周瑩 袁孟娟 韓軍 陳芳

（聊城大學(xué)藥學(xué)院，聊城252059）

丹參根腐病生防芽孢桿菌2-1海藻菌劑的研制

周瑩 袁孟娟 韓軍 陳芳

（聊城大學(xué)藥學(xué)院，聊城252059）

以海藻渣為載體，菌種為丹參根腐病生防菌：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis2-1（已保存CGMCC No.9256），研制成的海藻菌劑兼具營養(yǎng)及生物防治功能，同時(shí)菌劑的基本指標(biāo)符合農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)。用物理方法選擇菌種發(fā)酵液與海藻渣混合的最佳配比，結(jié)合農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品質(zhì)量檢測方法對菌劑中有效活菌數(shù)、含水量、pH值及有效期進(jìn)行測定，并進(jìn)行大田試驗(yàn)，測試生防效果。菌劑有效活菌數(shù)為2.32×109/g，含水量為6.75%，pH值為6.7，常溫下有效期約為11.6個(gè)月，均符合顆粒菌劑的技術(shù)指標(biāo)，大田試驗(yàn)中根腐病的發(fā)病率比空白對照組降低37.6%，生防效果較為顯著。

根腐病；生防菌；海藻菌劑；制備

非致病性枯草芽孢桿菌2-1是從本地感染根腐病的丹參根際土壤篩選分離得出，對丹參根腐病具有生物防治作用的一種生防菌，生防機(jī)制是該枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物對丹參根腐病病原菌——腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）［1，2］具有抑制作用［3-7］。根腐病作為一種嚴(yán)重的根莖類病害，對中藥材的品質(zhì)及產(chǎn)量都造成了很大的影響（圖1，圖2）。一直以來，人們對丹參根腐病的防治大都依賴化學(xué)藥劑及一些合理的耕作管理方法，但作為一種不易根治的土傳病害，根腐病一旦病發(fā)，就需施用大量藥物，一方面造成了環(huán)境污染，另一方面還影響了中藥材的出口貿(mào)易［8-10］。由此可見，生物農(nóng)藥的推廣是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。生物防治具有環(huán)保無污染的特點(diǎn)，因此將生防菌劑應(yīng)用到中藥材根腐病的防治中意義重大［11，12］。目前用于防治根腐病的生防菌劑在國內(nèi)外還較為少見，國內(nèi)登記的微生物農(nóng)藥主要用于小麥全蝕病、水稻和小麥紋枯病及果蔬枯萎病，其中有兩種生防菌劑用于防治根腐病，分別為“百抗”和“根腐消”，且都是用于三七根腐?。?3］，但針對丹參根腐病的生防菌劑還未見報(bào)道，故值得深入研究。海藻渣中含粗蛋白約20%，粗纖維約50%，灰分約3%，海藻渣中還含特有的有效活性成分，不僅使其成為優(yōu)良的有機(jī)肥，還可以作為生防菌的載體應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。本試驗(yàn)利用物理方法及生物方法制備出的海藻生防菌劑，兼具海藻營養(yǎng)及生物菌劑的活體調(diào)節(jié)功能，實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)植物生長，防治根腐病害的雙贏目的。

圖1 感染根腐病丹參根部（左）與正常丹參根部（右）

圖2 根腐病丹參根部縱剖圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基及LB液體培養(yǎng)基（配制方法略）。

1.1.2 菌種及海藻 實(shí)驗(yàn)室保存枯草芽孢桿菌2-1，無菌鮮海藻渣由青島明月海藻公司提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（BXM-30R）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：蘇州江東精密儀器有限公司（DGG-9070A）；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司（FE20）；快速水分測定儀：Metrohm Herisau S（885 Compact OvenSC）；漩渦混合器：IKA LAB DANCER（07.433333）；超凈工作臺：江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司（SW-CJ-2FD）；恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司（QYC-2102C）；生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司（SPX-150BSH-Ⅱ）；電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司（GB/T26497）；微波爐：廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司（G70D20CNIP-D2CSO）；1 mL、0.1 mL移液槍：德國，Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 接種發(fā)酵 在無菌操作條件下，用0.1 mL移液槍將保存在甘油管中的菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中。將接種完畢的三角瓶置于30℃恒溫箱中，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)18 h。

1.2.2 發(fā)酵液菌種單一性鑒定 在無菌條件下，取1 mL菌液進(jìn)行梯度稀釋，取10-8濃度的菌懸液0.1 mL，在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布。室溫下靜置5-10 min后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱，30℃過夜培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)是否一致，包括色澤、是否有褶皺、致密或者疏松、質(zhì)地、邊緣溝紋等。細(xì)菌鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［14，15］。隨機(jī)挑取幾個(gè)菌落制片，分別經(jīng)革蘭氏、芽孢染色，顯微鏡下觀察菌體大小及顏色是否一致。

1.2.3 鮮海藻渣水分測定 取適量鮮海藻渣，用卡式快速水分測定儀測定其水分含量。

1.2.4 海藻菌劑初成品制備 選含水30%的海藻渣作為制備初成品的載體，按1 mL發(fā)酵菌液分別對應(yīng)2 g，3 g，4 g，5 g含水30%海藻渣（后面簡稱1∶2，1∶3，1∶4，1∶5）的比例，計(jì)算出各比例需要的原鮮海藻渣，將菌液與海藻渣混合均勻，難以混合均勻時(shí)需加適量無菌水。放入25℃恒溫干燥箱中干燥至含水30%。

1.2.5 最佳配比的確定 用電子天平準(zhǔn)確稱取1.000 g初成品菌劑，放入9 mL無菌水中，充分溶解后作梯度稀釋。在無菌條件下，分別取10-6、10-7、10-8［16，17］濃度的菌懸液0.1 mL，在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布并標(biāo)記。室溫下靜置5-10 min后，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落成長情況，確定菌液與海藻渣的最佳配比。

1.2.6 含水量的測定 將初成品的海藻菌劑，置于室內(nèi)自然風(fēng)干2 d成顆粒成品，取適量測定其水分含量。

1.2.7 pH值的測定 將顆粒成品研過1.00 mm試驗(yàn)篩，稱取過篩樣品粉末15 g，放入50 mL的燒杯中，按1∶5的比例用去離子水溶解樣品，攪拌均勻。然后靜置30 min，測樣品上清液的pH值，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄，重復(fù)測試3次求平均值。

1.2.8 有效期的測定 取1 g菌劑于常溫（25℃）、50℃、70℃下的恒溫干燥箱中保存，然后間隔一定時(shí)間（0、8、24、36、60、84 h）后取樣。根據(jù)在50℃、70℃及常溫3個(gè)溫度下進(jìn)行加速試驗(yàn)所測得的活菌數(shù)，參照溫度加速法，對有效期進(jìn)行測定［18］。細(xì)菌死亡屬于熱力學(xué)一級速度過程［19］，在一定條件下符合下述方程：

其中N0為原始菌體數(shù)，Nt為t時(shí)殘存的菌體數(shù)，k為速度常數(shù)，用LogN對t作圖，即可得斜率，求出各溫度下的速度常數(shù)k值。

加速試驗(yàn)中的經(jīng)典恒溫法的理論依據(jù)是指數(shù)定律［20］，其對數(shù)形式為：

其中A為頻率因子，Ea為反應(yīng)活化能，T為絕對溫度，R為氣體常數(shù)。以Logk對1/T作圖得斜率-Ea/2.303 R，及Y軸截距LogA，即可得出活化能Ea，A值，帶回原式即可求得常溫下菌劑的貯存期。

1.2.9 大田試驗(yàn) 將制備好的海藻顆粒菌劑按20 g/m2在丹參生長過程中施用3次，并設(shè)置多菌靈藥液對照組及空白對照組［21］。統(tǒng)計(jì)各組發(fā)病率及丹參實(shí)際產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵液菌體單一性鑒定

觀察菌落，基本特征一致，均為枯草芽孢桿菌的特征：菌落呈圓形，表面粗糙不透明，污白色，中間褶皺，邊緣波紋狀，經(jīng)革蘭氏染色均呈陽性，芽孢染色可見呈現(xiàn)綠色的橢圓或柱狀的芽孢體。菌體顏色大小均一致。

2.2 海藻菌劑初成品制備

經(jīng)測定鮮海藻渣的含水量為87.3%，按4個(gè)比例做成的初成品如圖3、圖4所示。重復(fù)多次平行試驗(yàn)后，得出1∶4為最佳比例（圖5-圖8），即1 mL菌液對應(yīng)4 g含水30%的海藻渣時(shí)，有效活菌數(shù)≥2.32×109/g，符合農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)，（指標(biāo)要求：顆粒制劑有效活菌數(shù)需≥1× 108/g，見附錄）。

圖3 菌液與海藻渣混勻

圖4 干燥至含水30%的初成品

圖5 1∶2比例菌落生長情況

圖6 1∶3比例菌落生長情況

圖7 1∶4比例菌落生長情況

圖8 1∶5比例菌落生長情況

2.3 含水量測定

經(jīng)卡氏快速水分測定儀對靜置干燥后的成品含水量進(jìn)行測試，測得含水量為6.75%，符合農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)，（指標(biāo)要求：顆粒制劑水分含量需≤20%，見附錄）。

2.4 pH值測定

用pH計(jì)測得pH平均值為6.7，符合農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)，（指標(biāo)要求：顆粒制劑pH值范圍為5.5-8.5，見附錄）。

2.5 有效期測定

分別在常溫（25℃），50℃，70℃三個(gè)溫度下，不同時(shí)間點(diǎn)取樣品對其中有效生防菌數(shù)量進(jìn)行測定（表1-表3），并繪制各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)的自然對數(shù)Log（N，%）對時(shí)間（t）圖（圖9-圖11），分別得到各個(gè)溫度時(shí)的一元線性回歸方程，K值及LogK值（表4）。

表1 25℃加速試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)樣品的測定結(jié)果

表2 50℃加速試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)樣品的測定結(jié)果

表3 70℃加速試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)樣品的測定結(jié)果

圖9 25℃ Log（N，%）/t線性回歸圖

圖10 50℃ Log（N，%）/t線性回歸圖

圖11 70℃ Log（N，%）/t線性回歸圖

表4 生防芽孢桿菌在不同溫度條件下的回歸方程

再對Logk對1/T做線性回歸圖（圖12），運(yùn)用Arrhenius方程計(jì)算得出Ea值為4 318.85，A值為730.5，并計(jì)算出海藻菌劑的有效期為8 384 h約為11.6個(gè)月，符合農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)，（指標(biāo)要求：顆粒制劑保質(zhì)期需≥6個(gè)月，見附錄）。

圖12 Logk對1/T的線性回歸圖

2.6 大田試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，施用海藻菌劑的丹參長勢明顯好于多菌靈組及空白組，根腐病發(fā)病率比空白組降低約37.6%，與多菌靈效果相當(dāng)，但施用海藻菌劑的丹參實(shí)際產(chǎn)量要明顯高于多菌靈組及空白組，分別高出11%，18.4%，說明海藻顆粒菌劑的生防及營養(yǎng)效果均較好。

3 討論

枯草芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)，易于定殖，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性［22-24］。目前國內(nèi)外已有將其成功用于植物病害防治的報(bào)道。在我國，已登記的防治土傳病害的微生物農(nóng)藥有14種，其中以枯草芽孢桿菌為生防菌的有6種，主要用于水稻和小麥紋枯病的防治［25］，近幾年已迅速推廣應(yīng)用到番茄青枯病、棉花黃萎病、辣椒枯萎病、西瓜枯萎病、煙草黑脛病、水稻稻瘟病及甘藍(lán)黑腐病等各種作物或果蔬的嚴(yán)重病害［26］。國外應(yīng)用枯草芽孢桿菌防治植物病害較成功的實(shí)例有美國Agraquest公司用QST713菌株和QST2808菌株分別開發(fā)出活菌殺菌劑SerenadeTM和Sonata AS，并于2000年登記，用于防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃等多種作物的白粉病、霜霉病、疫病及灰霉病等［27］。其他國家也有用于防治馬鈴薯、玉米、蔬菜類和觀賞植物的真菌病害的枯草芽孢桿菌菌劑［28］。可見，枯草芽孢桿菌用于生物防治已深受認(rèn)可。大多數(shù)的生物菌劑為粉劑或液體，顆粒菌劑較少，海藻作為一種優(yōu)良的菌劑載體，近幾年愈發(fā)受到關(guān)注，本試驗(yàn)將根腐病生防枯草芽孢桿菌吸附于海藻渣后制備顆粒菌劑，并對初成品的物理及生物指標(biāo)進(jìn)行了測定，效果良好，推動(dòng)了丹參根腐病害的生物防治研究。

4 結(jié)論

經(jīng)初步測定，海藻生防菌劑的水分含量，pH值，有效期等均符合農(nóng)用顆粒微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)，說明海藻渣作為菌劑載體的效果是較好的。且在大田試驗(yàn)中，海藻顆粒菌劑的生防效果與多菌靈效果相當(dāng)，營養(yǎng)助長效果明顯。目前已有一些企業(yè)在探索海藻菌肥的研發(fā)并運(yùn)營至市場，作為一種將營養(yǎng)與生物防治于一體的復(fù)合菌劑，海藻菌劑有著廣大的應(yīng)用前景，值得深入研究。

附錄：農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)（中華人名共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 20278-2006，2006年9月1日起實(shí)施）

［1］徐同， 鐘靜萍， 李德葆.木霉對土傳病原真菌的拮抗作用［J］.植物病理學(xué)報(bào)， 1993， 23（1）：36-37.

［2］Kerr A， Biggs J， Ophel K.Biological control of crown gall［A］.Proc Int Symp on Biological Control of Plant Diseases［C］.1994.11-26.

［3］劉雪， 穆常青， 蔣細(xì)良， 等.枯草芽孢桿菌代謝物質(zhì)的研究進(jìn)展及其在植病生防中的應(yīng)用［J］.中國生物防治學(xué)報(bào)， 2006， 22（增刊）：179-184.

［4］程洪斌， 劉曉橋， 陳紅漫.枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進(jìn)展［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2006， 22（1）：109-112.

［5］任爭光， 劉媛， 劉素花， 等.芽孢桿菌BJ-6的抗菌物質(zhì)及其抑菌作用［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2006， 21（3）：49-52.

［6］ 張彥杰， 羅俊彩， 武燕萍， 楊合同.生防枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)儀器， 2009， 7（4）：19-23.

［7］ 別小妹， 陸兆新.影響枯草芽孢桿菌fmbR菌株抗菌物質(zhì)提取的主要因子［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 28（4）：26-29.

［8］ 李瓊芳， 曾華蘭， 葉鵬盛， 等.哈茨木霉（Trichoerma harzianum）T23生防菌篩選及防治中藥材根腐病的研究［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2007， 29（11）：119-122.

［9］ Harling R， Sutton M. Spear rot of Calabrese fact sheet 13/02，Horticultural Development Council. East Malling， Kent， UK. 2002.

［10］ Darling D. Bacterial head rot of broccoli：Pathogenicity and host susceptibility［D］. Scolland， UK：1998.

［11］王進(jìn)強(qiáng)， 吳剛， 許文耀.植物病害生防制劑的研究進(jìn)展［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2004， 33（4）：448-452.

［12］劉士旺， 郭澤建.生防制劑與誘導(dǎo)植物抗病性［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2005， 33（8）：209-214.

［13］陳昱君， 王勇， 劉蕓芝， 等.生物菌劑控制三七根腐病的初步研究［J］.中國中藥雜志， 2004， 29（11）：1102-1103.

［14］ 東秀珠， 蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社：2001：267-388.

［15］ 中國科學(xué)院微生物所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法［M］.北京：科學(xué)出版社， 1978.

［16］ 戚薇， 陳瑩， 王建玲， 等.高濃度凝結(jié)芽孢桿菌粉劑的研究及特性研究［J］.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2003， 2（18）：1-4.

［17］ Glick BR， Jacobson CB， SchwarzeMMK.1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase mutants of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation［J］.Canadian Journal of Microbiology，1994， 40（11）：911-915.

［18］ 李凡， 徐建軍， 倪海峰， 等.運(yùn)用經(jīng)典恒溫加速實(shí)驗(yàn)法推斷維生素C注射液的貯存期［J］.寧夏石油化工， 2001， 6（3）：23-24.

［19］ 杜連祥.工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社， 1992， 3：273.

［20］ 張傳志， 鞏傳國， 趙吉兵， 等.維生素C注射液有效期的測定［J］.齊魯藥事， 2004， 8（23）：26-27.

［21］ 葉鵬盛， 曾華蘭， 江懷仲， 李瓊芳.丹參根腐病及其微生物防治研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)， 2003， 5（2）：63-66.

［22］ Cazorla FM， Romero D. Isolation and characterization of antagonistic Bacillus subtilis strains from the avocado rhizoplane displaying biocontrol activity［J］.J Appl Microbiol， 2007， 103：1950.

［23］ 李麗梅， 高丙利， 柳東， 等.抗黃瓜灰霉病的枯草芽孢桿菌篩選及其抑菌活性的初步研究［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012，27（3）：14.

［24］ Luo Y， Sun L， Zhu Z， et al. Identification and characterization of an anti-fungi Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium protease from the Bacillus subtilis strain N7［J］.J Microbiol， 2013， 51（3）：359.

［25］ 黃海嬋， 裘娟萍.枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005（3）：213-215.

［26］ Kloepper JW， Ryu CM， Zhang S. Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp［J］.Phytopathology，2004， 94（11）：1259-1266.

［27］ Turner JT， Backman PA. Factors relating to peanut yield increases after seed treatment with Bacillus subtilis［J］. Plant Disease，1991， 75（4）：347-353.

［28］ Kilian U， Steiner B， Krebs B， et al. FZB24（r）Bacillus subtilis mode of action of a microbial agent enhancing plant vitality［J］. Pflanzenschutz Nachrichten Bayer， 2000， 53（1）：72-93.

（責(zé)任編輯 李楠）

Preparation of Algae Agents for S. miltiorrhiza Bunge Root Rot Biocontrol Bacillus subtilis2-1

Zhou Ying Yuan Mengjuan Han Jun Chen Fang
（School of Pharmaceutical，Liaocheng University，Liaocheng 252059）

With algae residue as carrier， S. miltiorrhiza bunge root rot biocontrol agents： Bacillus subtilis2-1（CGMCC No.9256），were developed into algae agents， which features both nutritional and cell biological control function， also in line with the basic indicators of agricultural products， technical indicators microbial agents. Then appropriate ratio of seaweed broth and residue was chosen by physical means. Besides， the number of viable cells， moisture content， pH value and expiration date were measured by agricultural product quality testing methods， and field experiments was conducted to test biocontrol effect. Results showed that number of effective viable agents was 2.32×109/ g， moisture content was 6.75%， pH value was 6.7， and the expiration date was about 11.6 months ， all of which were in line with the technical specifications of the particles. The incidence of root rot in field trials rate decreased 37.6% compared with the blank control group， the effect of biocontrol was obvious.

root rot；biocontrol；algae agents；preparation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.025

2014-09-28

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013CQ019），聊城大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（3010）

周瑩，女，碩士研究生，研究方向：生物制藥，E-mail：hebe11183@yeah.net

陳芳，女，博士，副教授，研究方向：微生物制藥，E-mail：chenfang20045@163.com