羅岸

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434023）

煙草遠(yuǎn)緣雜種合子中父本特異表達(dá)基因EB30的克隆與分析

羅岸

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434023）

已知煙草遠(yuǎn)緣雜種的合子中EB30基因（EST序列號EB426694）的表達(dá)具有父本特異性。參考NCBI的EST序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到該基因的CDS序列，并對其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用染色體步移和hiTAIR-PCR技術(shù)獲取EB30基因的5'側(cè)翼序列（啟動子和5' UTR）。構(gòu)建由該基因5'側(cè)翼序列驅(qū)動的EB30-EGFP融合蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果表明，EB30蛋白由211個氨基酸組成，蛋白分子量為22.616 2 kD，等電點(diǎn)pI 為5.63。該蛋白具有親水性，可能定位于線粒體中。煙草EB30蛋白與同屬茄科的番茄和馬鈴薯的蛋白序列相似度最高，約為73%。不同物種的同源蛋白的N端和C端都具有一段較為保守的序列區(qū)段。觀察轉(zhuǎn)基因植株合子和二胞原胚能檢測到較強(qiáng)熒光，證實(shí)所獲EB30基因的5'側(cè)翼序列在早期胚胎發(fā)生時(shí)期具有啟動子活性。

煙草；遠(yuǎn)緣雜交；早期胚胎發(fā)生；父本特異表達(dá)；基因克隆

父本轉(zhuǎn)錄本是否參與了植物早期胚胎發(fā)生這一問題曾引起過巨大的爭議。早前的研究認(rèn)為，受精前即存儲于卵細(xì)胞中的母本轉(zhuǎn)錄本主導(dǎo)著胚胎的早期發(fā)育［1-5］。但對擬南芥和玉米等植物中父本信號的檢測暗示父本轉(zhuǎn)錄本可能也參與了植物的早期胚胎發(fā)生［6-8］。隨后父母雙方轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)水平首次在玉米不同自交系的雜種合子中被量化，試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，父母雙方的遺傳信息對于合子的發(fā)育具有同等作用，且父本轉(zhuǎn)錄本的高活性也印證了所觀察到的雜種優(yōu)勢［9］。利用深度測序技術(shù)，最新的工作系統(tǒng)分析了擬南芥早期胚胎中存在的轉(zhuǎn)錄本的父母本來源［10，11］。兩項(xiàng)研究都證實(shí)某些父本的轉(zhuǎn)錄本單獨(dú)存在于胚胎的早期發(fā)育時(shí)期。因此父本轉(zhuǎn)錄本在植物早期胚胎發(fā)生中可能扮演重要角色。但至今，對這類轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)意義仍知之甚少。

雜種優(yōu)勢在自然界中普遍存在，它是指雜種F1代與其親本相比，在抗逆、抗病蟲或產(chǎn)量等方面表現(xiàn)出更優(yōu)良的性狀。雜種優(yōu)勢一般在成熟植株中表現(xiàn)明顯，但某些時(shí)候在胚胎和幼苗時(shí)期就已出現(xiàn)［9，12］。除不同品種和品系的雜交，跨越種屬的遠(yuǎn)緣雜交也是制造雜種優(yōu)勢，創(chuàng)造新品種的重要手段。雖然雜種優(yōu)勢早已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，但對其分子調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識卻一直裹足不前。如今研究者發(fā)現(xiàn)，在玉米雜種中有些基因的表達(dá)呈現(xiàn)出等位基因的差異化［13，14］，暗示等位基因的差異表達(dá)可能也反映了雜種優(yōu)勢的一種調(diào)控途徑。因此對在雜種早期胚胎發(fā)生中單一親本來源的轉(zhuǎn)錄本的研究十分必要。

通過之前的工作可知EB30基因在煙草遠(yuǎn)緣雜種的合子中呈父本特異表達(dá)［15］。本研究利用NCBI的EST數(shù)據(jù)庫獲得該基因的CDS全長序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件加以分析。通過染色體步移和hiTAIR-PCR技術(shù)獲得EB30 基因的5'側(cè)翼序列（啟動子和5'UTR），分析新獲得的序列在早期胚胎發(fā)生時(shí)期的啟動子活性情況，旨在為進(jìn)一步研究EB30基因的生物學(xué)功能奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 GFP融合蛋白表達(dá)載體在pART27載體上改造而成，由武漢大學(xué)彭雄波副教授提供。大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)為武漢大學(xué)植物生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 植物材料 試驗(yàn)材料為野生型煙草（Nicotiana tabacum var. SR1），陰性對照植株為攜帶有花粉特異啟動子Lat52驅(qū)動的EGFP蛋白的轉(zhuǎn)基因SR1植株（武漢大學(xué)植物生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制），種植于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所屬溫室內(nèi)，室溫25℃，光照16 h。

1.1.3 主要試劑 普通DNA片段回收試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，DNeasy Plant Mini Kit試劑盒購自QIAGEN公司，Universal Genome Walker Kit試劑盒購自Clontech公司，DNA聚合酶Ex Taq購自Ta-KaRa公司，DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerasehe，限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，T4 DNA lignase購自Fermentas公司，pGEM-T Easy vector購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組的提取及染色體步移文庫的構(gòu)建 取100 mg幼葉，在液氮中碾碎后按照DNeasy Plant Mini Kit 試劑盒的要求進(jìn)行操作。使用分光光度計(jì)將獲得的基因組DNA稀釋至Universal Genome Walker Kit試劑盒要求的濃度。建庫所需的4種平末端內(nèi)切酶分別選用EcoR V、Dra I、Ssp I 和Xmn I，酶切時(shí)間分別為Dra I 和Ssp I 10 min，EcoR V 48 h，Xmn I 12 h。酶切完成后電泳檢測，合格后按照試劑盒要求完成后續(xù)步驟。

1.2.2 EB30基因CDS區(qū)的克隆 根據(jù)NCBI提供的EST序列設(shè)計(jì)CDS引物（表1）。使用該引物在預(yù)制備的煙草合子cDNA pool中擴(kuò)增，以獲得煙草品種SR1的EB30基因的CDS序列［15］。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)。Pushion高保真酶擴(kuò)增?；厥漳康臈l帶，送樣測序。

表1 CDS擴(kuò)增所需引物

1.2.3 EB30基因5'側(cè)翼區(qū)的克隆 按照Universal Genome Walker Kit試劑盒的要求設(shè)計(jì)GSP引物。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒要求，引物退火溫度靈活掌握，得到目的片段后送樣測序。獲得一定長度的未知序列后，通過染色體步移技術(shù)無法繼續(xù)向5'上游擴(kuò)增，故使用hiTAIR-PCR技術(shù)繼續(xù)擴(kuò)增。按照文獻(xiàn)［16］的要求設(shè)計(jì)引物，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)要求，退火溫度靈活掌握，得到目的片段后送樣測序。引物序列見表2。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用Omiga分析EST序列的開放閱讀框。利用ExPASy（http：/ /web.expasy.org）的Protparam和ProtScale預(yù)測蛋白質(zhì)的氨基酸組成和理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)，并通過SOPMA預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。采用PSORT（http：//psort.hgc. jp/form.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。利用NCBI的blastx搜索EB30蛋白的同源氨基酸序列，利用軟件Clustalx 1.83進(jìn)行同源比對，并用MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

極限求解過程中，若需要運(yùn)用等價(jià)無窮小替換計(jì)算極限，首先需要掌握等價(jià)替換定理(等價(jià)無窮小替換定理:α～α′，β～β′，則 )和熟記幾個常用的等價(jià)無窮小替換公式(x→0時(shí)，sin x～x，tan x～x，arctan x～x，arcsin x～x，ln(1+x)～x，ex-1～x，1-cos在了解和掌握等價(jià)無窮小替換后，例1中運(yùn)用等價(jià)無窮小替換計(jì)算極限方法如下:

表2 5'側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增所需引物

1.2.5 GFP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 依據(jù)已知序列，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增EB30基因的5'側(cè)翼區(qū)和CDS的引物，并在5'端添加酶切位點(diǎn)，引物序列見表3。用CDS-F2/CDS-R2在預(yù)制備的煙草合子cDNA pool中擴(kuò)增CDS序列［12］，反應(yīng)條件和程序同1.2.2。用PRO-F/PRO-R在煙草基因組中擴(kuò)增啟動子和5'UTR，反應(yīng)條件和程序同1.2.2。對目的條帶回收后進(jìn)行雙酶切，并依次連入GFP融合蛋白表達(dá)載體，送樣測序。

表3 載體構(gòu)建所需引物

1.2.6 煙草葉盤轉(zhuǎn)化 應(yīng)用電轉(zhuǎn)法將構(gòu)建好的GFP融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，采用葉盤法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。植株成熟后使用熒光觀察以篩選陽性苗。

1.2.7 煙草早期胚胎分離與觀察 取人工授粉后96 h和108 h左右的子房用于胚胎分離。采用酶解-研磨法分離得到胚囊，將胚囊繼續(xù)短時(shí)間酶解，然后用自制的微型玻璃吸管小心吹打分離出合子和2胞原胚［17，18］。將得到的胚胎置于微滴中觀察。

2 結(jié)果

2.1 EB30基因CDS區(qū)的克隆

NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST序列為738 bp。Omiga軟件預(yù)測其可能包含一個633 bp的CDS編碼區(qū)（圖1，紅色條段）。以此CDS序列為模板設(shè)計(jì)引物，可在預(yù)制備的煙草合子cDNA Pool中擴(kuò)增到相應(yīng)條帶。測序結(jié)果表明，所獲序列與數(shù)據(jù)庫相比有兩個堿基的差異。但分析圖1的紅色條段可知，其顯示的CDS的起始密碼子ATG之前還可能存在新的起始密碼子。后續(xù)試驗(yàn)將結(jié)合新擴(kuò)增序列對EB30的CDS全長進(jìn)行確定。

2.2 步移文庫的構(gòu)建及EB30基因5'側(cè)翼區(qū)的克隆和CDS完整性的驗(yàn)證

染色體步移文庫的構(gòu)建見圖2-A。因EST序列較完整，故直接使用染色體步移技術(shù)來獲取EB30基因的5'側(cè)翼序列。第一次向序列的5'端延伸了637 bp，其中247 bp的序列與原CDS序列完全匹配。之后由于使用染色體步移技術(shù)無法再次延伸序列，故選用hiTAIR-PCR技術(shù)來繼續(xù)獲取未知序列。第一次獲得了1 296 bp，第二次獲得了901 bp。之后無論利用染色體步移或hiTAIR-PCR技術(shù)均無法再繼續(xù)獲得新序列。將3次延伸獲得的序列進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)在圖1紅色條段所示CDS的起始密碼子ATG之前共存在2 406 bp序列（圖2-B和圖3）。同時(shí)將拼接序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)圖1的紅色條帶所示的CDS起始密碼子之前96 bp處存在一個終止子TAA，說明圖1中紅色條段所示即為完整CDS。

圖1 EB30 EST開放閱讀框分析

使用在線的Protparam和ProtScale工具對EB30蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果（表2）表明，該蛋白的分子量為22.616 2 kD，pI5.63，屬酸性蛋白。該蛋白由211個氨基酸組成，包含20 種基本氨基酸類型，其中Gly 和Ser含量最為豐富（各占12.3%）。EB30蛋白的正、負(fù)電荷殘基分別為20和26個，脂肪系數(shù)78.44，不穩(wěn)定性指數(shù)64.69，屬不穩(wěn)定蛋白。分析顯示EB30蛋白的平均總疏水性為-0.406，屬親水性蛋白。

圖2 染色體步移文庫構(gòu)建（A）及EB30基因5'側(cè)翼區(qū)和CDS的克?。˙）

圖3 EB30基因5'側(cè)翼區(qū)序列

表 2 EB30基因編碼氨基酸一級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

2.4 EB30蛋白的亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建由EB30基因5'側(cè)翼序列驅(qū)動的EB30-EGFP融合蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)基因。使用Confocal對融合蛋白植株的花粉粒和花粉管的熒光進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)EB30-EGFP蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集，而在陰性對照植株的花粉中EGFP蛋白則彌散分布（圖4）。這暗示EB30蛋白可能定位于某種細(xì)胞器，從而在胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮作用。軟件預(yù)測的結(jié)果也顯示EB30蛋白定位于線粒體中的可能性最大。

2.5 EB30蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊等組成。二級結(jié)構(gòu)折疊形成正確的三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮正常的生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。分析顯示EB30蛋白的二級結(jié)構(gòu)由4 種形式組成，其中α-螺旋占34.60%，無規(guī)則卷曲占49.29%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角較少，分別占11.85%和4.27%（表3和圖5）。由此可知，無規(guī)則卷曲在EB30蛋白二級結(jié)構(gòu)中最多，而α-螺旋和延伸鏈分散于整個蛋白中。

圖4 EB30-EGFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位

表3 EB30蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

圖5 EB30蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 EB30蛋白氨基酸序列同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Blastx搜索煙草EB30蛋白的同源序列，發(fā)現(xiàn)在高粱、玉米、粟米、葡萄、番茄和馬鈴薯等農(nóng)作物中都存在與之類似的蛋白序列。其中煙草與同屬茄科的番茄和馬鈴薯的序列相似度最高，達(dá)到73%（圖6）。搜索結(jié)果還顯示該蛋白無任何功能注釋，這表明EB30基因是一種未被研究過的基因，編碼一種新型的蛋白。對不同物種中EB30蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)這些序列的C端和N端附近都各自擁有一段較為保守的區(qū)段，這可能與其執(zhí)行的功能有密切關(guān)系。但是在氨基酸序列的其他部分，不同物種間的序列差別較大，說明這些區(qū)域進(jìn)化速度較快。選取不同物種的EB30同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7），發(fā)現(xiàn)同屬茄科的番茄、馬鈴薯和煙草屬于同一分支，單子葉植物高粱、玉米和粟米則親緣關(guān)系較近。

2.7 EB30基因的5'側(cè)翼序列在早期胚胎時(shí)期的活性

利用2.4中所獲得的轉(zhuǎn)基因植株，采用人工授粉的方法取得授粉后96 h和108 h的胚珠。利用二次酶解法獲得合子和二胞原胚后利用普通熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，熒光清晰可辨（圖8），表明獲基因的5'側(cè)翼序列在早期胚胎發(fā)生階段有較強(qiáng)的啟動子活性。

3 討論

現(xiàn)有的科學(xué)研究表明，在植物早期胚胎發(fā)生中來自父母雙方的轉(zhuǎn)錄本都參與了胚胎的發(fā)育，且有些發(fā)育事件或是由父本或母本轉(zhuǎn)錄本主導(dǎo)調(diào)控［9-11］。如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SHORT SUSPENSOR（SSP）基因的父本轉(zhuǎn)錄本可以控制胚胎的模式形成［19］，以及NIMNA基因（NMA）的父本等位基因的突變會更明顯地導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲滯［20］。但目前對父本轉(zhuǎn)錄本在胚胎發(fā)生中的生物學(xué)功能還只有零星報(bào)道，而對單一親本來源的轉(zhuǎn)錄本在遠(yuǎn)緣雜種早期胚胎中的具體功能的研究則尚未見諸報(bào)端。

圖6 EB30蛋白氨基酸序列比對分析

圖7 煙草與其他物種的EB30蛋白的進(jìn)化樹分析

圖8 EB30-EGFP融合蛋白在早期胚胎中的表達(dá)

EB30基因是在煙草遠(yuǎn)緣雜種的合子中父本特異表達(dá)的基因。其作為一種未知功能的新型蛋白廣泛存在于高粱、玉米、粟米、葡萄、番茄和馬鈴薯等農(nóng)作物中。盡管單子葉植物高粱、玉米和粟米中的EB30和同屬茄科的煙草、番茄和馬鈴薯的EB30的氨基酸序列處于不同的進(jìn)化支，但是不同物種的同源蛋白在靠近C端和N端的位置都有相對保守的序列區(qū)段。這暗示了該蛋白的非核心區(qū)進(jìn)化速度較快，而核心區(qū)的進(jìn)化則相對保守。本研究借助已知的EST序列信息，結(jié)合染色體步移和hiTAIR-PCR技術(shù)成功獲得了EB30基因的5'上游側(cè)翼序列。染色體步移是獲取未知基因序列較常用的技術(shù)。但由于序列特異性等原因，常常遇到序列延伸困難等問題。而Liu等［16］在 TAIR-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上經(jīng)重新設(shè)計(jì)隨機(jī)引物和改善擴(kuò)增條件推出了hiTAIR-PCR技術(shù)，其只需要簡單的基因組模板即可進(jìn)行試驗(yàn)。本研究通過這兩種技術(shù)的綜合運(yùn)用獲得了EB30基因起始密碼子ATG之前2 046 bp的上游序列，包括啟動子和5' UTR。一般認(rèn)為起始密碼子上游2 000 bp的序列已足以調(diào)控基因的表達(dá)，故構(gòu)建了由EB30基因啟動子和5' UTR驅(qū)動的EB30-EGFP融合蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。觀察轉(zhuǎn)基因植株的合子和2胞原胚發(fā)現(xiàn)有明顯的熒光信號，說明本研究所獲得的EB30基因的5'側(cè)翼序列在早期胚胎發(fā)育時(shí)期有較強(qiáng)啟動子活性。這為以后利用RNA干擾等技術(shù)對EB30基因進(jìn)行功能分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在煙草遠(yuǎn)緣雜種的合子中父本特異表達(dá)的EB30基因含有633 bp的CDS區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為22.616 2 kD，pI 值5.63，屬酸性蛋白。該蛋白不穩(wěn)定，具有親水性，且可能定位于線粒體中。其二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲含量最高，其次為α-螺旋。EB30蛋白作為一種未知功能的新型蛋白存在于許多雙子葉和單子葉的農(nóng)作物中，且有較為保守的序列區(qū)段。新獲得的EB30基因的5'側(cè)翼序列在早期胚胎發(fā)生時(shí)期有較強(qiáng)啟動子活性。

［1］Vielle-Calzada JP， Baskar R， Grossniklaus U. Delayed activation of the paternal genome during seed development［J］. Nature， 2000，404（6773）：91-94.

［2］Grimanelli D， Perotti E， Ramirez J， Leblanc O. Timing of the maternalto-zygotic transition during early seed development in maize［J］. Plant Cell， 2005（4）：1061-1072.

［3］Golden TA， Schauer SE， Lang JD， et al. Short integuments1/ suspensor1/carpel factory， a dicer homolog， is a maternal effect gene required for embryo development in Arabidopsis［J］. Plant Phys，2002， 130（2）：808-822.

［4］Baroux C， Blanvillain R， Gallois P. Paternally inherited transgenes are down-regulated but retain low activity during early embryogenesis in Arabidopsis［J］. FEBS Lett， 2001， 509（1）：11-16.

［5］Pillot M， Baroux C， Vazquez MA， et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis［J］. Plant Cell， 2010， 22：307-320.

［6］Weijers D， Geldner N， Offringa R， Jurgens G. Seed development：Early paternal gene activity in Arabidopsis［J］. Nature， 2001， 414（6865）：709-710.

［7］Scholten S， Loerz H， Kranz E. Paternal mRNA and protein synthesis coincides with male chromatin decondensation in maize zygotes［J］. Plant J， 2002， 32：221-231.

［8］ Sheldon CC， Hills MJ， Lister C， et al. Resetting of FLOWERING LOCUS C expression after epigenetic repression by vernalization［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2008， 105：2214-2249.

［9］ Meyer S， Scholten S. Equivalent parental contribution to early plant zygotic development［J］. Current Biology， 2007， 17（19）：1686-1691.

［10］ Autran D， Baroux C， Raissig MT， et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis［J］. Cell， 2011， 145（5）：707-719.

［11］ Nodine MD， Bartel DP. Maternal and paternal genomes contribute equally to the trascriptome of early plant embryos［J］. Natrue，2012， 482（7383）：94-97.

［12］ Hoecker N， Keller B， Piepho HP， Hochholdinger F. Manifestation of heterosis during early maize（Zea mays L.）root development［J］. Theor Appl Genet， 2006， 112（3）：421-429.

［13］Stupar RM， Springer NM. Cis-transcriptional variation in maize inbred lines B73 and Mo17 leads to additive expression patterns in the F1 hybrid［J］. Genetics， 2006， 173（4）：2199-2210.

［14］Guo M， Rupe MA， Zinselmeier C， et al. Allelic variation of gene expression in maize hybrids［J］. Plant Cell， 2004， 16（7）：1707-1716.

［15］Zhang JE， Luo A， Xin HP， et al. Genes of both parental origins are differentially involved in early embryogenesis of a tobacco interspecies hybrid［J］. PLoS One， 2011， 6（8）：e23153.

［16］Liu YG， Chen Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences［J］. Biotechniques， 2007， 43（5）：649-650.

［17］Sun MX， Yang HY， Zhou C. A new method for embryo sac isolation and in situ fusion of egg and synergid protoplasts in Nicotiana tubacum［J］. Acta Bot Sin， 1993， 35：893-900.

［18］Fu CM， Sun MX， Zhou C， Yang HY. Isolation of fertilized embryo sacs and zygotes and triggering of zygote division in vitro in Nicotiana tabacum［J］. Acta Bot Sin， 1996， 38：262-267.

［19］Bayer M， Nawy T， Giglione C， et al. Paternal control of embryonic patterning in Arabidopsis thaliana［J］. Science， 2009， 323（5920）：1485-1488.

［20］ Babu Y， Musielak T， Henschen A， Bayer M. Suspensor len gth determines developmental progression of the embryo in Arabidopsis［J］. Plant Physiol， 2013， 162（3）：1448-1458.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Analysis of Paternally Expressed Gene EB30 in Zygote of a Tobacco Interspecies Hybrid

Luo An
（College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434023）

As known that EB30（EST accession number EB426694）paternally expressed in zygote of a tobacco interspecies hybrid，its CDS sequence was then cloned by using the EST database of NCBI. Also some characters of EB30 protein were analyzed by the methods of bioinformatics. Genome walking and hiTAIR-PCR were used to obtain the 5' flanking region of EB30 including the promoter and 5'UTR. The EB30-EGFP fusion protein expression vector driven by the 5' flanking region of EB30 was constructed and transformed into the tobacco. The results showed that EB30 gene encoded 211 amino-acid residues with a molecular weight 22.616 2 kD and pI5.63. This protein was hydrophilic，and predicted to locate in the mitochondrion. The phylogenetic tree showed that EB30 protein of tobacco was so closed to the tomato and potato，the amino acid homology was about 73%. There were two conserved regions near the N-terminal and C-terminal in homologous proteins from different species. Finally， the 5' flanking region of EB30 was proved to have a promoter activity in the early embryogenesis by fluorescence observation in the zygote and 2-celled proembryo from transgenic plants.

tobacco；interspecies hybrid；early embryogenesis；paternal expression；cloning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.018

2014-05-04

長江大學(xué)博士科研啟動基金項(xiàng)目（2014NSFY023）

羅岸，男，博士，講師，研究方向：植物生殖發(fā)育；E-mail：anluo@whu.edu.cn