劉曉丹張克勤劉連李文昌

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院，吉林 132101；2.長白山動植物資源利用與保護吉林省高校重點實驗室，吉林 132101）

烏腺金絲桃愈傷組織中總黃酮及金絲桃素含量測定

劉曉丹1，2張克勤2劉連1李文昌1

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院，吉林 132101；2.長白山動植物資源利用與保護吉林省高校重點實驗室，吉林 132101）

以烏腺金絲桃新鮮葉片為材料，建立穩(wěn)定的烏腺金絲桃愈傷組織的培養(yǎng)體系，進一步對愈傷組織總黃酮與金絲桃素的含量進行測定。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察不同激素組合對愈傷組織誘導的影響。結(jié)果表明，烏腺金絲桃誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS + 2，4-D 4.0 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L；采用超聲波法提取烏腺金絲桃愈傷組織中的總黃酮和金絲桃素，分別采用紫外分光光度法和HPLC 法測定烏腺金絲桃愈傷組織中總黃酮及金絲桃素的含量，結(jié)果表明，干燥烏腺金絲桃愈傷組織中總黃酮含量為27.99 mg/g，金絲桃素的含量為 0.515 mg/g。

烏腺金絲桃；愈傷組織；誘導；總黃酮；金絲桃素

烏腺金絲桃（Hypericum attenuatum Choisy）是藤黃科金絲桃屬植物，多分布于我國吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古等省，特別是長白山地區(qū)具有豐富的烏腺金絲桃資源。該屬植物含有十幾種黃酮及其苷類化合物，特別是廣泛分布于該屬的最具有生物活性成分的金絲桃素（Hypericin），具有顯著的抗病毒、抗抑郁和光動活性［1-4］，近年來成為國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點。

目前，國內(nèi)外對金絲桃屬植物的研究主要有4個方面：（1）金絲桃屬植物天然藥用成分的鑒定，提取分離工藝研究及含量測定［5-12］；（2）金絲桃屬植物天然藥用成分的藥理作用［13-18］；（3）金絲桃屬植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究［19-24］；（4）金絲桃素合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因的研究［25，26］。而對烏腺金絲桃的研究主要集中其天然活性成分的提取分離的研究［5，10］和天然活性成分的藥理作用這兩方面［13，14］，對其組織培養(yǎng)的研究還未見報道。

隨著人們對金絲桃屬植物天然藥用成分的需求不斷增加，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟價值的植物次生代謝產(chǎn)物，可為中藥的可持續(xù)發(fā)展提供一條新的途徑。本研究依托吉林省長白山重點實驗室，以烏腺金絲桃葉片為外植體，探索理想的愈傷組織誘導的激素組合，培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的愈傷組織，并分析其愈傷組織中總黃酮和金絲桃素含量，旨在為利用植物組織培養(yǎng)法生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟價值的天然植物次生代謝產(chǎn)物提供優(yōu)質(zhì)的生物材料，同時為進一步探討烏腺金絲桃細胞懸浮培養(yǎng)，篩選增殖快、藥用有效成分含量高的細胞系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 烏腺金絲桃栽培苗由吉林農(nóng)業(yè)科技學院長白山動植物資源利用與保護研究中心提供。

1.1.2 試劑 MS培養(yǎng)基（不含蔗糖和瓊脂）購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；植物激素2，4-D和6-BA購自Sigma公司；甲醇、乙醇為分析純；NaNO2，Al（NO3）3，NaOH等購自北京化工試劑；蘆丁標品和金絲桃素標品為吉林農(nóng)業(yè)科技學院長白山動植物資源利用與保護研究中心提供。

1.1.3 儀器 恒溫干燥箱（上海島韓實業(yè)有限公司），JY99-IIDN 超聲波破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），高效液相測定儀LC-20A（日本島津），KRG-350B智能光照培養(yǎng)箱（上海博珍儀器設(shè)備制造廠），751分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 烏腺金絲桃愈傷組織的誘導 5月采集烏腺金絲桃幼苗，選取1.0-2.0 cm 的葉片為外植體，經(jīng)過適當消毒后，切割成0.5 cm2接種于不同激素處理的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，25℃ 暗培養(yǎng)，10 d 后觀察愈傷組織生長情況，20 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。同時將各個處理的愈傷組織放入40℃的干燥箱中至完全干燥，此時稱重并記錄干重。干重即為生長量。誘導形成的愈傷每15 d 繼代一次。

1.2.2 烏腺金絲桃供試品溶液的制備 分別取繼代5次的愈傷組織和栽培的烏腺金絲桃幼苗材料5份，40℃完全干燥后，研缽中充分研磨成粉。每份稱取0.25 g。加入25 mL 60%乙醇，稱重，超聲處理60 min，放冷，補重，搖勻。5 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液備用。

1.2.3 烏腺金絲桃愈傷組織中總黃酮含量測定 標準曲線繪制：精確稱取2.5 mg蘆丁標準品，加90%乙醇定容到25 mL容量瓶中，搖勻即得濃度為0.1 mg/mL蘆丁對照品溶液。精確吸取上述對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL分別置于20 mL具塞試管中，各加90%乙醇至5 mL，再依次加5% NaNO20.3 mL 搖勻，放置6 min。10% Al（NO3）30.3 mL 搖勻，放置6 min，4% NaOH 4 mL搖勻，放置15 min。以不加蘆丁標品溶液同法操作得到的溶液作為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，溶液濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線。

供試樣品總黃酮含量測定：吸取供試品溶液2.0 mL 按照標準曲線繪制的方法測定吸光度。

1.2.4 烏腺金絲桃愈傷組織中金絲桃素含量測定

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry-C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）。流動相：甲醇-0.006 mol/L磷酸氫二納水溶液（87.5∶12.5），流速為1.0 mL/min 檢測波長為 590 nm，柱溫30℃；進樣量10 μL。

1.2.4.2 標準品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的金絲桃素標品2.04 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲使溶解并定容，搖勻，即制成204 μg/mL的金絲桃素標品溶液。

1.2.4.3 標準曲線繪制 精密量取上述金絲桃素標品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別進樣10 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積（X）為橫坐標，對照品溶液濃度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.4 供試樣品金絲桃素含量測定 分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件測定峰面積，以外標法計算金絲桃素含量。

2 結(jié)果

2.1 烏腺金絲桃愈傷組織的誘導

取烏腺金絲桃的幼嫩葉片為外植體，經(jīng)過適當消毒處理后，切割成0.5 cm2接種到不同愈傷組織誘導培養(yǎng)基中：MS 培養(yǎng)基中2，4-D濃度梯度為 1.0、2.0、4.0和6.0 mg/L，6-BA 濃度梯度為0.1、0.2和0.4mg/L，設(shè)計12個激素組合。每個平皿中接種2個材料，每個激素組合處理重復30次。暗培養(yǎng)10 d后葉片開始膨脹，培養(yǎng)15-20 d 后誘導出淺黃色，結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織（圖1）。

圖1 烏腺金絲桃愈傷組織誘導結(jié)果

培養(yǎng)20 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導率和生長量。結(jié)果（表1）顯示，以2，4-D 和 6-BA 為外源激素時，最適合烏腺金絲桃愈傷誘導的激素濃度為2，4-D 4.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，愈傷組織的誘導率為100%，而且愈傷組織的生物量積累最多。

表1 不同激素濃度條件下烏腺金絲桃愈傷組織誘導結(jié)果

2.2 烏腺金絲桃愈傷組織中總黃酮含量測定

2.2.1 線性關(guān)系 總黃酮標準曲線的回歸方程為 A =7.9125C-0.0033，r=0.999 8，表明蘆丁在0.010 4-0.052 7 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 供試樣品總黃酮含量測定 根據(jù)總黃酮回歸方程，計算各供試樣品溶液中總黃酮的含量。結(jié)果（表2）顯示，栽培一年的烏腺金絲桃中總黃酮含量為28.62 mg/g，愈傷組織中總黃酮含量為27.99 mg/g，兩者之間幾乎無差異。

2.3 烏腺金絲桃愈傷組織中金絲桃素含量測定

2.3.1 線性關(guān)系 金絲桃素標準曲線的回歸方程為Y=aX+b，a=1.517268e-003，b=1.017 952，r=0.999 9，表明金絲桃素在10.2-204 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 供試樣品金絲桃素含量 金絲桃素標準品、栽培烏腺金絲桃及金絲桃愈傷組織樣品HPLC色譜圖，見圖2。根據(jù)金絲桃素回歸方程，計算各供試樣品溶液中金絲桃素的含量，結(jié)果（表2）顯示，相比總黃酮的含量，金絲桃素的含量在栽培樣品與愈傷組織樣品中差異較大，分別為 3.076 mg/g 和0.515 mg/g，前者約為后者的6倍。

3 討論

目前關(guān)于金絲桃屬植物組培快繁的報道較多，主要有貫葉金絲桃（H. perforarum）、巴西金絲桃（H. brasiliense）、川慎金絲桃（H. forrestii）、金絲海棠（H. chinensis）、艷果金絲桃（H. androsaemum L.）等。通過快繁能夠?qū)崿F(xiàn)植株的大量繁殖，為金絲桃屬植物觀賞價值的應(yīng)用與藥用價值的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。金絲桃屬植物愈傷誘導中，關(guān)鍵是選擇好激素的種類和濃度配比。已經(jīng)報道的文獻資料中，最常用植物激素為2，4-D和6-BA。如 Cardoso等［19］對巴西金絲桃的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)最適合愈傷誘導的培養(yǎng)基為MS + 2，4-D（1.0-2.0 mg/L）；丁如賢等［20］對貫葉連翹的組培與快繁研究中發(fā)現(xiàn)含有2，4-D的MS培養(yǎng)基有利于愈傷的誘導；Pretto［21］以葉片為外植體進行愈傷的誘導，2，4-D和6-BA 配合使用時愈傷的誘導率最高；宋馨等［22］以貫葉金絲桃為材料探討體外培養(yǎng)的植物細胞分化過程與次生代謝物累積之間的關(guān)系，研究結(jié)果表明MS + 2，4-D（1.0 mg/L）+ 6-BA（0.2 mg/L）中可誘導產(chǎn)生愈傷組織；林華等［23］進行川滇金絲桃組織培養(yǎng)，以葉片、幼嫩的花蕾為外植體進行愈傷的誘導培養(yǎng)基為 MS + 2，4-D 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L + TDZ 0.01 mg/L。王海菲［24］對艷果金絲桃葉片愈傷誘導的研究表明，2，4-D和NAA對愈傷的誘導作用較顯著，2，4-D在0.5-1.0 mg/L愈傷誘導率達到100.0%，NAA 0.9 mg/L時愈傷誘導率達到96.7%。因此本研究選擇2，4-D和6-BA為外源激素，考察不同激素濃度對烏腺金絲桃愈傷形成的影響，最終確定烏腺金絲桃愈傷誘導的最佳培養(yǎng)基配方為MS + 2，4-D 4.0 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L，愈傷的誘導率為100%。而且愈傷組織生物量的積累最多。另外愈傷培養(yǎng)中光照的影響也很大，前期的黑暗培養(yǎng)以15-20 d 左右最好，低于15 d 則愈傷生長量少，而且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；而時間過長，雖可產(chǎn)生大量愈傷，但質(zhì)地變得很致密，不利于繼代培養(yǎng)。

圖2 烏腺金絲桃栽培苗及金絲桃愈傷組織樣品提取物HPLC 色譜圖

目前為止能夠采用細胞培養(yǎng)技術(shù)進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的植物天然活性物質(zhì)的種類非常有限，制約該項技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的核心問題之一是普遍存在的培養(yǎng)細胞中活性物質(zhì)的低產(chǎn)現(xiàn)象。1990年Kartnig等［27］對貫葉連翹進行了細胞懸浮培養(yǎng)，結(jié)果顯示培養(yǎng)物中金絲桃素的含量只有自然植株的1%；邵敏敏［28］2008年對貫葉連翹進行組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，葉誘導出的愈傷組織中金絲桃素的含量最高，可達0.001 5%，而莖誘導出的愈傷組織中金絲桃素的含量為0.001 1%；于曉坤等［29］2012年對貫葉連翹不定根進行懸浮培養(yǎng)，研究表明pH對金絲桃素的積累有著明顯的影響，當pH值為4.8和5.8時，不定根中的金絲桃素含量達到0.35 mg/g和0.49 mg/g。目前的研究主要集中在細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立和改變生長環(huán)境因子以提高金絲桃素含量等方面，而關(guān)于金絲桃素在細胞培養(yǎng)過程中的積累研究則少有報道。國內(nèi)外的一些研究報道，體外的組織培養(yǎng)中，添加一定濃度的生物或化學促進劑可不同程度地提高次級代謝產(chǎn)物的含量。如Walker和Sirvent等2002年在離體培養(yǎng)貫葉連翹時添加茉莉酸甲酯、水楊酸或植物病原菌蘋果炭疽病菌孢子，離體培養(yǎng)物中金絲桃素的含量比對照組（不添加促進劑）提高2-3.3倍［30，31］；Bruno等［32］2006年培養(yǎng)貫葉連翹時添加0.01-0.1 mmol/L的鉻離子，原偽金絲桃素和假金絲桃素的含量最高分別提高到對照組的4.04倍和3.79倍，而金絲桃素的含量未發(fā)生變化；徐茂軍等［33］2005年以硝普鈉（SNP）為一氧化氮（NO）的供體，研究外源NO 對金絲桃懸浮細胞生長及金絲桃素生物合成的影響，在細胞培養(yǎng)初期（0 d）加入0.5 mmol/L SNP 并在指數(shù)生長后期（14 d）加入15.0 mmol/L SNP 的金絲桃懸浮細胞在培養(yǎng)25 d 后，細胞的干重和金絲桃素的含量分別為對照組的1.4和1.8 倍，金絲桃素的產(chǎn)量達15.2 mg/L，比對照高3.2倍，證明外源NO 能激活金絲桃素的合成代謝途徑，使金絲桃素的合成加強。但目前這些外源刺激因子的作用機制都尚不明確。

表2 烏腺金絲桃愈傷組織中總黃酮與金絲桃素含量測定結(jié)果

為解決烏腺金絲桃愈傷中金絲桃素含量較低的問題，目前本課題組正在開展相關(guān)生物促進劑的研究，以期最大限度地提高離體材料中金絲桃素的含量。雖然烏腺金絲桃愈傷中金絲桃素含量低于栽培品種的含量，但愈傷組織誘導只需15-20 d，而且每15 d 就可以繼代一次。烏腺金絲桃愈傷組織的培養(yǎng)周期短，可短時間按指數(shù)倍大量繁殖，而且不受生長季節(jié)的限制。綜合考慮，在相同的生長時間內(nèi)，應(yīng)用愈傷途徑最終獲得的烏腺金絲桃生物材料的總量要遠遠高于依靠栽培獲得的生物材料。因此其總的金絲桃素含量的積累也明顯高于栽培樣品中金絲桃的含量。因此，離體培養(yǎng)獲得的愈傷組織也可作為金絲桃素的分離提取的生物材料。

4 結(jié)論

本研究以烏腺金絲桃葉片為材料，建立了穩(wěn)定的愈傷組織的培養(yǎng)體系，最適合烏腺金絲桃愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS + 2，4-D 4.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L；分別采用NaNO2-Al（NO3）3比色法及HPLC法對愈傷組織中總黃酮和金絲桃素進行定性分析，愈傷組織中總黃酮含量為 27.99 mg/g，金絲桃素的含量為 0.515 mg/g。

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（責任編輯 馬鑫）

Determination the Content of Total Flavonoids and Hypericin in Callus from Hypericum attenuatum Choisy

Liu Xiaodan1，2Zhang Keqin2Liu Lian1Li Wenchang1
（1. School of Biological Engineering，Jilin Agricultural Science and Technology College，Jilin 132101；2. Key Labratory of Changbai Mountain Animal and Plant Rescources’ Utilization and Protection of Universities in Jilin Province，Jilin 132101）

With fresh leaves as test material， this study established a relatively stable system of callus culture for Hypericum attenuatum Choisy， and determined the content of total flavonoids and hypericin in callus. With MS as the basic culture medium， the effects of different hormone combinations were investigated on callus induction. The results showed that the optimum culture media for callus induction was MS + 2，4-D 4.0 mg/L + 6-BA 0.2 mg/L. The total flavonoids and hypericin of callus were extracted using ultrasonic method， respectively， using UV spectrophotometry and HPLC method for determination total flavonoids content and hypericin content in callus. The results showed that total flavonoids was 27.99 mg/g， and hypericin content was 0.515 mg/g in dry callus.

Hypericum attenuatum Choisy；callus；induction；total flavonoids；hypericin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.015

2014-05-26

劉曉丹，女，講師，研究方向：植物抗逆基因工程；E-mail：liuxiaodan1981@126.com

張克勤，男，教授，研究方向：天然藥物化學；E-mail：kqzhang01@hotmail.com