滕　娜　李　會(huì)　秦培娟　曹　璽　帥訓(xùn)軍　姜　敏　艾登斌山東省青島市市立醫(yī)院麻醉手術(shù)科，山東青島266011

吸入氫氣對(duì)膿毒血癥大鼠急性肺損傷的影響

滕娜李會(huì)秦培娟曹璽帥訓(xùn)軍姜敏艾登斌▲
山東省青島市市立醫(yī)院麻醉手術(shù)科，山東青島266011

目的探討吸入氫氣（H2）對(duì)膿毒血癥大鼠急性肺損傷的影響。方法選取雄性SD大鼠40只，體重200～250 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組（n=10）：假手術(shù)組（SH組）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）、1%H2組和2% H2組。采用CLP法制備膿毒血癥模型。1%H2組與2%H2組于CLP術(shù)后12 h分別吸入1%H2與2%H22 h。結(jié)束后，采集股動(dòng)脈血樣行血?dú)夥治?，?jì)算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）；測(cè)定血漿中高遷移率族蛋白1（HMGB1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平；隨后處死大鼠取肺組織，檢測(cè)肺組織中Toll樣受體4（TLR-4）、核因子-кB（NF-κB）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性；光鏡下觀察肺組織病理改變。結(jié)果與SH組比較，CLP組、1%H2組、2%H2組PaO2/FiO2降低，血漿中HMGB1、IL-6水平升高，肺組織TLR-4、NF-κB、MPO水平升高，病理學(xué)損傷明顯加重（P＜0.05）。與CLP組比較，1%H2組、2%H2組PaO2/FiO2升高，血漿中HMGB1、IL-6水平降低，肺組織TLR-4、NF-κB、MPO水平降低，病理學(xué)損傷也減輕（P＜0.05），1%H2組和2%H2組上述各指標(biāo)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論吸入H2能夠減輕膿毒血癥引起的急性肺損傷，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

氫氣；膿毒血癥；大鼠；肺損傷

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以急性肺部炎癥及肺泡毛細(xì)血管屏障功能損傷為主要特征的危及生命的臨床綜合征。膿毒血癥是引起ALI最主要原因之一［1-2］，目前尚沒(méi)有有效的藥物治療措施。研究表明，氫氣（H2）或含有H2的溶液具有選擇性抗氧化、抗炎癥等臟器保護(hù)作用［3-6］。本研究探討吸入H2對(duì)大鼠膿毒血癥肺損傷的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠［購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，批號(hào)為SCXK（蘇）2011-0003］40只，SPF級(jí)，體重200～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組（n= 10）：假手術(shù)組（SH組）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）、1%H2組和2%H2組。

1.2動(dòng)物模型制作

參照文獻(xiàn)［7］的方法建立CLP模型，沿大鼠腹正中線做一長(zhǎng)為1 cm的切口，游離腸系膜和盲腸，用4-0絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，用18號(hào)針頭貫通穿刺盲腸結(jié)扎端，擠出少許糞便，后將盲腸還納至腹腔，逐層縫合腹壁切口。SH組僅剖腹，分離盲腸遠(yuǎn)端，逐層關(guān)腹。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)［8］使用M177021H2發(fā)生器（北京中西遠(yuǎn)大公司）提供H2，其純度為99.999%。將大鼠放入帶有進(jìn)氣口和出氣口的密封箱子內(nèi)，將H2和空氣混合后從進(jìn)氣口輸入箱內(nèi)，殘余氣體從出氣口收集。用泵吸式JSA8-H2高敏氫氣檢測(cè)儀（深圳吉順安科技有限公司）通過(guò)通氣管路調(diào)定吸入H2濃度。1%H2組和2%H2組于CLP術(shù)后12 h時(shí)分別吸入1%的H2和2%的H22 h，SH組與CLP組只放置于箱子內(nèi)，不吸入H2。

1.4取材及處理方法

吸H22 h后，四組分別采集動(dòng)脈血樣3 mL，1 mL用于進(jìn)行血?dú)夥治?，采用i-STAT300型血?dú)夥治鰞x（Abbott公司，美國(guó)），計(jì)算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）；另外2 mL，于4℃3000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血漿中高遷移率族蛋白1（HMGB1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量。隨后處死大鼠，取左肺組織勻漿，4℃10 000 r/min離心15 min，離心后取上清液，采用ELISA測(cè)定肺組織中Toll樣受體4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB）含量（試劑盒購(gòu)自于美國(guó)R&D公司）及髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性（試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司）。嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。取右肺組織，置于10%福爾馬林中固定、石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理改變情況并參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行病理學(xué)損傷評(píng)分，1分：肺組織結(jié)構(gòu)正常；2分：肺間質(zhì)輕度充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；3分：肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，血管周圍水腫形成，中度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；4分：肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野進(jìn)行評(píng)分，取其平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1四組大鼠PaO2/FiO2及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較

與SH組比較，CLP組、1%H2組、2%H2組PaO2/ FiO2降低，病理學(xué)損傷明顯加重（P＜0.05）。與CLP組比較，1%H2組、2%H2組PaO2/FiO2升高，病理學(xué)損傷明顯減輕（P＜0.05）。1%H2組和2%H2組組間上述各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1　四組大鼠PaO2/FiO2及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s，n=10）

表1　四組大鼠PaO2/FiO2及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s，n=10）

注：與SH組比較，*P＜0.05；與CLP組比較，#P＜0.05；PaO2/FiO2：氧合指數(shù)；1 mmHg=0.133 kPa

組別PaO2/FiO2（mmHg）肺組織病理學(xué)評(píng)分（分）SH組CLP組1%H2組2%H2組490±24 179±42*402±28*#420±29*#1.05±0.14 3.67±0.50*2.58±0.43*#2.36±0.30*#

2.2四組大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)比較

與SH組比較，CLP組、1%H2組、2%H2組肺組織TLR-4、NF-κB、MPO活性明顯升高，血漿中HMGB1、IL-6水平增高（P＜0.05）。與CLP組比較，1%H2組、2%H2組肺組織TLR-4、NF-κB、MPO活性降低，血漿中HMGB1、IL-6水平降低（P＜0.05），1%H2組和2%H2組組間上述各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2　四組大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)比較（±s，n=10）

表2　四組大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)比較（±s，n=10）

注：與SH組比較，*P＜0.05；與CLP組比較，#P＜0.05；MPO：髓過(guò)氧化物酶；HMGB1：高遷移率族蛋白1；TLR-4：Toll樣受體4；NF-κB：核因子κB

組別MPO（U/g）HMGB1（pg/mL）TLR-4（pg/g）NF-κB（pg/mg）IL-6（pg/mL）SH組CLP組1%H2組2%H2組1.255±0.160 2.891±0.191*2.014±0.169*#1.934±0.161*#5.91±1.13 11.24±1.94*7.32±1.47*#7.08±1.28*#30±7 134±40*97±20*#91±18*#11.50±2.11 74.65±9.15*39.28±4.32*#34.26±4.17*#73.95±14.52 216.26±25.69*176.62±18.34*#172.00±17.66*#

3　討論

ALI是感染、休克及創(chuàng)傷等多種原因引起的嚴(yán)重的肺部病理性改變，進(jìn)一步可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。據(jù)資料顯示，ALI/ARDS是重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)患者死亡的主要原因之一［10］。目前只能采用支持治療，尚無(wú)根治性治療措施。目前的研究認(rèn)為膿毒血癥是導(dǎo)致ALI/ARDS的重要原因，而CLP是誘發(fā)膿毒血癥的經(jīng)典方法，已廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究［11-13］。本研究采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，術(shù)后10～12 h，大鼠開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)減少、豎毛、蜷縮、呼吸急促等；同時(shí)，研究結(jié)果表明，炎癥因子水平明顯增高，提示膿毒血癥模型制備成功；CLP后PaO2/FiO2降低，肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分升高，提示膿毒血癥誘發(fā)ALI的模型制備成功；而吸入H2后PaO2/FiO2升高，肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分降低，提示吸入H2可以減輕大鼠膿毒血癥誘發(fā)的ALI。

中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是引起ALI的重要原因之一［14-15］。肺組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活在一定程度上決定了ALI的程度，大量中性粒細(xì)胞黏附聚集于肺組織毛細(xì)血管內(nèi)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，可導(dǎo)致肺損傷；中性粒細(xì)胞活化后透過(guò)呼吸暴發(fā)及脫顆粒作用，加重肺組織損傷［16］。MPO作為中性粒細(xì)胞的特異性酶，其活性可反映中性粒細(xì)胞的聚集浸潤(rùn)程度［17］。本研究結(jié)果提示，與CLP組比較，吸入H2組MPO活性降低，表明H2通過(guò)抑制組織中的MPO浸潤(rùn)從而減輕炎性反應(yīng)。

TLR-4是誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的門戶蛋白，研究提示它在多種病理反應(yīng)中起重要作用［18-19］。CLP產(chǎn)生的內(nèi)毒素刺激機(jī)體釋放大量的HMGB1釋放入血［20］，HMGB1作為TLR-4的內(nèi)源性配體，可激活TLR-4信號(hào)通路，通過(guò)多種途徑使NF-кB活化，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子IL-6的釋放［21］。本研究結(jié)果表明CLP導(dǎo)致肺組織中的TLR-4、HMGB1、NF-кB的表達(dá)增加，血漿中的IL-6水平上升。吸入H2可以降低TLR-4、HMGB1、NF-кB及血漿中的IL-6水平。

H2無(wú)色無(wú)味，含量非常豐富。作為一種抗氧化物質(zhì)，H2具有準(zhǔn)備簡(jiǎn)單、無(wú)毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)大量的研究表明H2能夠改善各種因素導(dǎo)致的器官功能障礙［3-6］，因此H2治療有著非常廣泛的應(yīng)用前景；當(dāng)H2濃度大于4.6%時(shí)有爆燃的風(fēng)險(xiǎn)［8］，為安全起見(jiàn)，筆者只采用了低濃度的H2吸入作為治療手段，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，吸入H2能夠明顯減輕膿毒血癥引起的ALI，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

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Effect of hydrogen inhalation on acute lung injury in rats with sepsis

TENG NaLI HuiQIN PeijuanCAO XiSHUAI XunjunJIANG MinAI Dengbin▲
Department of Anesthesiology，Qingdao Municipal Hospital，Shandong Province，Qingdao266011，China

Objective To investigate the effect of hydrogen（H2）inhalation on acute lung injury in rats with sepsis. Methods Forty healthy male SD rats（weighing 200-250 g）were randomly divided into 4 groups（n=10）using a random number table:sham operation group（SH group），cecal ligation and puncture group（CLP group），1%H2group，2% H2group respectively.Sepsis model was produced by CLP.1%H2and 2%H2group received 2 h inhalation of 1%H2and 2%H2at 12 h after CLP，respectively.At the end of hydrogen inhalation，blood samples were obtained for blood gas analysis.PaO2/FiO2was calculated and the levels of high mobility group protein 1（HMGB1），interleukin-6（IL-6）were determined.The rats were then sacrificed and lungs were immediately removed for determination of the activity of Toll-like receptors-4（TLR-4），nuclear factor kappa B（NF-κB）and myeloperoxidase（MPO）；pathology assessment of lung was done under light microscope.Results Compared with SH group，PaO2/FiO2was significantly decreased，plasma levels of HMGB1，IL-6 increased，levels of TLR-4，NF-κB，MPO in lungs increased，and the pathological injury was significantly aggravated in CLP group，1%H2group and 2%H2group（P＜0.05）.Compared with CLP group，PaO2/FiO2increased significantly，levels of HMGB1，IL-6 in plasma decreased markedly，levels of TLR-4，NF-κB，MPO in lungs decreased，and the pathological injury was reduced in 1%H2group and 2%H2group（P＜0.05）.There were no significant differences of the above indexes between 1%H2group and 2%H2group（P＞0.05）.Conclusion Hydrogen inhalation can alleviate sepsis induced ALI in rats，and its mechanism may be related to inhibiting inflammatory response.

Hydrogen；Sepsis；Rat；Lung injury

R631

A

1673-7210（2015）09（a）-0008-03

2015-04-25本文編輯：張瑜杰）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81301665）。▲