CYP83A1氨基酸序列的親水性/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖5-B）表明，多肽鏈中的第12位氨基酸具有最高的分值3.267，表明該位點(diǎn)的氨基酸疏水性最強(qiáng)；第101位的氨基酸分值最低為-3.100，表明其親水性最強(qiáng)。根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果可知，總平均親水性（GRAVY）為-0.252，此為親水性蛋白。

蛋白質(zhì)基序預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，第350-353氨基酸處有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，并包含2個(gè)酰胺化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)SignalP軟件分析，西蘭花CYP83A1基因編碼的蛋白質(zhì)，由于該序列定位于線粒體（mTP）值為0.096、信號(hào)肽（SP）值為0.015，所以該蛋白不定位于線粒體，無(wú)信號(hào)肽，為非分泌型蛋白。用SMART在線軟件分析了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能域，結(jié)果（圖5-E）顯示，在第4-21位之間是一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；在第31-494位之間有一個(gè)典型的P450結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明西蘭花CYP83A1蛋白屬于P450蛋白家族。

用SOPMA對(duì)西蘭花CYP83A1氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖5-C），西蘭花的CYP83A1由44.42%的α-螺旋、14.94%的延伸鏈、10.76%的β-轉(zhuǎn)角和29.88%的無(wú)規(guī)則卷曲組成。由分析數(shù)據(jù)可得結(jié)論，α-螺旋是西蘭花CYP83A1中最多的元件，以不規(guī)則卷曲散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。用Netph2.0 Server對(duì)西蘭花CYP83A1的翻譯后修飾預(yù)測(cè)的結(jié)果（圖5-D）表明，整個(gè)肽鏈中分值在0.5（閾值）以上的氨基酸位點(diǎn)有16個(gè)，可知CYP83A1的磷酸化位點(diǎn)有16個(gè)，其中Ser：6、Thr：6、Tyr：1。

利用SWISS-MODEL和SWISS-PDB軟件，輸入該CYP83A1的氨基酸序列，根據(jù)已知蛋白質(zhì)結(jié)進(jìn)行該CYP83A1三維結(jié)構(gòu)的同源建模（圖5-F）。CYP83A1三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為研究CYP83A1結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了理論參考。

圖3 西蘭花CYP83A1蛋白的氨基酸序列與其他相關(guān)序列的多重比對(duì)

圖4 不同植物CYP83A1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 BoCYP83A1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

3 討論

根據(jù)西蘭花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中油菜、苜蓿、擬南芥等CYP83A1基因CDS序列進(jìn)行比對(duì)，獲得BoCYP83A1同源保守序列。以西蘭花4周大葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，克隆得到該基因的CDS全長(zhǎng)序列。通過(guò)測(cè)序和NCBI中的BLASTN、BLASTP程序［21］分析表明，該基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列與大白菜、油菜的相似性最高，分別為97 %和98 %。由此可知，CYP83A1在西蘭花、大白菜以及油菜種具有很高的保守性。利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)西蘭花CYP83A1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，根據(jù)Protparam軟件［22］分析以及Netph2.0 Server［23］翻譯后修飾預(yù)測(cè)獲得了BoCYP83A1的理化性質(zhì)，且與擬南芥CYP83A1的理化性質(zhì)（數(shù)據(jù)未列出）相比較，二者大體相類似且均為穩(wěn)定類蛋白。根據(jù)TMHMM［24］、SignalP［25］和ProtScale［26］軟件預(yù)測(cè)出BoCYP83A1是一個(gè)具有跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白。其主要的二級(jí)元件是α-螺旋和不規(guī)則卷曲，同時(shí)SMART在線軟件分析表明西蘭花CYP83A1蛋白具有細(xì)胞P450家族特征性結(jié)構(gòu)域及保守功能域，與擬南芥CYP83A1具有相同結(jié)構(gòu)域。利用SWISS-MODEL和SWISS-PDB［27］軟件，獲得BoCYP83A1蛋白的三維結(jié)果和同源建模。上述分析表明，BoCYP83A1與擬南芥CYP83A1的堿基序列和氨基酸序一致性較低，但具有相同結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明功能上同為一個(gè)家族，這對(duì)研究BoCYP83A1基因奠定了重要的基礎(chǔ)。

至今，西蘭花中CYP83A1基因的過(guò)表達(dá)和缺失對(duì)于防御蟲害、病原菌等起到的作用尚未知曉，并且西蘭花CYP83A1基因序列及其功能的研究報(bào)道甚少。而在2014年Corina Weis、Ulrich Hildebrandt等［28］以擬南芥CYP83A1缺失突變體和十字花科白粉菌為試驗(yàn)材料，著重研究在CYP83A1基因缺失導(dǎo)致脂肪族乙醛肟和未鑒定的代謝產(chǎn)物的積累的情況下，此改變延緩十字花科白粉菌的生長(zhǎng)了，說(shuō)明擬南芥中CYP83A1基因缺失對(duì)于防御真菌起到了積極的作用。因BoCYP83A1與擬南芥CYP83A1功能上具有相似性且為同一功能家族，因此以十字花科模式植物擬南芥CYP83A1基因?yàn)橐罁?jù)，對(duì)西蘭花CYP83A1基因進(jìn)行深入研究是具有重要意義的。由于脂肪族芥子油苷與十字花科蔬菜的抗癌活性及其風(fēng)味有關(guān)［29］，今后若能通過(guò)試驗(yàn)將西蘭花中的脂肪族芥子油苷含量提高，此種西蘭花在食用、醫(yī)療和科研等方面將具有重要意義。通過(guò)對(duì)CYP83A1基因的生物信息學(xué)分析，對(duì)今后該基因的研究及西蘭花芥子油苷合成途徑的更深入的了解提供了一定的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

首次成功克隆并報(bào)道了西蘭花CYP83A1基因的CDS全長(zhǎng)序列，利用生物學(xué)軟件和網(wǎng)站對(duì)該序列進(jìn)行同源性比對(duì)、進(jìn)化樹分析、理化性質(zhì)分析，獲得了西蘭花CYP83A1基因的部分信息。

［1］ Bekaert M， Edger PP， Hudson CM， et al. Metabolic and evolutionary costs of herbivory defense：systems biology of glucosinolate synthesis［J］. New Phytologist， 2012， 196（2）：596-605.

［2］ Buxdorf K， Yaffe H， Barda O， et al. The Effects of glucosinolates and their breakdown products on necrotrophic fungi［J］. PloS one，2013， 8（8）：e70771.

［3］ S?nderby IE， Geu-Flores F， Halkier BA， et al. Biosynthesis of glucosinolates-gene discovery and beyond［J］. Trends Plant Sci，2010， 15（5）：283-290.

［4］ Fahey JW， Zalcmann AT. The Chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants［J］. Phytochemistry， 2001， 56（1）：5-51.

［5］ Gachon CMM， Langlois-Meurinne M， Henry Y， et al. Transcription co-regulation of secondary metabolism enzymes in Arabidopsis：functional and evolutionary implications［J］. Plant Molecular Biology， 2005， 58（2）：229-245.

［6］黃界潁， 馬友華. 油菜硫甙特征功能及其測(cè)定方法［J］. 植物生理學(xué)通訊， 2003， 39（5）：496-500.

［7］徐東輝. 白菜類作物硫代葡萄糖甙及一些主要代謝組分的遺傳分析［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2007.

［8］ Grubb CD， Abel S. Glucosinolate metabolism and its control［J］. Trends Plant Science， 2006， 11（2）：89-100.

［9］ Smolen G，Bender J. Arabidopsis cytochrome p450 cyp83B1mutation active the tryptophan biosynthetic pathway［J］. Genetics， 2002，160（2）：323-332.

［10］ Bak S， Feyereisen R. The involvement of two P450 enzymes CYP-83B1 and CYP83A1 in auxin homeostasis and glucosinolate biosynthesis［J］. Plant Physiologists， 2010， 127（1）：108-118.

［11］ Wereck-Reichart D， Feyereisen R. Cytochromes P450：a success story［J］. Genome Biology， 2000， 1（6）：3003. 1-3003. 9.

［12］季宇彬， 池文杰， 鄒翔， 等. 西蘭花中蘿卜硫素提取、分離與抗癌活性研究［J］. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005， 21（3）：270-273.

［13］ Thomas R， Rüdiger H. Effect of Se-fertilization on the growth and S-metabolism of Broccoli（Brassica oleracea var. italic）［D］. Germany：Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics Of the Ruperto-Carola University of Heidelberg， 2010.

［14］ 何洪巨， 陳杭. 蕓薹屬蔬菜中硫代葡萄糖苷鑒定與含量分析［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2002， 35（2）：192-197.

［15］ Navarro SL， Li F， Lampe JW. Mechanisms of action of isothiocyanates in cancer chemoprevention：an update［J］. Food & Function， 2011， 2（10）：579-587.

［16］宋廷宇， 侯喜林， 何啟偉， 等. 薹菜中硫代葡萄糖苷的鑒定與含量分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35：1161-1166.

［17］ Gao J， Yu X， Ma F， et al. RNA-Seq analysis of transcriptome and glucosinolate metabolism in seeds and sprouts of Broccoli brassica oleracea varitalic［J］. PloS One， 2014， 9（2）：e88804.

［18］ 程坤， 楊麗梅， 方智遠(yuǎn)， 等. 十字花科植物中主要硫代葡萄糖苷合成與調(diào)節(jié)基因的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)蔬菜， 2010（12）：1-6.

［19］ Mizutani M， Ward E， Ohta D. Cytochrome P450 superfamily in Arabidopsis thaliana：isolation of cDNAs， differential expression and RFLP mapping of multiple cytochromes P450［J］. Plant Mol Biol， 1998， 37（1）：39-52.

［20］ Müller A， Weiler EW. Indolic constituents and indole-3-acetic acids biosynthesis in the wild-type and a tryptophan auxotroph mutant of Arabidopsis thaliana［J］. Planta， 2000， 211（6）：855-863.

［21］ Mark J， Irena Z， Yan R， et al. NCBI BLAST：a better web interface［J］. Nucleic Acids Research， 2008， 36：W5-W9.

［22］ Elisabeth G， Christine H， Alexandre G， el at. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server［M］. The Protocols Handbook：Humana Press， 2005：571-607.

［23］ Geourjon C， Deleage G. SOPMA：significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments［J］. Computer Applications in the Biosciences：CABIOS， 1995， 11（6）：681-684.

［24］ Chen YJ， Yu P， Luo JC， et al. Secreted protein prediction system combining CJ-SPHMM，TMHMM and PSORT［J］. Mammalian Genome， 2003， 14（12）：859-865.

［25］ Dyrl?v Bendtsen J， Nielsen H， von Heijne G， et al. Improved prediction of signal peptides：SignalP 3. 0. ［J］. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）：783-795.

［26］ Gomase VS， Chitlange NR， Sherkhane AS， et al. Prediction of Wuchereria Bancrofti Troponin antigenic peptides：application in synthetic vaccine design to counter lymphatic filariasis［J］. J Vaccines Vaccin， 2013， 4（169）：2.

［27］ Guex N， Peitsch MC. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer：an environment for comparative protein modeling［J］. Electrophoresis， 1997， 18（15）：2714-2723.

［28］ Weis C， Hildebrandt U， Hoffmann T， et al. CYP83A1 is required for metabolic compatibility of Arabidopsis with the adapted powdery mildew fungus Erysiphe cruciferarum［J］. New Phytologist， 2014，202（4）：1310-1319.

［29］ Baik HY， Juvik JA， Jeffery EH， et al. Relating glucosinolate content and flavor of broccoli cultivars［J］. Journal of Food Science，2003， 68（3）：1043-1050.

.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Sequence Analysis of CYP83A1 Gene from Brassica oleracea var. italica

Cao Yanglihui Li Yong Kong Wenwen Li Jing
（Key Laboratory of Agricultural Functional Genes，Northeast Agricultural University College of Life Sciences，Harbin 150030）

To further research the related genes involved in 4-methylsulfinybutyl-glucosinolate biosynthesis in Brassica oleracea var. italica， the key synthetase CYP83A1gene was cloned and analyzed by bioinformatics. The sequence of CYP83A1 from the previous data of broccoli transcriptome sequencing and the sequences of CYP83A1 in seven other plants （Arabidopsis thaliana， Brassica napus and the Brassica rapa subsp. Pekinesis et.al）which obtained from GenBank were alignmented with each other using NCBI blaster， and we confirmed that the homologically conserved region of CYP83A1 gene in Brassica oleracea var. italica （BoCYP83A1）. Using RT-PCR method， the CDS region of BoCYP83A1 was obtained. Bioinformatic analysis indicated that the CDS region of BoCYP83A1 was 1 509 bp long which encoded a predicated a protein contains 502 amino acids. Protein analysis showed that BoCYP83A1 molecular weight was 57.47 kD， theoretical pI was 7.1 and contained two span membrane structures， and the BoCYP83A1 does not have signal peptide sequences， while possessed a P450 functional domains. Homology analysis of the deduced amino acids indicated that BoCYP83A1 had 98% similarity with Brassica napus and the Brassica rapa subsp. Pekinesis. The gene registration number of Brassica oleracea var. italica CYP83A1 gene is KM111290.

Brassica oleracea var. italica；CYP83A1 gene；glucosinolates；sequence analysis；antitumor activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.015

2014-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370334）

曹陽(yáng)理惠，女，碩士，研究生，研究方向：植物學(xué)；E-mail：caoyanglihui@126.com

李晶，女，博士，教授，研究方向：植物學(xué)；E-mail：lijing@neau.edu.cn