王迪路福平王海軍李德茂陳樹(shù)林張可

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育淀粉發(fā)酵產(chǎn)DHA的新型裂殖壺菌

王迪1路福平1王海軍1李德茂2陳樹(shù)林2張可2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

以生產(chǎn)DHA的裂殖壺菌（Schizochxtrium）B4D1和黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 3.316為出發(fā)菌株，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育可以利用淀粉發(fā)酵生產(chǎn)DHA的新型裂殖壺菌。用裂解酶制得了兩親本的原生質(zhì)體，通過(guò)研究?jī)捎H本培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)方法、酶解時(shí)間等條件對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量影響的基礎(chǔ)上，以PEG介導(dǎo)進(jìn)行了原生質(zhì)體的融合，最終確定了原生質(zhì)體融合最佳條件為40%的 PEG6000，融合溫度30℃，融合時(shí)間為10 min，在此條件下融合率可達(dá)1.9%。通過(guò)比較菌落外觀、顏色、形態(tài)以及分離培養(yǎng)篩選獲得了一株利用淀粉裂殖壺菌融合子。經(jīng)過(guò)RAPD驗(yàn)證表明B4D1與CGMCC 3.316發(fā)生了重組，融合菌株表達(dá)了更多源于B4D1的遺傳信息。

裂殖壺菌；DHA；原生質(zhì)體；融合；淀粉

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)DHA），是人體所必需的一種多不飽和脂肪酸，能夠輔助嬰幼兒腦細(xì)胞發(fā)育，而且還具抗衰老和降低血脂、改善血液循環(huán)、抑制腫瘤等功效［1，2］。因此，DHA己經(jīng)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)嬰幼兒食品、保健食品和輔助治療劑等產(chǎn)品。由于裂殖壺菌DHA含量高、生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、對(duì)人畜無(wú)毒害，目前是一種極具生產(chǎn)前景的DHA微生物資源［3］。

國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在用裂殖壺菌以葡萄糖為底物高效發(fā)酵產(chǎn)DHA［4，5］，但是葡萄糖原料比較貴，導(dǎo)致產(chǎn)品價(jià)格比較高。淀粉相對(duì)于葡萄糖來(lái)講是一種量大、價(jià)廉的底物，通常在工業(yè)生產(chǎn)中，必需先將淀粉以酶法或酸法制成淀粉水解糖，再加以利用［6］。如果能選育出可直接以淀粉為碳源生產(chǎn)DHA的優(yōu)良菌株，將會(huì)大大簡(jiǎn)化生產(chǎn)程序，降低生產(chǎn)成本。

原生質(zhì)體融合是一種基因重組技術(shù)，指通過(guò)人為的方法，將遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。這種方法打破了微生物的種界界限，可發(fā)生在種內(nèi)、種間，甚至親緣很遠(yuǎn)的兩個(gè)物種之間，可以擴(kuò)大融合頻率和幅度，是一種常見(jiàn)的育種方法。原生質(zhì)體融合與常規(guī)雜交相比有很多優(yōu)勢(shì)，不但能顯著提高重組頻率，而且具有定向育種的含義，目前該技術(shù)已成為細(xì)胞生物學(xué)迅速發(fā)展的方向之一［7］。

針對(duì)裂殖壺菌不能利用淀粉的問(wèn)題，本試驗(yàn)采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，選取高效利用淀粉的黑曲霉和DHA高產(chǎn)菌株裂殖壺菌B4D1，通過(guò)兩親本對(duì)碳源的利用不同，滅活后進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選出能以淀粉為碳源生產(chǎn)DHA的融合菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 裂殖壺菌 B4D1本實(shí)驗(yàn)室保存；黑曲霉CGMCC 3.316購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所普通菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基［8］：1.2%葡萄糖，0.2% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.04% NaH2PO4，0.1% NH4NO3，0.1%微量元素（4% CuSO4，1.1% ZnSO4，0.6% MnSO4，0.1% FeSO4，0.03% CoCl2，0.06% H3BO3，pH5.8）。淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉5 g/L，蛋白陳10 g/L，酵母粉5 g/L，海水晶15 g/L，瓊脂20 g/L，用HPBS配置。以上培養(yǎng)基121℃滅菌20 min。

GYP培養(yǎng)基［9］：葡萄糖20 g/L，蛋白陳10 g/L，酵母粉5 g/L，海水晶15 g/L，115℃滅菌20 min。

高滲培養(yǎng)基用高滲緩沖液HPBS配置，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂［10］。

1.1.3 試劑 緩沖溶液PBS：0.2 mol/L磷酸緩沖溶液，pH5.8，121℃滅菌 20 min。高滲緩沖液HPBS： PBS中添加0.7 mol/L的KCl。預(yù)處理劑0.3% β 巰基乙醇-0.1% EDTA［11］：于PBS中添加0.1% EDTA，121℃滅菌20 min。臨用前添加0.3% β 巰基乙醇。酶液［12］：溶壁酶（Lysing enzyme）購(gòu)自Sigma公司。稱(chēng)取裂解酶，懸于HPBS中充分振蕩并靜置，使之完全溶解，至濃度為5 mg/mL。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，保存于4℃冰箱備用。促溶劑：PEG6000用HPBS配制成一定質(zhì)量濃度的的溶液，121℃滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床、恒溫水浴箱、顯微鏡、離心機(jī)、紫外凝膠成像儀、研缽、培養(yǎng)皿、移液槍、試管、錐形瓶、離心管等。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)及收集 黑曲霉菌絲培養(yǎng)：將原始菌種轉(zhuǎn)接至PDA斜面固體培養(yǎng)基上，待孢子生長(zhǎng)成熟后，用PBS洗脫孢子，調(diào)整孢子濃度為108個(gè)/mL，以10%的接種量接入菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量50 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間12-15 h，收集培養(yǎng)液置于滅菌的50 mL離心管中，4 000 r/min 離心10 min，用PBS緩沖液洗滌離心2次［13］，棄上清液，保留菌絲體。

裂殖壺菌菌體培養(yǎng)：將B4D1菌株接種于GYP液體培養(yǎng)基，25℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24-48 h，收集培養(yǎng)液15 mL于滅菌的50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌離心兩次，收集菌體。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備 黑曲霉原生質(zhì)體的制備：向黑曲霉菌絲體中加入酶液，酶液按照 Wmycelium/ Venzymesolution=1∶10（g/mL）加入［14］，25-38℃，100 r/min恒溫振蕩酶解，酶解結(jié)束后，酶解液經(jīng)4層高級(jí)擦鏡紙過(guò)濾，濾液離心（4 000 r/min，10 min），高滲緩沖液HPBS洗滌兩次，棄上清，收集原生質(zhì)體并重懸于10 mL高滲緩沖液HPBS中，血球板計(jì)數(shù)。

裂殖壺菌原生質(zhì)體制備：經(jīng)洗滌的菌體加入預(yù)處理劑［7］10 mL，30℃，180 r/min恒溫振蕩30 min，用HPBS緩沖也洗滌離心（4 000 r/min，10 min），加入酶液至菌體濃度為107/mL，25-38℃，100 r/min恒溫振蕩酶解一段時(shí)間，酶解結(jié)束后，酶解液離心（4 000 r/min，10 min）［7］。用高滲緩沖液HPBS洗滌兩次，重懸于10 mL高滲緩沖液HPBS中。取1 mL原生質(zhì)體懸液，經(jīng)高滲溶液HPBS適當(dāng)稀釋?zhuān)迷偕囵B(yǎng)基傾注法培養(yǎng)2-4 d，計(jì)算菌落數(shù)。

1.2.3 黑曲霉原生質(zhì)體滅活 取黑曲霉原生質(zhì)體細(xì)胞懸液5 mL在55℃水浴中，不同時(shí)間滅活后，經(jīng)高滲溶液HPBS適當(dāng)稀釋?zhuān)迷偕囵B(yǎng)基傾注法測(cè)定細(xì)胞數(shù)，計(jì)算致死率。

1.2.4 原生質(zhì)體融合 取B4D1原生質(zhì)體和滅活后的黑曲霉原生質(zhì)體懸液（濃度106個(gè)/mL）在離心管中等量混合，于 4℃冷凍離心機(jī)中4 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入促溶劑，混勻后放入20-40℃、轉(zhuǎn)速為 100 r/min 的恒溫?fù)u床中數(shù)分鐘以待融合；取出融合后的原生質(zhì)體懸液4℃冷凍離心后用HPBS緩沖液離心洗滌兩次，以將融合劑洗凈，將洗滌后的原生質(zhì)體重懸于 HPBS緩沖液中，得到融合后的原生質(zhì)體用高滲淀粉培養(yǎng)基傾注法25℃培養(yǎng)3-5 d，檢出融合子，測(cè)定細(xì)胞數(shù)［15］。

1.2.5 計(jì)算公式 原生質(zhì)體形成率、再生率、滅活率和融合率的計(jì)算公式參考文獻(xiàn)［2，16］。

1.2.6 融合子篩選 挑選能夠在高滲淀粉培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)的菌落，根據(jù)裂殖壺菌菌落形態(tài)初步檢出融合子，然后轉(zhuǎn)接入含有200 μL GYP 培養(yǎng)基的96孔板中，于 25℃ 180 r/min發(fā)酵3 d。以出發(fā)菌株B4D1作為對(duì)照，用尼羅紅檢測(cè)初步檢測(cè)油脂含量［17］，篩選油脂產(chǎn)量較高的融合子接入淀粉培養(yǎng)基，發(fā)酵6 d，氣相檢測(cè)DHA。

氣相色譜法條件為：島津GC-2010氣相色譜儀，色 譜 柱：SP-2560（100.0 m×0.25 mm×0.20 μm）。N2為載氣，采用程序升溫，起始溫度140℃，保持5 min，然后以4℃/min的速度升至240℃，保持11 min。FID檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為280℃。采用分流進(jìn)樣，分流比為30，進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.7 融合菌株的穩(wěn)定性檢驗(yàn) 對(duì)篩選得到的融合菌株連續(xù)傳代10次，測(cè)定細(xì)胞干重和油脂含量，檢驗(yàn)融合子的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.8 融合菌株的鑒定 應(yīng)用 RAPD 技術(shù)對(duì)融合菌株進(jìn)行鑒定，分析親本與融合菌株之間的遺傳相似性和遺傳距離［18］。

RAPD 的引物篩選：用20個(gè)10 bp的寡核苷酸引物對(duì)親本基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從中篩選擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的引物，用于全部樣本的擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：DNA 模板 0.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，隨機(jī)引物 0.5 μL，無(wú)菌雙蒸水 11.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性 30 s，37℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 8 min，4℃保存。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用 1×TAE 電泳緩沖液，用 1%瓊脂糖凝膠在電壓為 120 V 的電場(chǎng)中電泳 20 min，GoldView染色。在紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，記錄結(jié)果。

數(shù)據(jù)處理：按照公式相似系數(shù)Sxy=2· Nxy/（Nx+Ny）×100%獲得各樣品間的遺傳相似度，其中Nxy是比較后兩種材料x(chóng)和y共有的DNA片段數(shù)目，Nx和Ny分別為材料x(chóng)和y各自的DNA擴(kuò)增片段數(shù)目。再由 D=1-S 獲得相應(yīng)的遺傳距離［6］。

1.2.9 培養(yǎng)基淀粉含量的測(cè)定 將融合子在淀粉培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)定培養(yǎng)基中淀粉含量，方法參考文獻(xiàn)［19］。

2 結(jié)果

2.1 裂殖壺菌和黑曲霉原生質(zhì)體制備與再生條件的確定

2.1.1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)在細(xì)胞不同的時(shí)期有所不同，因而細(xì)胞對(duì)酶的敏感性有差異。通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線及不同培養(yǎng)時(shí)期細(xì)胞原生質(zhì)體形成率，發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌和黑曲霉原生質(zhì)體化的較適菌齡分別為36 h和15 h左右，約處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期。

2.1.2 酶解溫度和時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 選擇原生質(zhì)體最佳的制備條件不僅要使原生質(zhì)體制備率達(dá)到最高，同時(shí)還要考慮原生質(zhì)體再生率不能過(guò)低，因此原生質(zhì)體制備條件要在選擇保證原生質(zhì)體再生率的同時(shí)選擇原生質(zhì)體制備率最高的條件。由圖1-圖4結(jié)果可確定裂殖壺菌B4D1的最佳原生質(zhì)體制備條件：酶作用溫度為 32℃，酶作用時(shí)間為 60 min，黑曲霉的最佳原生質(zhì)體制備條件：酶作用溫度為 32℃，酶作用時(shí)間為2.5 h。

圖1 裂殖壺菌原生質(zhì)體制備作用溫度

圖2 黑曲霉原生質(zhì)體制備作用溫度

圖3 裂殖壺菌原生質(zhì)體制備作用時(shí)間

圖4 黑曲霉原生質(zhì)體制備作用時(shí)間

2.2 黑曲霉原生質(zhì)體的滅活及融合條件的確定

2.2.1 原生質(zhì)體滅活條件的選擇 滅活的目的是為了標(biāo)記融合子，即讓親本黑曲霉原生質(zhì)體全部致死，而經(jīng)過(guò)融合后所生長(zhǎng)的即為融合二倍體，所以滅活率需達(dá)到 100%。原生質(zhì)體熱滅活的試驗(yàn)結(jié)果，如圖5所示。為保證原生質(zhì)體的滅活率為 100%，最后確定黑曲霉高溫滅活溫度為 55℃，時(shí)間為20 min。

圖5 不同作用時(shí)間對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體的滅活效果

2.2.2 促溶劑PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由于PEG6000對(duì)原生質(zhì)體的毒性和原生質(zhì)體對(duì)有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定劑的敏感性，PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能過(guò)大，否則融合頻率會(huì)迅速下降。由圖6可知，融合率隨PEG6000 濃度升高增加到1.9%當(dāng)濃度超過(guò)60%時(shí)，融合率下降到0.7%。因此選擇 PEG6000 濃度為40%作為原生質(zhì)體融合時(shí)的 PEG 濃度。

圖6 PEG濃度對(duì)融合率的影響

2.2.3 融合時(shí)間的影響 分別選取1、5、10、15和20 min進(jìn)行融合，測(cè)定融合率如圖7 所示，隨著融合時(shí)間增加到10 min時(shí)，融合率提高到1.2%，當(dāng)融合時(shí)間繼續(xù)增加到20 min 時(shí)，原生質(zhì)體的融合率則降為0.3%，因此為了獲得最大的融合率，選擇10 min 作為原生質(zhì)體的融合時(shí)間。

圖7 融合時(shí)間對(duì)融合率的影響

2.2.4 融合溫度的影響 溫度在一定程度上影響原生質(zhì)體融合率，較高的溫度可以增加性細(xì)胞膜流動(dòng)性，降低 PEG 黏度，有助于原生質(zhì)體的融合。由圖8可知，融合溫度上升到 30℃時(shí)，原生質(zhì)體融合率提高到1.1%。溫度繼續(xù)升高后，融合率降低至0.6%。因此選擇 30℃作為融合溫度。

圖8 融合溫度對(duì)融合率的影響

2.3 融合子的獲得

2.3.1 融合子篩選 由于裂殖壺菌不能利用淀粉，因而無(wú)法在淀粉篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只有融合了黑曲霉的新型裂殖壺菌才能生長(zhǎng)，從原生質(zhì)體融合后的淀粉高滲培養(yǎng)基平板上，分離篩選了5株在25℃生長(zhǎng)旺盛，菌落形態(tài)與黑曲霉菌株不同而與裂殖壺菌形態(tài)相同的淡黃色菌株，編號(hào)為M-1-M-5，然后接種到含200 μL的GYP培養(yǎng)基的96孔板進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，B4D1為對(duì)照，用尼羅紅檢測(cè)油脂含量，結(jié)果表明M-3菌株油脂含量和親本B4D1產(chǎn)油量相當(dāng)。將M-3發(fā)酵6 d后，經(jīng)氣相色譜法檢測(cè)（圖9），對(duì)比DHA標(biāo)準(zhǔn)品可知，融合得到的新型裂殖壺菌具有產(chǎn)DHA能力，而且其可以在淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有雙親本的特性。

圖9 融合子M-3油脂氣相色譜圖

2.3.2 融合菌株穩(wěn)定性分析 融合菌株M-3經(jīng)過(guò)10次傳代，仍然能夠在淀粉培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng)，并且由表1可以看出產(chǎn)油性狀穩(wěn)定。

表1 M-3培養(yǎng)1代和5代干重和油脂含量的比較

2.4 融合子M-3的RAPD分析

2.4.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果 從20個(gè)隨機(jī)引物中篩選出條帶清晰、穩(wěn)定性好的8個(gè)引物，分別為P1（GTTTCGCTCC）、P4（GGACTGGAGT）、P5（TGCGCCCTTC）、P10（CTGCTGGGAC）、P11（GTAGACCCGT）、P15（GGAGGGTGTT）、P19（ACCCCCGAAG）、P20（GGACCCTTAC），對(duì)親本B4D1、CGMCC 3.316及融合子M-3的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的隨機(jī)片段大都在500-2000 bp，結(jié)果見(jiàn)圖10。親本B4D1、CGMCC 3.316及其融合子M-3基因組DNA擴(kuò)增的RAPD帶譜存在差異。同一引物對(duì)兩親本和融合子擴(kuò)增的RAPD條帶也存在一定的差異。融合子M-3的條帶有的與B4D1相同，有的與CGMCC 3.316相同，說(shuō)明融合子M-3的基因組DNA既有與B4D1同源的序列，又有與CGMCC 3.316同源的序列。表明在基因水平上，B4D1與CGMCC 3.316發(fā)生了重組，得到了融合菌株M-3。

圖10 部分引物對(duì)親本及其融合子的 RAPD 擴(kuò)增圖譜

2.4.2 遺傳相似系數(shù)分析 根據(jù)表2的數(shù)據(jù)計(jì)算M-3與兩親本的相似系數(shù)：SSM=0.698，SMC=0.34，SSC=0.182；DSM=0.302，DMC=0.66；DSC=0.818。融合菌株 M-3與親本B4D1的遺傳相似系數(shù)大于與親本CGMCC3.316的遺傳相似系數(shù)，表明融合菌株M-3與親本B4D1的遺傳關(guān)系更近，或者M(jìn)-3表達(dá)了更多源于B4D1的遺傳信息。

表2 八種隨機(jī)引物的擴(kuò)增譜帶

2.5 培養(yǎng)基剩余淀粉含量測(cè)定

用淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)融合子M-3，測(cè)定培養(yǎng)基中剩余淀粉含量結(jié)果見(jiàn)圖11。由圖11可看出，隨著時(shí)間增加，淀粉含量不斷減少，從最初5 g/L減少到2.91 g/L，說(shuō)明融合子可以利用淀粉。

圖11 培養(yǎng)基中淀粉含量隨時(shí)間變化曲線

3 討論

原生質(zhì)體融合技術(shù)具有重組頻率高，遺傳物質(zhì)完善，容易獲得性狀優(yōu)良和生產(chǎn)量高的融合菌等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各種研究工作中。本試驗(yàn)通過(guò)利用雙親對(duì)某種碳源利用狀況的差異作為篩選標(biāo)記進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到了同時(shí)可以產(chǎn)油脂以及以淀粉作為碳源生長(zhǎng)的融合菌株M-3，大大減輕了背景干擾，提高了菌種篩選效率。

徐新立等［20］將油脂高產(chǎn)菌深黃被孢霉3.3410和具有高纖維素活性的黑曲霉SL2-111進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選得到能直接利用纖維素原料的產(chǎn)油菌株。其黑曲霉原生質(zhì)體制備濃度達(dá)到7.2×107個(gè)/mL，再生率達(dá)到28.6%，而本試驗(yàn)只達(dá)到8.7×105個(gè)/mL的原生質(zhì)體濃度和28.4%的再生率。后續(xù)研究需要進(jìn)一步提高黑曲霉原生質(zhì)體的制備率以及再生率。張淑君等［21］利用桑樹(shù)內(nèi)生菜豆殼球孢菌分別與綠色木霉及長(zhǎng)柄木霉進(jìn)行融合，同樣獲得了以纖維素鈉作為唯一碳源產(chǎn)油脂的融合菌株，油脂產(chǎn)量及含量均高于親本。本試驗(yàn)得到的融合菌株，能夠產(chǎn)油脂尤其是DHA，后續(xù)研究需進(jìn)一步融合菌株繼續(xù)融合或誘變，以提高融合率，從而得到更多的融合子進(jìn)行篩選。本試驗(yàn)證明了利用原生質(zhì)體融合進(jìn)行菌株選育的可行性。后期還應(yīng)探討其最佳培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件，以最終能將其應(yīng)用于生產(chǎn)，發(fā)揮經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié)論

本研究確定了原生質(zhì)體融合最佳條件為40%的PEG6000，融合溫度 30℃，融合時(shí)間為10 min，在此條件下融合率可達(dá)1.9%。篩選出一株可以在淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的融合子，經(jīng)過(guò)氣相色譜檢測(cè)其可以生產(chǎn)DHA。通過(guò)RAPD驗(yàn)證表明B4D1與CGMCC 3.316發(fā)生了重組，融合菌株表達(dá)了更多源于B4D1的遺傳信息。

［1］ 陳誠(chéng). 裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum SR21）發(fā)酵制備二十二碳六烯酸（DHA）過(guò)程的初步研究［D］. 杭州：浙江大學(xué)，2007.

［2］Armenta RE， Valentine MC. Single-cell oils as a source of omega-3 fatty acids：an overview of recent advances［J］. Journal of the American Oil Chemists’ Society， 2013， 90（2）：167-182.

［3］ 王申強(qiáng). 裂殖壺菌產(chǎn)DHA的發(fā)酵工藝研究及高產(chǎn)菌株選育［D］. 無(wú)錫：江南大學(xué)， 2013.

［4］Wu ST， Yu ST， Lin LP. Effect of culture conditions on docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp. S31［J］. Process Biochemistry， 2005， 40（9）：3103-3108.

［5］常桂芳. 氧對(duì)裂壺藻利用甘油產(chǎn)DHA影響機(jī)制及其高密度發(fā)酵控制策略的研究［D］. 無(wú)錫：江南大學(xué)， 2013.

［6］陳寧， 王艷萍， 王一芃， 張克旭. 利用淀粉直接發(fā)酵生產(chǎn)肌苷菌株的構(gòu)建［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 1997（3）：184-189.

［7］劉虹， 程秀芳， 張志焱， 谷巍. 利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育高產(chǎn)蝦青素酵母菌株［J］. 中國(guó)飼料， 2013（11）：5-9.

［8］Manger-Jacob F， Muller T， Janssen M， et al. Isolation and sequencing of a new glucoamylase gene from an Aspergillus niger aggregate strain（DSM 823） molecularly classified as Aspergillus tubingensis［J］. Antonie Van Leeuwenhoek， 2005， 88（3-4）：267-275.

［9］Yokochi T， Honda D， Higashihara T， Nakahara T. Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 1998， 49（1）：72-76.

［10］Cheng R， Ma R， Li K， et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of marine microalgae Schizochytrium［J］. Microbiol Res， 2012， 167（3）：179-186.

［11］ 何忠寶. 原生質(zhì)體融合構(gòu)建葡萄酒降酸酵母的研究［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2004.

［12］ 姚婷婷， 王正祥. 黑曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化條件［J］. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2006（4）：116-120.

［13］駱健美， 李建姝， 王艷婷， 王敏. 褐黃孢鏈霉菌雙親滅活原生質(zhì)體融合的研究［J］. 現(xiàn)代化工， 2008（S2）：349-351， 353.

［14］王春麗， 武改紅， 陳暢， 陳樹(shù)林. 黑曲霉原生質(zhì)體誘變選育β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2009， 12：1921-1926.

［15］王歲樓， 王海翔， 楊志萍， 等. 酵母原生質(zhì)體制備、融合及高產(chǎn)β-胡蘿卜素融合子的篩選［J］. 食品科學(xué)， 2013（9）：99-103.

［16］何小妮， 蔣波， 王玉海， 等. 非對(duì)稱(chēng)滅活雙親原生質(zhì)體融合法選育產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉新菌株的研究［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2013（5）：993-997.

［17］ 林義， 鐘添華， 駱祝華， 等. 尼羅紅染色法篩選產(chǎn)油酵母及定量檢測(cè)胞內(nèi)油脂含量的研究［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2012（1）：125-137.

［18］ 呂雪梅， 楊關(guān)福， 張細(xì)權(quán). RAPD分析中遺傳距離計(jì)算方法的比較［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1997（S1）：93-100.

［19］ 王福榮. 生物工程分析與檢驗(yàn)［M］. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2010：141-142.

［20］ 徐新麗. 原生質(zhì)體融合技術(shù)選育纖維素發(fā)酵產(chǎn)油菌株［J］.武夷學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011（2）：27-31.

［21］ 張淑君. 原生質(zhì)體融合構(gòu)建纖維素發(fā)酵產(chǎn)油脂菌株的研究［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

（責(zé)任編輯 李楠）

Screening a New Type of Schizochxtrium Strain Producing DHA Using Starch by Protoplast Fusion Technology

Wang Di1Lu Fuping1Wang Haijun1Li Demao2Chen Shulin2Zhang Ke2
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Schizochxtrium B4D1 and Aspergillus niger CGMCC 3.316 as original strains， a new strain of Schizochxtrium was selected using starch for producing DHA. The protoplasts from two parents strains were obtained respectively with Lysing enzyme. The study was investigated on the effect of culture time， culture method， enzymolysis time on the protoplasts preparation. Finally， the protoplasts fusion was done under the PEG mediated condition. The optimum condition of protoplast fusion was as follows：PEG6000 concentration of 40%， fusion temperature of 30℃， fusion time of 10 min. Furthermore， the fusion rate reached 1.9% at the optimum condition. Through comparing its colony characteristics， color， morphology and purified spore culture， a new strain has been selected using starch as carbon source. RAPD verification showed that the fusant having integrated genome of B4D1 and CGMCC 3.316 expressed more genetic information from B4D1.

Schizochytrium；DHA；protoplast；fusion；starch

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.012

2014-07-28

國(guó)家“863”計(jì)劃（2014AA021701），國(guó)際合作重點(diǎn)項(xiàng)目（2014DFA61040）

王迪，女，碩士研究生，研究方向：輕工技術(shù)與工程（發(fā)酵）；E-mail：wangdi0808@hotmail.com

李德茂，男，博士，副研究員，研究方向：工業(yè)生物系統(tǒng)工程；E-mail：li_dm@tib.cas.cn