張國武劉學(xué)鋒周興華黃濤

（1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，湛江 524022；2.余干縣林業(yè)局，余干 335100；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林藝術(shù)學(xué)院，南昌 330045）

觀葉福祿桐遺傳多樣性的ISSR分析

張國武1劉學(xué)鋒1周興華2黃濤3

（1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，湛江 524022；2.余干縣林業(yè)局，余干 335100；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林藝術(shù)學(xué)院，南昌 330045）

利用ISSR分子標(biāo)記對9個觀葉福祿桐品種進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從100條引物中篩選出9條穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物用于PCR擴增，共獲得70條帶，其中多態(tài)性條帶61條，多態(tài)百分率為87.14%。聚類結(jié)果顯示，品種間相似性系數(shù)為0.346 9-0.816 3，聚類結(jié)果與品種間的地理來源緊密相關(guān)，從外觀形態(tài)上比較，親緣性較近的葉形和株型相似性較高；觀葉福祿桐各品種間基因型差異較小，親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)相對較窄。

ISSR；福祿桐；觀葉植物；遺傳相似性系數(shù)；聚類分析

ISSR（Inter-simple sequence repeat）由Zietkiewicz等［1］于1994年創(chuàng)建，因其具有分布廣、多態(tài)性高、技術(shù)難度低、操作簡單、重復(fù)性高、成本低等優(yōu)點，是一種近年來應(yīng)用較為廣泛的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，它來源于植物基因組中豐富的簡單序列重復(fù)（SSR），由2-4個隨機的核苷酸錨定在微衛(wèi)星序列的3'端或5'端，由此組成的單引物進行重復(fù)序列間DNA的PCR擴增［2］，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于居群生物學(xué)的研究、品種鑒定和物種分類，并作為構(gòu)建遺傳圖譜的工具［3］。

福祿桐（Polyscias），原產(chǎn)于太平洋諸島，為五加科福祿桐屬植物，常綠灌木或小喬木，株形柔和，古樸優(yōu)雅，古色古香，葉片與莖干奇特優(yōu)美，側(cè)枝細(xì)長，枝繁葉茂，葉片形狀多樣，有圓葉、羽葉、條形葉、蕨葉等［4，5］；葉色斑駁多彩，有綠、黃、銀色等；植株多分枝，分枝皮孔顯著，樹型緊湊優(yōu)美，生長速度快，耐整形修剪，性喜高溫多濕，耐旱耐陰。不同規(guī)格的植株裝飾客廳、臥室、書房、陽臺等處，既時尚典雅，又清新自然，是近幾年較為流行的高檔室內(nèi)觀葉盆栽，適合庭院美化和室內(nèi)盆栽。目前，國外的研究主要集中在觀葉福祿桐的起源、化學(xué)成分及藥理作用方面［6-8］；國內(nèi)則主要集中于研究觀葉福祿桐的栽培、繁殖和觀賞價值［9-11］，而對其遺傳多樣性和品種間親緣關(guān)系的研究國內(nèi)外尚未報道，由此導(dǎo)致觀葉福祿桐品種混雜、分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、優(yōu)良種質(zhì)資源稀缺，制約了其快速良好的發(fā)展。因此，本研究在廣泛調(diào)查和收集福祿桐品種資源的基礎(chǔ)上，以國內(nèi)常見的觀葉福祿桐為試驗材料，利用ISSR分子標(biāo)記對品種間的親緣關(guān)系和遺傳相似性進行分析，旨在為福祿桐屬植物的分類、親緣關(guān)系鑒定提供依據(jù)，同時為今后福祿桐種源的選擇、優(yōu)良品種的引進和新品種培育奠定分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

9個參試福祿桐品種由廣東省湛江市國家級南方種苗基地所提供（參試品種詳見表1），試驗于國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心實驗室內(nèi)完成。

表1 福祿桐屬植物9份材料

1.2 方法

1.2.1 福祿桐基因組DNA的提取與檢測 試驗樣品均采集生長健壯、無病蟲害危害植株的幼嫩葉片，利用改良的CTAB法［12-14］提取福祿桐葉片基因組DNA，用1×TAE電泳緩沖液，在1.5%瓊脂糖（含EB終濃度為0.5 μg/mL）凝膠中電泳，條件為85 V，50 min；凝膠成像系統(tǒng)下（Bio-Rad）觀察并記錄，以初步檢測基因組DNA的完整度和質(zhì)量；通過核酸檢測儀（Bio-Rad生產(chǎn)的Thermo Nano Drop 2000）檢測其濃度及純度。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及條件 PCR擴增儀為美國Bio-Rad（伯樂公司）C-1000，反應(yīng)體系：反應(yīng)體系總體積為25 μL，DNA模板濃度為15 ng，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，引物濃度0.6 μmol/L，Taq酶含量0.5 U，dNTP濃度為0.20 mmol/L，內(nèi)含2.5 μL 10×PCR buffer。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，47℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環(huán)38次；72℃延伸7 min；4℃保存。

1.2.3 引物篩選及PCR擴增 本研究的引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）公司合成，隨機選擇3個參試材料對100條引物進行篩選，從中選出差異性條帶強、多態(tài)性高的引物用于后續(xù)的PCR擴增；利用篩選的引物對所有參試樣品DNA進行PCR擴增，擴增結(jié)束后取PCR擴增產(chǎn)物和Loading buffer緩沖液比例為2∶1于1.5%瓊脂糖（含EB終濃度為0.5 μg/mL）凝膠中電泳（85 V，1 h），然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并成像記錄。

1.2.4 電泳圖譜分析方法 對PCR擴增好的圖譜帶進行統(tǒng)計分析，每個電泳圖擴增出的條帶代表一個ISSR位點，有條帶的記為“1”、無則記為“0”的方法記錄每個引物PCR擴增的電泳譜帶，且僅記錄清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好的擴增條帶，并將“0”、“1”數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Excel表格格式，再利用NTSYS-pc2.10軟件做進一步分析；在NTSYS-pc2.10軟件中，根據(jù)SM相似系數(shù)法求得9個福祿桐品種間遺傳相似性矩陣，用UPGMA法對各品種進行聚類分析，構(gòu)建聚類圖；再將Dice遺傳相似性矩陣進行Dcenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，求其特征量和特征向量，進行主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取的質(zhì)量

采用改良的CTAB法提取9個福祿桐品種的基因組DNA，電泳檢測結(jié)果如圖1所示，核酸檢測儀測定OD260/OD280比值在1.75-1.95之間，表明所提取葉片基因組DNA中蛋白質(zhì)和RNA含量較少，純度較高，符合后續(xù)的試驗要求。

圖1 九個福祿桐品種DNA質(zhì)量

2.2 引物篩選多態(tài)性分析

隨機選擇3個試驗樣品對100個ISSR引物進行篩選，共篩選出9條清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物用于PCR擴增（表2）；利用篩選出的9條多態(tài)性引物對9個不同品種的福祿桐進行PCR擴增，擴增結(jié)果見圖2。通過對9張圖譜的統(tǒng)計分析，PCR擴增共得到70條帶，其中多態(tài)性條帶61條，多態(tài)百分率為87.14%；其中引物U848擴增條帶數(shù)最多，共產(chǎn)生11條，多態(tài)性條帶9條，引物U823、U826多態(tài)性百分比達(dá)到100%，都擴增出7條帶，引物U859擴增條帶數(shù)最少為6條；各引物擴增條帶為6-11，大小一般在200-3 000 bp之間。檢測結(jié)果見表2。

表2 ISSR-PCR分析所用引物及擴增結(jié)果

2.3 品種間遺傳相似性分析

利用NTsys-pc2.10軟件得出各觀葉福祿桐品種間的相似性系數(shù)。結(jié)果（表3）表明，9個觀葉福祿桐品種間的遺傳相似性系數(shù)范圍在0.346 9-0.816 3，平均遺傳相似性系數(shù)為0.598 4；其中C1（圓葉福祿桐）和C5（黃斑圓葉福祿桐）間的遺傳相似性系數(shù)最大，達(dá)到0.816 3，其次C1（圓葉福祿桐）和C2（紅葉圓葉福祿桐）遺傳相似性系數(shù)也較高，達(dá)到0.795 9，表明它們之間的遺傳差異小，親緣性很近，而C2（紅葉圓葉福祿桐）和C7（南洋參）相似性系數(shù)最小為0.346 9，表明其遺傳差異性較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表3 九個觀葉福祿桐品種間的相似性系數(shù)

2.4 品種間聚類分析

圖2 不同引物的PCR電泳圖譜（編號C1-C9同表1）

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣采用UPGMA法對9個觀葉福祿桐品種進行聚類分析（圖3）。分析聚類圖可知，在遺傳相似性系數(shù)為0.52處，9個觀葉福祿桐品種分為A、B兩大類，A類有7個品種，C4（羽葉福祿桐）和C7（南洋參）歸為B類，相似性系數(shù)達(dá)到0.76，這兩品種間形態(tài)特征也極為相似，都為羽葉，只是葉片開裂的深淺程度不同而已，種質(zhì)資源收集地也都來自廣西，可見地域差異也影響著品種間的親緣性，聚類結(jié)果顯示C4（羽葉福祿桐）和C7（南洋參）親緣性較近；A類種群在相似性系數(shù)0.57處，分支成A1和A2兩亞類，A2亞類只有C3（線葉福祿桐）一個品種，而A1亞類在相似性系數(shù)為0.63處，又分支成A11和A12兩組，A11組包括C1（圓葉福祿桐）、C5（黃斑圓葉福祿桐）、C2（紅葉圓葉福祿桐）和C9（銀邊圓葉福祿桐），其葉形和葉脈極相似，葉色稍有差異，其中C1（圓葉福祿桐）和C5（黃斑圓葉福祿桐）親緣性最近，相似性指數(shù)約為0.82；A12組有銀邊福祿桐和芹葉福祿桐。

圖3 福祿桐品種資源ISSR聚類圖

2.5 品種資源的主坐標(biāo)分析

品種資源的主坐標(biāo)分析和聚類分析雖然都能反應(yīng)樣品的聚類情況，但它們反應(yīng)的信息含量卻有所差異。從主坐標(biāo)二維分布圖（圖4）可以得知，9個福祿桐品種有較明顯的分布區(qū)域，C4和C7位于坐標(biāo)圖的左側(cè)，C6和C8分布于坐標(biāo)圖的上方，C1、C2、C5和C9分布于坐標(biāo)圖的右下方。從整體上看品種資源的主坐標(biāo)分析與聚類分析結(jié)果較符合。

圖4 福祿桐品種資源主坐標(biāo)分析二維圖

3 討論

ISSR是在SSR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的分子標(biāo)記，目前，ISSR已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳作圖、遺傳多樣性及分子生態(tài)學(xué)研究［15，16］。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對9份觀葉福祿桐種質(zhì)資源材料進行遺傳多樣性分析，從100條引物中篩選出9條穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物用于PCR擴增，共獲得70條帶，其中多態(tài)性條帶61條，多態(tài)百分率為87.14%，體現(xiàn)了ISSR分子標(biāo)記較好的多態(tài)性；遺傳多樣性分析將9個福祿桐品種完全分開，揭示了不同福祿桐品種間的相互關(guān)系，是鑒定福祿桐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的一條有效途徑。

研究結(jié)果顯示，9個觀葉福祿桐品種間相似性系數(shù)為0.346 9-0.816 3，品種間具有較高遺傳相似性；聚類分析顯示：各品種間相似性系數(shù)為0.52時，其中羽葉福祿桐和南洋參聚為B組，其它的福祿桐品種聚為A組，各福祿桐屬植物親緣關(guān)系分化比較明顯，植株的外部形態(tài)特征相似度與其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近大部分相對應(yīng)，其中銀邊福祿桐與芹葉福祿桐親緣關(guān)系近，兩植物外形特征差異明顯，其它福祿桐屬植物歸為同一類的外形特征都較為相似。進一步分析聚類圖可知，福祿桐屬植物遺傳背景范圍小，可推測出種源相對少，單一。聚類結(jié)果與品種間的地理來源緊密相關(guān)，從外觀形態(tài)方面比較，親緣性較近的葉形和株型存在一定的相似度，由于本研究表型性狀調(diào)查采集的數(shù)據(jù)較少，聚類結(jié)果與表型性狀間相關(guān)性并不明顯，今后可在大量調(diào)查、采集福祿桐表型性狀數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，對其表型性狀進行深入分析，通過與聚類分析結(jié)果相比較，找到能對福祿桐品種進行有效分類或鑒別的質(zhì)量性狀。

福祿桐原產(chǎn)于太平洋諸島，由于氣候和環(huán)境因素的限制，只在我國南部的部分沿海城市引種和栽培，栽培面積狹窄，人工馴化栽培時間較短暫，而且長期以來福祿桐的繁殖方式以扦插繁殖為主，因而差異性不大；又因國內(nèi)各地方引種、栽培和育種只限于當(dāng)?shù)厥袌龊?、受歡迎的品種，地域性差異，育種目標(biāo)單一，導(dǎo)致國內(nèi)福祿桐各品種間基因交流少，基因多樣性逐漸窄化，所以國內(nèi)福祿桐各品種間親緣關(guān)系較近，各品種間的遺傳多樣性并非那樣豐富。在今后的馴化、栽培和育種工作中，加大引種、推廣力度，促進不同產(chǎn)區(qū)、種間種質(zhì)資源的交流，豐富其遺傳多樣性，加大對優(yōu)良新品種的選育力度，促進觀葉福祿桐生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究通過改良的CTAB法提取福祿桐屬植物DNA，獲得純度高、質(zhì)量好的基因組DNA，符合后續(xù)的試驗標(biāo)準(zhǔn)；利用優(yōu)化的反應(yīng)體系對試驗所設(shè)計的引物進行篩選，獲得9條試驗所需引物，分別對9個不同福祿桐屬植物基因組DNA進行PCR擴增，共獲得70條帶，其中多態(tài)性條帶61條，多態(tài)百分率為87.14%；然后分別對PCR圖譜帶進行聚類分析，結(jié)果表明：9個觀葉福祿桐品種間相似性系數(shù)為0.346 9-0.816，各品種間相似性系數(shù)為0.52時，其中羽葉福祿桐和南洋參聚為B組，其它的福祿桐品種聚為A組，各福祿桐屬植物親緣關(guān)系分化比較明顯；最后對9個福祿桐屬植物進行主坐標(biāo)分析，其結(jié)果與聚類分析基本保持一致。

［1］Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］. Genomics， 1999， 20：176-183.

［2］楊兆起.中藥鑒別手冊（第3冊）［M］.北京：科學(xué)出版社，1994：1.

［3］張國武， 鐘文斌， 烏云塔娜， 等.油茶優(yōu)良無性系［J］.林業(yè)科學(xué)研究， 2007， 20（2）：278-282.

［4］胡松華.南洋森與福祿桐觀葉植物介紹［J］.花卉， 2006， 9：32.

［5］胡一民.簡約時尚的觀葉植物—福祿桐［J］.中國花卉盆景，2003， 3：24.

［6］Plunkett GM， Lowry PP II， Michele K. The phylogenetic status of Polyscias（Araliaceae）based on nuclear its sequence date［J］. Annals of the Missouri Botanical Garden， 2001， 30（1）：213-230.

［7］Mitaine-Offer AC， Tapondjou LA， Lontsi D. Constituents isolated from Polyscias fulva［J］. Biochemical Syetematics and Ecology，2004， 32（6）：607-610.

［8］Vo DH， Yamamura S， Ohtani K， et al. Oleanane saponins from Polyscias fruticosa［J］. Phytochemistry， 1998， 47（3）：451-457.

［9］李克烈， 王榮香， 陳偉， 等.羽葉南洋參的組織培養(yǎng)［J］.植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（2）：324.

［10］歐陽泉， 周俊輝， 陳水漸， 等.幾種盆栽植物對甲醛的凈化作用［J］.北方園藝， 2012（22）：57-60.

［11］ 尹斌開， 龍相斌， 胡慶， 等.圓葉福祿桐組培快繁技術(shù)研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2008（20）：18-19.

［12］ 鄒喻蘋， 葛頌， 王曉東.系統(tǒng)與進化植物學(xué)中的分子標(biāo)記［M］.北京：科學(xué)出版社， 2001.

［13］ Dolye JJ， Dolye JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］. Phytochem Bul， 1987， 9（1）：11-15.

［14］ 許永華， 張愛華， 金慧， 等.人參種源遺傳關(guān)系的ISSR分析［J］.中草藥， 2010， 41（7）：1164-1167.

［15］閆偉紅， 徐柱， 李臨杭， 等.冰草屬植物ISSR遺傳分析與評價［J］.華北農(nóng)學(xué)報， 2010， 25（增刊）：60-64.

［16］蘇亞蕊， 劉新浩， 李鎖平.棉花種質(zhì)資源多樣性的ISSR聚類分析及主成分分析［J］.河南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2012，42（4）：401-406.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Studies on the Genetic Diversity of Polyscias by ISSR Marker

Zhang Guowu1Liu Xuefeng1Zhou Xinghua2Huang Tao3
（1.China Eucalypt Research Centre，Zhanjiang 524022；2. Yugan County Forestry Bureau，Yugan 335100；3. College of Landscape and Art，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）

In this study， nine species Polyscias leaves as experimental material， we analyzed the genetic diversity and relationship by ISSR markers， 9 stable and high polymorphism ISSR primers screened from 100 ISSR primers by optimized the system of PCR for Polyscias， a total of 70 bands were obtained by the polymorphic primers of 9 test specimens， including 61 polymorphic bands， the polymorphic percentage was 87.14%. The genetic similarity coefficients ranged from 0.346 9 to 0.816 3， suggesting that the substantial genetic divergence between some varieties. The clustering scheme showed that Polyscias had small differences of genetypes their genetic basis was comparatively narrow.

ISSR；Polyscias；foliage plants；genetic similarity coefficient；cluster analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.017

2014-04-29

中國林科院院基金項目（CAFYBB2012005）

張國武，男，博士，高級工程師，研究方向：森林培育；E-mail：fyzgwu@163.com

黃濤，男，碩士研究生，研究方向：園林植物栽培與應(yīng)用；E-mail：htaovs2010@163.com