王文治 楊本鵬 蔡文偉 馮翠蓮 王俊剛 熊國如 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

甘蔗轉(zhuǎn)基因甘露糖篩選系統(tǒng)的建立

王文治 楊本鵬 蔡文偉 馮翠蓮 王俊剛 熊國如 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

以甘露糖作為篩選底物，對甘蔗品種新臺糖22號進(jìn)行臨界篩選濃度測定，獲得愈傷組織的繼代、分化、生根的臨界篩選濃度。而后應(yīng)用含有甘露糖篩選標(biāo)記基因pmi及綠色熒光蛋白報(bào)告基因GFP的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對新臺糖22號的愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。用所測定的臨界篩選濃度先后進(jìn)行繼代、分化、生根篩選培養(yǎng)，獲得抗性植株。對獲得的抗性植株分別進(jìn)行pmi基因和GFP基因的PCR檢測，以及GFP顯微鏡熒光檢測，結(jié)果證實(shí)已成功建立了高效的甘蔗轉(zhuǎn)基因甘露糖篩選系統(tǒng)。

甘蔗轉(zhuǎn)基因；甘露糖；pmi基因；GFP基因

以大腸桿菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶（Phosphomannose isomerase，PMI）基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的篩選系統(tǒng)，有別于編碼抗生素抗性蛋白的基因（如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）及編碼抗除草劑抗性蛋白的基因（如Bar基因）等常用的篩選系統(tǒng)，是一種正向篩選系統(tǒng)，生物安全性好，有很好的應(yīng)用前景［1］。1967年Malca等［2］就發(fā)現(xiàn)了以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上植物細(xì)胞不能正常生長，這是由于甘露糖在己糖激酶的催化下轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖不僅不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝利用，而且當(dāng)積累到一定濃度時就會抑制磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的活性，阻礙了糖酵解途徑，對細(xì)胞的正常生長代謝起到了抑制作用。而在磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）的催化下，6-磷酸甘露糖可以轉(zhuǎn)化為細(xì)胞可以代謝的6-磷酸果糖［3］。因此轉(zhuǎn)入含有pmi基因的植物細(xì)胞能在以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上正常生長，而非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞由于無法利用甘露糖而被抑制生長。自1998年Joersbo等［4］在甜菜上建立了PMI/甘露糖（PMI/Mannose）轉(zhuǎn)基因篩選系統(tǒng)以來，該系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用于多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化篩選。早期研究如Paola等［5］將其應(yīng)用到水稻轉(zhuǎn)基因上，Negrotto等［6］將其應(yīng)用到玉米轉(zhuǎn)基因上。目前，我國科研人員利用該篩選體系獲得轉(zhuǎn)基因植株的作物也很多，如水稻、棉花、番茄、辣椒、雪柑等，覆蓋的作物極其廣泛［7-12］。由此可見，作為一種新型的生物安全性較好的轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記，越來越受到關(guān)注。在甘蔗轉(zhuǎn)基因方面，Jain等［13］通過基因槍轟擊法，在甘蔗上應(yīng)用PMI/Mannose篩選系統(tǒng)，獲得的轉(zhuǎn)化效率為7.4%。我國各個甘蔗研究所也開展了對PMI/Mannose篩選系統(tǒng)的研究，轉(zhuǎn)基因方法基本以基因槍為主，轉(zhuǎn)化效率較低，獲得的轉(zhuǎn)化株系較少［14］。本研究應(yīng)用本研究室成熟的農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立高效的PMI/Mannose甘蔗轉(zhuǎn)基因篩選系統(tǒng)，旨在為今后對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因甘露糖篩選系統(tǒng)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品種、質(zhì)粒和菌株 本研究所用的受體材料為甘蔗主栽品種新臺糖22號，含pmi篩選標(biāo)記基因及GFP熒光蛋白報(bào)告基因的植物表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 ①胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠8 g/L，pH5.8；②胚狀體分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉膠8 g/L，pH5.8；③生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS（大量元素減半，其它成分不變）+NAA 2 mg/L+蔗糖20 g/L+ 椰水100 mL/L+卡拉膠8 g/L+活性炭0.2 g/L，pH5.8。

MR培養(yǎng)基：1/5MS大量元素+MS其他成分+ 2，4-D 1 mg/L+10 mmol/L果糖+10 mmol/L葡萄糖+30 g/L葡萄糖（固體培養(yǎng)基加入卡拉膠8 g/L），pH5.3。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo) 以田間生長良好的甘蔗頂端生長點(diǎn)處的幼葉組織為外植體，經(jīng)酒精及升汞消毒、無菌水沖洗后，于無菌濾紙上吸干其表面的水分后，切成1 mm左右厚度的薄片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于避光條件下進(jìn)行培養(yǎng)至誘導(dǎo)出愈傷組織。

1.2.2 甘蔗愈傷組織繼代、分化、生根的臨界篩選濃度測定 挑取誘導(dǎo)了20 d左右的甘蔗愈傷組織在0%、40%、45%、50%、55%、60%、65%和 70%的甘露糖濃度梯度的愈傷繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)20 d后，以相同甘露糖濃度梯度的分化培養(yǎng)基上再分化生長15 d，觀察發(fā)芽率，測定愈傷繼代與分化的臨界篩選濃度。以0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%的甘露糖濃度的生根培養(yǎng)基對甘蔗小苗進(jìn)行生根培養(yǎng)30 d，測定甘蔗小苗在生根階段的最適篩選濃度。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染菌液的制備 通過凍融法將含有pmi篩選標(biāo)記基因及GFP熒光蛋白報(bào)告基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將經(jīng)PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌在含抗生素的YEP平板上劃線，挑取單菌落接種到5 mL YEP的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，于150 mL三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD為0.6左右，將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，5 000 r/min 離心5 min，棄上清，吸干殘液，用MR液體培養(yǎng)基重懸菌體，最后置于28℃，200 r/min激活2 h，誘導(dǎo)細(xì)菌Vir基因的表達(dá)，作為轉(zhuǎn)化材料的浸染液。

1.2.4 愈傷組織的轉(zhuǎn)化 挑取生長旺盛的愈傷組織于濾紙上吹干使其處于干縮狀態(tài)，于工程菌液中浸泡30 min后，濾去菌液，用濾紙吸干殘液，吹干，轉(zhuǎn)移到MR固體培養(yǎng)基上。共培養(yǎng)3-4 d后，轉(zhuǎn)移到含有甘露糖的繼代培養(yǎng)基上繼代篩選培養(yǎng)20 d后，轉(zhuǎn)移到含有甘露糖的分化培養(yǎng)基上分化篩選培養(yǎng)15 d。待愈傷長出1 cm左右的小苗后，轉(zhuǎn)移至含有甘露糖的生根培養(yǎng)基上生根篩選培養(yǎng)30 d。

1.2.5 抗性小苗分子檢測 當(dāng)在抗性生根培養(yǎng)基上生長旺盛，濃綠的小苗生長至4-7 cm后，按編號剪取小苗葉片組織約10-20 mg左右，剪碎置于eppendorf管中，用CTAB法提取DNA。分別合成篩選標(biāo)記基因pmi和報(bào)告基因GFP的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，擴(kuò)增時設(shè)置正負(fù)對照。并對植株擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測序，檢測擴(kuò)增目的條帶的準(zhǔn)確性。最后統(tǒng)計(jì)篩選標(biāo)記基因pmi和報(bào)告基因GFP的PCR檢測陽性率。

1.2.6 遺傳轉(zhuǎn)化篩選過程的綠色熒光顯微鏡檢測 愈傷組織經(jīng)菌液浸泡侵染及共培養(yǎng)，并進(jìn)行繼代篩選培養(yǎng)20 d后，挑取部分生長良好的抗性愈傷顆粒于熒光顯微鏡中檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)。

當(dāng)抗性愈傷組織進(jìn)行分化篩選培養(yǎng)15 d左右后，挑取分化生長迅速，且葉片濃綠的小苗進(jìn)行綠色熒光顯微鏡檢測。

當(dāng)抗性小苗于生根培養(yǎng)基上生長到一定高度后，剪取小葉片，進(jìn)行綠色熒光顯微鏡檢測。分析3個不同篩選階段綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 愈傷誘導(dǎo)與分化生長的甘露糖臨界篩選濃度測試

愈傷誘導(dǎo)與分化生長的甘露糖篩選濃度測試結(jié)果（圖1）顯示，甘蔗外植體在甘露糖濃度為0%的對照培養(yǎng)基上誘導(dǎo)30 d后繼續(xù)分化生長15 d，愈傷生長良好，愈傷分化能力達(dá)100%。當(dāng)甘露糖濃度加大到55%時，愈傷分化能力為20%。當(dāng)甘露糖濃度為60%時，愈傷分化能力低于10%，基本失去了分化能力。當(dāng)甘露糖濃度≥65%，愈傷組織100%失去分化能力。因此在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化篩選時，甘露糖篩選濃度應(yīng)為60%。

圖1 愈傷繼代生長與分化生長的甘露糖篩選濃度測試

2.2 甘蔗小苗生根階段甘露糖臨界篩選濃度測試

如圖2所示，甘蔗小苗在甘露糖為0%的對照生根培養(yǎng)基上生長正常，根系發(fā)達(dá)。在甘露糖濃度為10%和15%的生根培養(yǎng)基上，部分小苗依然能正常生長，但根系已不如對照發(fā)達(dá)。當(dāng)甘露糖濃度加大到20%或20%以上時，小苗已經(jīng)無法正常生長，大部分葉片發(fā)黃，部分依然為綠色的葉片也表現(xiàn)出扭曲狀，細(xì)小而無法伸長生長，根系更是明顯受到抑制。因此在遺傳轉(zhuǎn)化時，小苗的生根培養(yǎng)甘露糖篩選濃度應(yīng)為20%。

2.3 遺傳轉(zhuǎn)化與篩選

甘蔗外植體經(jīng)消毒切成薄片置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30 d后，逐漸形成生長旺盛，分化能力極強(qiáng)的愈傷組織（圖3）。經(jīng)菌液浸泡過后的愈傷組織，進(jìn)行20 d的黑暗篩選培養(yǎng)后進(jìn)行15 d的光照分化篩選培養(yǎng)，甘露糖的篩選濃度為60%。篩選結(jié)果（圖4）顯示，大部分愈傷組織停止生長且無法分化出小芽，而小部分愈傷組織依然能健康生長，且在光照條件下能迅速分化成苗。挑取健康分化的芽叢于生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，甘露糖篩選濃度為20%。經(jīng)過黑暗篩選及分化篩選后能迅速分化出來的小芽在生根篩選培養(yǎng)基上80%左右都能快速生長，且根系發(fā)達(dá)，而小部分的小芽無法生長，或生長緩慢，葉片偏黃。圖5為快速生長的抗性植株，葉片濃綠健康。

2.4 抗性小苗的分子檢測

生根培養(yǎng)到適當(dāng)高度以后，首先進(jìn)行篩選標(biāo)記基因pmi的PCR檢測。結(jié)果（圖6）顯示，所選的23株抗性植株中除4、5和6號外，其余20株均為陽性，陽性率為87%。同時對這23株抗性植株的熒光標(biāo)記基因GFP進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果（圖7）顯示，23株抗性植株中17株為陽性，陽性率73.9%。與篩選標(biāo)記基因pmi基因的PCR檢測相比，除4、5和6號抗性植株同為陰性外，11、21和22號也表現(xiàn)為陰性。說明在遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，基因片段出現(xiàn)斷裂缺失現(xiàn)象，而因篩選過程是針對pmi基因進(jìn)行篩選的，所以得到的抗性植株中pmi基因的陽性率高于GFP基因。

2.5 遺傳轉(zhuǎn)化篩選過程的綠色熒光顯微鏡檢測

對遺傳轉(zhuǎn)化過程中繼代、分化、生根3個篩選階段進(jìn)行綠色熒光顯微鏡檢測。結(jié)果顯示，從繼代篩選培養(yǎng)中挑取的抗性愈傷組織，為不規(guī)則生長的胚性愈傷組織，不受甘露糖篩選的影響生長健康，熒光極強(qiáng)（圖8）；抗性愈傷組織分化篩選培養(yǎng)后分化出來的小苗展示的綠色熒光（圖9）；對生根培養(yǎng)后剪取的葉片組織進(jìn)行綠色熒光的檢測（圖10），左側(cè)紅色葉片為非轉(zhuǎn)基因植株，而顯示綠色熒光的葉片為轉(zhuǎn)基因抗性植株。

圖2 小苗生根生長的甘露糖篩選濃度測試

圖3 愈傷組織誘導(dǎo)

圖4 篩選后的分化培養(yǎng)

圖5 篩選后的生根培養(yǎng)

圖6 篩選標(biāo)記基因pmi的PCR檢測

圖7 熒光報(bào)告基因GFP的PCR檢測

圖8 熒光愈傷

3 討論

本研究在轉(zhuǎn)基因株系的分子檢測中出現(xiàn)了報(bào)告基因與篩選標(biāo)記基因PCR檢測陽性率不一致的現(xiàn)象，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，推測為在遺傳轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)DNA片段缺失的現(xiàn)象［15，16］。報(bào)告基因GFP和篩選標(biāo)記基因pmi在同一個T-DNA區(qū)內(nèi)，因在篩選過程中是針對篩選標(biāo)記基因pmi進(jìn)行篩選的，因而得到的抗性植株中pmi基因的陽性率高于GFP基因。在篩選的過程中愈傷組織的繼代篩選與分化篩選的甘露糖濃度大于生根篩選濃度，主要由于甘蔗根系對甘露糖的敏感性要大于愈傷組織，與其他人的報(bào)道基本一致。此外本研究能迅速建立起甘露糖篩選系統(tǒng)，除本實(shí)驗(yàn)室已積累的研究經(jīng)驗(yàn)外，通過強(qiáng)啟動子啟動報(bào)告基因GFP，并在試驗(yàn)過程輔助予熒光顯微鏡的實(shí)時觀察，也是本研究取得成功的一大因素。

圖9 熒光小苗

圖10 熒光葉片

甘蔗轉(zhuǎn)基因研究上利用甘露糖篩選的報(bào)道已經(jīng)很多。國內(nèi)報(bào)道的基本為基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式，效率比起農(nóng)桿菌介導(dǎo)法來說偏低很多，多次進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化依然只能獲得較少的轉(zhuǎn)基因株系［1］。本研究室通過長期的努力，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，已經(jīng)成功地應(yīng)用在bar基因抗除草劑篩選系統(tǒng)上。而本研究將農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與甘露糖篩選進(jìn)行良好的結(jié)合，轉(zhuǎn)化效率較高。單次轉(zhuǎn)化4 g愈傷組織就能獲得30個以上的轉(zhuǎn)基因株系。同時因?yàn)閜mi甘露糖正向篩選系統(tǒng)有較好的生物安全性，因此本研究所建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因甘露糖篩選系統(tǒng)有很好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究通過對愈傷繼代、分化及生根生長的3個階段進(jìn)行甘露糖臨界篩選濃度進(jìn)行測試，最后確定甘蔗愈傷在繼代與分化階段的甘露糖篩選濃度為60%，而生根生長的篩選濃度為20%。而后通過含有pmi篩選標(biāo)記基因及GFP綠色熒光蛋白基因的植物表達(dá)載體對甘蔗品種新臺糖22號愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以60%的甘露糖篩選濃度進(jìn)行繼代與分化階段的篩選，以20%的甘露糖篩選濃度進(jìn)行生根階段的篩選，最后獲得抗性植株。提取抗性植株的葉片DNA進(jìn)行pmi篩選標(biāo)記基因及GFP綠色熒光蛋白基因的PCR檢測。同時在篩選的過程中輔助予綠色熒光的顯微鏡檢測。結(jié)果均證明本研究可以準(zhǔn)確獲得轉(zhuǎn)基因植株，同時證明本研究室成功建立起了高效的轉(zhuǎn)基因甘蔗甘露糖篩選系統(tǒng)。

［1］高世武， 闕友雄， 郭晉隆， 等.甘露糖篩選系統(tǒng)的建立及在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（5）：789-796.

［2］Malca I， Endo RM， Long MR. Mechanism of glucose counteraction of inhibition of root elongation by galactose， mannose and glucosamine［J］. Phytopathology， 1967， 57：272-278.

［3］Joersbo M， Okkels FT. A novel principle for selection of transgenic plant cells：Positive selection［J］. Plant Cell Reports， 1996， 16：219-221.

［4］Joersbo M， Donaldson I， Kreiberg J， et al. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet［J］. Molecular Breeding， 1998， 4：111-117.

［5］Paola L， Xu DY， Ingo P. Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent［J］. Molecular Breeding， 2001， 7：43-49.

［6］Negrotto D， Beer S， Wenck AR， et al. The use of phosphomannoseisomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants［J］. Plant Cell Reports， 2000， 19：789-803.

［7］梁永亞， 李浩， 段永波， 等.以pmi 為篩選標(biāo)記的水稻轉(zhuǎn)基因研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（17）：10143-10146.

［8］岳建雄， 孟釗紅， 張煉輝， 等.以甘露糖作為篩選劑的棉花遺傳轉(zhuǎn)化［J］.棉花學(xué)報(bào)， 2005， 17（1）：3-7.

［9］彭世清， 陳守才.甘露糖陽性選擇系統(tǒng)的建立及在番茄轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2005， 13（2）：141-144.

［10］黃皓， 雷建軍， 曹必好， 等.利用pmi為篩選基因?qū)苯愤M(jìn)行Bt基因轉(zhuǎn)化的研究［J］.辣椒雜志， 2013， 2：23-28.

［11］曾黎輝， 徐海峰， 王會全， 等. PMI基因最為選擇標(biāo)記的植物表達(dá)載體構(gòu)建及其在雪柑轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2008， 16（5）：858-864.

［12］郭倩倩， 孫熙森， 唐益雄， 等.新型篩選標(biāo)記磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2011， 13（6）：12-19.

［13］Jain M， Chengalrayan K， Abouzid A， et al. Prospecting the utility of a PMI /mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane（Saccharum spp. hybrid）plants［J］. Plant Cell Rep，2007， 26：581-590.

［14］郭鶯， 阮妙鴻， 吳楊， 等.甘蔗轉(zhuǎn)Hc-Pro基因的研究［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（6）：965-971.

［15］朱麗， 傅亞萍， 劉文真， 等.利用共轉(zhuǎn)化和華藥培養(yǎng)技術(shù)快速獲得無選擇標(biāo)記的三價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻［J］.中國水稻科學(xué)，2007， 21（5）：475-481.

［16］Cao MX， Huang JQ， Wei ZM， et al. Agrobacterium-mediated multiple gene transformation in rice using a single vector［J］. J Integr Plant Biol， 2005， 47（2）：233-242.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Establishment of Mannose Selection System in Sugarcane Transformation

Wang Wenzhi Yang Benpeng Cai Wenwei Feng Cuilian Wang Jungang Xiong Guoru Zhang Shuzhen
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops Ministry of Agriculture，Haikou 571101）

In this research the killing curve of mannose was tested at the subculture，differentiation and rooting stages of sugarcane cultivar ROC22. Then the expression cassette containing a pmi selection marker gene and a GFP report gene was transformed into sugarcane embryonic callus by Agrobacterium-mediated method. Resistant plants were obtained after selection by Mannose. The PCR detection result and GFP microscope observation result both show that our lab had established a high efficiency PMI/Mannose selection system in sugarcane transformation.

sugarcane transgenic；mannose；pmi gene；GFP gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.014

2014-06-12

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-20-2-5），Cry1Ac-2A-gna融合基因遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗的研究項(xiàng)目（31101197，2012-2014）

王文治，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：甘蔗基因工程；E-mail：wangwenzhi@itbb.org.cn

張樹珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：zhangshuzhen@itbb.org.cn