李楊 蔡海鶯 趙敏潔 張輝 馮鳳琴

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 馥莉食品研究院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，杭州 310058）

高產(chǎn)耐高溫脂肪酶生產(chǎn)菌的篩選與鑒定

李楊 蔡海鶯 趙敏潔 張輝 馮鳳琴

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 馥莉食品研究院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，杭州 310058）

從小籠包蒸屜墊中篩選得到了兩株脂肪酶高產(chǎn)菌株J2和J3，經(jīng)形態(tài)觀察以及26S rRNA基因（26S rDNA）序列比對(duì)鑒定，兩株菌分別屬于Aureobasidium 屬的兩個(gè)變體。200 r/min、30℃下?lián)u瓶發(fā)酵3-5 d后，以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）作為底物，用分光光度法測(cè)得J2和J3發(fā)酵上清液中的脂肪酶酶活分別為10.61 U/mL和14.43 U/mL。對(duì)兩株菌所產(chǎn)脂肪酶的耐熱特性研究顯示，菌株J2產(chǎn)脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，并且酶液在50℃保溫5 h無(wú)酶活損失；另一株菌J3所產(chǎn)脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，酶液在50℃保溫5 h后酶活剩余42.19%，在40℃保溫5 h沒(méi)有酶活損失。這表明J2和J3菌株所產(chǎn)脂肪酶具有較好的熱穩(wěn)定性和較高的最適反應(yīng)溫度。

脂肪酶；熱穩(wěn)定性；出芽短梗霉；26S rDNA；生長(zhǎng)曲線

脂肪酶（Triacylglycerol acylhydrolases，EC 3.1.1. 3）是能在油水界面上水解甘油三酯的一類酶的總稱，主要來(lái)源于動(dòng)物、植物和微生物。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，因而在食品、化妝品、皮革、生物柴油等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用前景［1-3］。目前，脂肪酶的生產(chǎn)方法主要包括提取法和微生物發(fā)酵法，其中，微生物發(fā)酵法以其較高的得率、較低的成本以及來(lái)源廣泛的菌種資源而成為脂肪酶生產(chǎn)的首選方法［4］。

許多利用脂肪酶的工業(yè)催化過(guò)程都要求較高的反應(yīng)溫度，如紙漿脫脂脫墨、皮毛脫脂、母乳脂肪替代品1，3-油酸-2-棕櫚酸三?；视停∣PO）的生產(chǎn)等，因此對(duì)脂肪酶的熱穩(wěn)定性以及最適溫度提出更加苛刻的要求［5-7］。研究表明，極端環(huán)境中分離到的微生物，表達(dá)的酶往往具有更好的環(huán)境耐受性，從高溫環(huán)境中篩選得到的嗜熱微生物，能夠產(chǎn)生在高溫下有活性且熱穩(wěn)定性好的脂肪酶［8］。因此，從溫度較高的環(huán)境中篩選耐高溫的脂肪酶是一個(gè)有效的途徑。小籠包蒸屜長(zhǎng)期被食用油浸染，是富集產(chǎn)脂肪酶微生物的天然溫床；另外，蒸屜所處的高溫高濕環(huán)境，對(duì)嗜熱微生物進(jìn)行了有效篩選；而且蒸屜為中國(guó)常用烹飪器具，在其中篩選的微生物在食品安全性上相較于其他環(huán)境中篩選到的微生物更高?；诖耍狙芯繌男』\包蒸屜中的墊布分離嗜熱微生物，通過(guò)產(chǎn)脂肪酶活力測(cè)定，篩選得到耐高溫脂肪酶生產(chǎn)菌，對(duì)其進(jìn)行26S rDNA序列鑒定，并驗(yàn)證脂肪酶的耐高溫特性，旨在為下一步研究脂肪酶的生產(chǎn)、發(fā)酵優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采樣于杭州某高校食堂小籠包蒸屜墊。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 （1）羅丹明B平板：7 mL橄欖油與 21 mL 2% 聚乙烯醇（PVA）在均質(zhì)機(jī)中乳化10 min；11.5 g PDA（杭州微生物試劑有限公司）溶于250 mL蒸餾水中；上述兩部分分別在121℃下高壓滅菌20 min；等到降溫至50℃時(shí)，將橄欖油乳化液和PDA培養(yǎng)基混合后，加3 mL過(guò)濾除菌的0.1%羅丹明B。每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15-20 mL，凝固后備用。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基（W/V）：酵母提取物1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖1%，麥芽糖1%，吐溫80 0.07%，橄欖油4%。（3）酶活測(cè)定試劑：溶液A：30 mg 對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）溶于10 mL異丙醇中，4℃保存。溶液B：90 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中加入0.099 mg 阿拉伯膠，混勻溶解，4℃保存。溶液A與溶液B以1∶10的比例混勻后作為底物溶液使用。（4）基因組DNA快速抽提試劑盒（酵母），上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)ZHJHC1112B，恒溫恒濕箱ZWP-A2130，恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-21C，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-30KB，上海中安醫(yī)療器械廠；ZF-20D暗箱式紫外分析儀，上海顧村電光儀器廠；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Powerpac Basic電泳儀，ALS-1296 PCR儀，BioRad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；5417R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；PB-10型pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；ChamGel 5000凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩 剪取5 g小籠包蒸籠屜中的墊布加入到45 mL 0.85%的滅菌生理鹽水中，振蕩制成懸液，進(jìn)行系列梯度稀釋，稀釋后取10-4、10-5和10-6三個(gè)梯度涂布于羅丹明B培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做3個(gè)平行。將涂布后的平板放入30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 d后，將平板置于365 nm的紫外燈下觀察。

1.2.2 菌種分離純化 將紫外燈下熒光較強(qiáng)的菌株再次在羅丹明B平板上劃線分離，每個(gè)菌株做3個(gè)平行，30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 d后，將平板置于365 nm紫外燈下觀察。連續(xù)劃線3-5次。

1.2.3 菌種復(fù)篩 挑取熒光較強(qiáng)的菌株的單菌落加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)3-5 d。取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL的離心管中10 000 r/min離心5 min，取上清作為粗酶液并測(cè)定酶活。

1.2.4 脂肪酶酶活測(cè)定 脂肪酶酶活測(cè)定以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）作為底物，根據(jù)Winkler等［9］的方法稍作改動(dòng)。1.5 mL離心管中加入600 μL底物溶液，并加入適當(dāng)稀釋后的粗酶液25 μL，對(duì)照組加入25 μL pH7.0 Tris-HCl緩沖液，40℃下保溫15 min后，加入500 μL 95%乙醇溶液終止反應(yīng)。在410 nm下測(cè)定吸光值，以1 min內(nèi)催化水解底物對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚（pNP）所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.5 菌株產(chǎn)酶曲線和生長(zhǎng)曲線的繪制 挑取產(chǎn)酶活性較高的單菌落加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h作為種子液。按1.5%的接種量取種子液接種于15 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中（50 mL的錐形瓶），在30℃、200 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)期間于24、48、60、72、84、96、120、144、156和168 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的酶活和菌體生物量。菌體生物量選用干重法，根據(jù)Najjar等［10］方法稍作修改。取0.5 mL發(fā)酵液于已稱重的1.5 mL離心管中，室溫下，10 000 r/min離心5 min，收集菌體，用0.5 mL 0.85%的NaCl溶液洗滌2次，90℃下，過(guò)夜干燥，待冷卻至室溫后，稱重得菌體重量。

1.2.6 DNA提取與PCR擴(kuò)增 根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書提取兩株菌的基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3'，NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR的擴(kuò)增體系為：10×buffer（Mg2+）5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4.0 μL，正、反向引物各3 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模板2 μL，用無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊至50 μL。 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海睿迪生物科技有限公司測(cè)序。登錄NCBI（http//：www.ncbi.nlm.nih.gov），將測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定菌屬。用軟件MEGA6進(jìn)行序列分析，并采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.8 粗酶液的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 將25 μL粗酶液與600 μL底物溶液混勻后，分別置于30、40、50、60和70℃中反應(yīng)15 min，測(cè)定酶活以確定最適反應(yīng)溫度。將粗酶液置于30、40、50、60和70℃中保溫1 h，取25 μL測(cè)脂肪酶活力，選取穩(wěn)定性較好的溫度進(jìn)行1、2、3、4和5 h保溫處理，并測(cè)定脂肪酶活力，以未處理的粗酶液作為對(duì)照（100%）。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)胞外酶菌株的篩選

經(jīng)過(guò)羅丹明B平板初篩和劃線分離得到了4株產(chǎn)脂肪酶的菌株，將這4株菌接入復(fù)篩的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)6 d，分別于72、84、96、118、120和144 h取樣測(cè)定發(fā)酵液酶活。結(jié)果（表1）顯示，4株菌初篩酶活（羅丹明B平板上的熒光強(qiáng)度）相差較小，但是發(fā)酵上清液中的酶活差距很大。菌株2（J2）和3（J3）上清液中的脂肪酶活分別為10.61 U/mL和14.43 U/mL，明顯高于菌株1（J1）和4（J4），可能是J1和J4偏向于產(chǎn)生胞內(nèi)脂肪酶，導(dǎo)致上清液中的酶活較低。根據(jù)發(fā)酵上清液酶活，選擇J2和J3作為目標(biāo)菌株進(jìn)行研究。

表1 菌株脂肪酶活篩選

圖1顯示，J2在PDA平板上產(chǎn)生光滑、乳白色、有時(shí)微綠色的酵母樣菌落，到培養(yǎng)后期菌落會(huì)變黑并且會(huì)環(huán)繞一層孢子（圖1-A）。J3菌落最初呈淡白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色、黑色，菌落邊緣成明顯的根狀（圖1-B）。

圖1 J2（A）和J3（B）在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2 26S rDNA 測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

提取J2和J3的基因組DNA，并以其為模板，對(duì)26S rDNA的D1/D2可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)兩條擴(kuò)增條帶長(zhǎng)均約600 bp（圖2）。送上海睿迪生物科技有限公司測(cè)序后，得到的J2和J3長(zhǎng)度均為576 bp，將結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用軟件MEGA6進(jìn)行序列分析，并采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果（圖3）顯示，J2和J3與Aureobasidium屬的菌株有很近的親緣關(guān)系，可以確定這兩株菌均屬于Aureobasidium屬，且J2和J3不處于同一分支，表明它們是不同的兩株菌。

圖2 菌株J2和J3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 菌株J2和J3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株J2、J3產(chǎn)酶曲線和生長(zhǎng)曲線

為進(jìn)一步研究菌株J2、J3生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的關(guān)系，在搖瓶發(fā)酵的不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、60、72、84、96、120、144、156和168 h）取樣，測(cè)定發(fā)酵上清液的酶活和菌體的干重。結(jié)果（圖4）顯示，菌株J2于24 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，產(chǎn)酶量迅速增加并于60 h達(dá)到8.85 U/mL，隨后產(chǎn)酶量增加速度變緩，84 h后J2進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)酶量緩慢增加并于96 h達(dá)到峰值10.61 U/mL，隨后產(chǎn)酶量下降（圖4-A）。菌株J3在24-72 h處于對(duì)數(shù)期，產(chǎn)酶量穩(wěn)定在2 U/mL，但當(dāng)J3進(jìn)入穩(wěn)定期（84 h）后，產(chǎn)酶量以一定的斜率成直線上升，在144 h酶活達(dá)到14.43 U/mL，隨后酶活略有增加，但基本穩(wěn)定在15 U/mL左右（圖4-B）。上述結(jié)果表明，J3在對(duì)數(shù)期時(shí)，以增加生物量為主，產(chǎn)酶量略有增加；但進(jìn)入穩(wěn)定期后，以增加產(chǎn)酶量為主，生物量呈緩慢增加趨勢(shì)。從整個(gè)發(fā)酵周期來(lái)看，J2和J3發(fā)酵液狀態(tài)有明顯的不同：J2發(fā)酵液是淡黃色的，略帶一點(diǎn)淡紅色，發(fā)酵液比較?。籎3發(fā)酵液到了發(fā)酵后期（5 d左右），呈淡綠色甚至偏黑色，并且發(fā)酵液比較黏稠，不易流動(dòng)。顯微鏡觀察顯示，J2發(fā)酵液4 d時(shí)，細(xì)胞主要以酵母形態(tài)存在，而J3發(fā)酵液6 d時(shí)出現(xiàn)較多的菌絲。

圖4 菌株J2（A）和J3（B）產(chǎn)酶曲線和生長(zhǎng)曲線

2.4 粗酶液的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定

2.4.1 粗酶液的最適反應(yīng)溫度 J2和J3的脂肪酶Lip2、Lip3分別在30、40、50、60和70℃下反應(yīng)15 min后測(cè)定酶活，以最高酶活作為100%進(jìn)行換算得到相對(duì)酶活。結(jié)果（圖5）顯示，Lip2的最適反應(yīng)溫度為50℃，但是40℃時(shí)，酶活也相對(duì)較高，是最高酶活的94.11%。Lip3的最適反應(yīng)溫度為60℃，相對(duì)于Lip2的最適反應(yīng)溫度高10℃，其在50℃的酶活是最高酶活的80%。

圖5 脂肪酶Lip2和Lip3在不同溫度下反應(yīng)的相對(duì)酶活

2.4.2 粗酶液的熱穩(wěn)定性 將脂肪酶Lip2和Lip3在30、40、50、60和70℃不同溫度下保溫1 h后，以初始酶液的酶活作為對(duì)照（100%），計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果（圖6）顯示，Lip2在30-50℃條件下維持較穩(wěn)定的酶活，相對(duì)酶活均在90%以上，但溫度達(dá)到60℃時(shí)，酶活顯著下降至20.84%。Lip3在30℃及40℃時(shí)的穩(wěn)定性高于初始酶液的穩(wěn)定性，相對(duì)酶活高于100%，50℃下的相對(duì)酶活86.46%，高于60℃酶活顯著下降。對(duì)于Lip2和Lip3來(lái)說(shuō)，在50℃保溫1 h能保持90%左右的酶活。隨后，將Lip2和Lip3在40℃或者50℃進(jìn)行1、2、3、4和5 h保溫處理，取樣在最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)測(cè)定酶活，以初始酶液的酶活作為對(duì)照（100%），計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果（圖7）顯示，Lip2在50℃下及Lip3在40℃下保溫處理至5 h，相對(duì)酶活均保持在100%；Lip3在50℃下保溫處理至5 h，相對(duì)酶活從保溫1 h的86.46%逐漸下降至43.11%。以上結(jié)果表明，Lip2在50℃下及Lip3在40℃下保溫5 h幾乎無(wú)酶活損失；但是Lip3在50℃酶活逐漸下降，即Lip3在50℃熱穩(wěn)定性較差。

圖6 脂肪酶Lip2和Lip3在不同溫度下保溫1 h后的相對(duì)酶活

圖7 脂肪酶Lip2和Lip3在40或50℃下保溫1-5 h后的相對(duì)酶活

3 討論

本研究從小籠包蒸屜中的墊布分離嗜熱微生物，得到了兩株產(chǎn)胞外脂肪酶活力較高的菌株J2和J3，上清液中的脂肪酶酶活分別為10.61 U/mL和14.43 U/mL。一般情況下，從環(huán)境中篩選得到的野生菌株的脂肪酶活力普遍偏低。李俊峰等［11］從土壤中篩選得到的6株菌種，只有一株菌酶活達(dá)到了4.01 U/mL，其他幾株菌脂肪酶酶活均在2.50 U/mL以下。經(jīng)26S rDNA鑒定，菌株J2和J3是屬于Aureobasidium屬的不同菌。發(fā)酵培養(yǎng)兩株菌得到的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線也存在較大差異，其中發(fā)酵液狀態(tài)有著明顯的不同：J2發(fā)酵液呈淡黃色略帶淡紅色、易于流動(dòng)，J3發(fā)酵液呈淡綠色甚至黑色、比較黏稠不易流動(dòng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與本研究中微生物26S rDNA同源性（相似性100%）最近的Aureobasidium pullulans生活周期中存在酵母狀、菌絲狀、厚垣孢子、腫脹孢子和芽孢子等多種形態(tài)，不同形態(tài)在細(xì)胞生長(zhǎng)和脂肪酶表達(dá)上差異可能較大［12-14］。J2和J3雖同屬Aureobasidium 屬，但不同變體在形態(tài)間的轉(zhuǎn)換上可能受培養(yǎng)條件的影響不同。顯微鏡觀察顯示，J2發(fā)酵液后期，細(xì)胞主要以酵母形態(tài)存在，而J3發(fā)酵液后期出現(xiàn)較多的菌絲。綜合鑒定結(jié)果、菌落形態(tài)和發(fā)酵生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)脂肪酶曲線，表明J2和J3菌株為同屬于Aureobasidium 屬的兩株產(chǎn)脂肪酶差異比較大的菌株。

本研究在對(duì)脂肪酶溫度性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酶Lip2和Lip3具有較好的耐熱特性。Lip2的最適反應(yīng)溫度為50℃，Lip3的最適反應(yīng)溫度為60℃，相對(duì)于Lip2的最適反應(yīng)溫度高10℃。柳志強(qiáng)等［15］分離的Aureobasidium pullulans HN2.3菌株產(chǎn)生的脂肪酶經(jīng)純化后得到的最適反應(yīng)溫度為35℃，比Lip2、Lip3的最適反應(yīng)溫度低了15-25℃。Goldbeck等［16］研究的野生酵母脂肪酶的最適反應(yīng)溫度一般集中在30-45℃，Mhetras等［17］確定了Aspergillus niger NCIM 1207脂肪酶的最適反應(yīng)溫度有50℃。本研究篩選獲得的Aureobasidium sp.屬的兩株菌具有較高最適反應(yīng)溫度。Lip2在50℃下及Lip3在40℃下保溫5 h幾乎無(wú)酶活損失。但是Lip3在50℃酶活逐漸下降，即Lip3在50℃熱穩(wěn)定性較差。Mhetras等［17］研究的Aspergillus niger NCIM 1207脂肪酶可以在40℃保溫3 h而無(wú)酶活損失，但是50℃保溫1 h就會(huì)損失52%的酶活。Mu?oz等［8］從活火山中篩選到了一株Geobacillus屬的嗜熱菌，它能產(chǎn)生4種脂肪酶，其中一種脂肪酶在70℃中保溫8 h后仍能保存有70%的酶活。J2和J3同樣也是從高溫環(huán)境中篩選得到，相對(duì)于一般的野生菌，分泌得到的脂肪酶的熱穩(wěn)定性較好。

Aureobasidium pullulans屬以生產(chǎn)普魯蘭多糖而備受關(guān)注，國(guó)內(nèi)外針對(duì)Aureobasidium pullulans脂肪酶的研究報(bào)道較少，僅有柳志強(qiáng)等［15，18］比較系統(tǒng)地研究了Aureobasidium pullulans HN2.3生產(chǎn)的脂肪酶，包括脂肪酶的分離純化、性質(zhì)以及脂肪酶基因的克隆、表達(dá)等。與現(xiàn)有報(bào)道相比，本研究從小籠包蒸屜墊中篩選得到的兩株Aureobasidium屬的菌，具有較高的產(chǎn)酶能力，且所產(chǎn)脂肪酶具有較好的耐熱特性。此外，本研究還構(gòu)建了菌株J2和J3的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線模型，為下一步研究脂肪酶的生產(chǎn)、發(fā)酵優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從杭州某高校食堂小籠包蒸屜墊中篩選得到了4株有脂肪酶活力的菌株，經(jīng)過(guò)胞外酶活（上清液酶活）測(cè)定，最終確定了兩株胞外脂肪酶活力較高的菌株。經(jīng)26S rDNA鑒定，兩株菌屬于Aureobasidium屬的不同菌。這兩株菌產(chǎn)酶活力較高，分別達(dá)到10.61 U/mL和14.43 U/mL，且所產(chǎn)脂肪酶具有較好的耐熱特性，脂肪酶Lip2最適反應(yīng)溫度為50℃，可以在50℃保溫5 h無(wú)酶活損失；脂肪酶Lip3有更高的最適反應(yīng)溫度60℃，但是熱穩(wěn)定性相對(duì)較差，僅可以在40℃穩(wěn)定，溫度高于50℃熱穩(wěn)定性顯著下降。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening and Identification of High-yield Thermostable Lipase Producing Microorganisms

Li Yang Cai Haiying Zhao Minjie Zhang Hui Feng Fengqin
（Zhejiang University，College of Biosystems Engineering and Food Science，F(xiàn)uli Institute of Food Science，Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing，Zhejiang R & D Center for Food Technology and Equipment，Hangzhou 310058）

Two strains of microorganisms（J2 and J3）with a high-yield lipase producing ability had been screened from dumplings’steamer cushions， and identified as two variants of Aureobasidium sp. according to morphological observation and 26S rRNA gene（26S rDNA）sequencing. After being incubated at 30℃， 200 r/min for 3-5 d， the lipase activities of their fermentation supernatant were 10.61 U/mL and 14.43 U/mL， respectively， measured by spectrophotometry with p-nitrophenol palmitate（p-NPP）as a substrate. The investigation of physicochemical properties of the produced lipases（Lip2 and Lip3）showed that the optimum catalyzing temperature of Lip2 is 50℃ and there is no significant activity loss after being incubated at 50℃ for 5 h， while the optimum catalyzing temperature of Lip3 is 60℃ and there is no activity loss after being incubated at 40℃ for 5 h， but only 42.19% of lipase activity remained when incubated at 50℃ for 5 h. The results indicated that the lipases produced by strain J2 and J3 have good thermal stability and high optimal reaction temperature.

lipase；thermostability；Aureobasidium sp.；26S rDNA；growth curve

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.022

2014-06-25

浙江省重大科技專項(xiàng)（2012C12005-2），浙江省植物食品加工技術(shù)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2010R50032）

李楊，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵；E-mail：yangyangbaobei1989@126.com

馮鳳琴，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：新型功能性食品添加劑；E-mail：fengfq@zju.edu.cn