萬(wàn)閱齊計(jì)英曾紅韓陽(yáng)韓靜

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110016；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110032）

響應(yīng)面法優(yōu)化香菇多糖的超聲輔助提取工藝

萬(wàn)閱1齊計(jì)英1曾紅1韓陽(yáng)2韓靜1

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110016；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110032）

為了開發(fā)利用香菇資源，采用超聲輔助法提取香菇中的多糖，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取法提取香菇多糖的工藝條件。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲波功率、超聲時(shí)間及料液比為自變量，以多糖得率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken法設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，響應(yīng)面模型與實(shí)際情況擬合良好，能較好地預(yù)測(cè)香菇多糖得率。最佳工藝：超聲波功率300 W、超聲波處理時(shí)間25 min、料液比1∶30，多糖得率25.71%，與理論值（25.55%）相比，相對(duì)誤差較小，為0.63%。與傳統(tǒng)熱水浸提法比較，超聲波提取法多糖得率較高，且耗時(shí)少，是理想的香菇多糖提取方法。

熱水浸提；超聲輔助提?。欢嗵堑寐?；響應(yīng)面優(yōu)化；單因素試驗(yàn)

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.012

香菇多糖（Lentinan）是從香菇中提取的有效活性成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)等各領(lǐng)域?qū)ζ洳粩嗌钊胙芯?，香菇多糖的藥用價(jià)值也不斷被發(fā)掘。研究表明香菇多糖的活性成分β-（1-3）-D葡聚糖對(duì)抑制異源、同源，甚至遺傳性的腫瘤都有效，且毒副作用小［1］。香菇多糖也具有抗病毒、增強(qiáng)人體免疫力等功能，在食品、藥品、保健品等方面具有廣闊的前景［2］。超聲波輔助提取技術(shù)是利用超聲波粉碎技術(shù)，使生藥中心粒徑在5-10 μm以下，細(xì)胞破壁率達(dá)到95%，藥效成分易于提取也易于人體吸收這種新技術(shù)的應(yīng)用，不僅適用于各種質(zhì)地不同的藥材，而且可使其中有效成分直接暴露出來，從而使藥材成分的溶出和起效更加迅速完全。與傳統(tǒng)提取方法相比，具有效率高，能耗低等特點(diǎn)［3］。

目前已報(bào)道的香菇多糖提取包括各種提取方法及各種因素對(duì)其得率的影響，已有的模型也只是單因素對(duì)其多糖得率的影響，各因素之間的交互作用的報(bào)道較少。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法［4］進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析，考察超聲波功率、超聲時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素的交互作用對(duì)香菇多糖得率的影響，旨在為香菇多糖在食品、藥品領(lǐng)域的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

干香菇（市售）、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇等均為分析純。

RRHP200型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：歐凱萊芙（香港）實(shí)業(yè)公司；jy92-2d型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；df-101s集熱式恒溫磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；80-2型離心沉淀機(jī)：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；uv2800pc型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼科儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 干香菇→粉碎→香菇粉末→超聲輔助提取→離心（3 000 r/min）→取上清液→定容，測(cè)量吸光度→計(jì)算香菇多糖得率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取105℃烘干至恒重的葡萄糖2.5 g定容于50 mL容量瓶中，配成50 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2.5、4、5.5和7 mL定容于50 mL容量瓶中配制成0.02、0.05、0.08、0.11和0.14 mg/mL葡萄糖溶液。分別移取上述葡萄糖溶液2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，震蕩搖勻，沸水浴加熱15 min，冷卻30 min，測(cè)定490 nm處溶液的吸光值。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=7.81x-0.081 6，R2=0.994 5。

1.2.3 香菇多糖含量測(cè)定 試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法進(jìn)行香菇多糖含量測(cè)定。具體步驟如下：取2 mL香菇多糖提取液置20 mL具塞玻璃試管中，向溶液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速且與液面垂直加入5 mL濃硫酸，渦旋震蕩，將試管置于30℃水浴加熱20 min，在紫外分光光度計(jì)490 nm處測(cè)量吸光度。將吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得香菇多糖濃度。再將多糖濃度帶入下式計(jì)算得香菇多糖得率。

其中，C是測(cè)得吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，V是提取液的體積，m是原料干重。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 按工藝流程方法提取香菇多糖，選取超聲波功率（100、200、300、400和500 W）、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30、35和40 min、）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）以及反應(yīng)溫度（40℃、50℃、60℃、70℃和80℃）幾個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以香菇多糖得率為考察指標(biāo)，探究各因素對(duì)香菇多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲波功率、超聲時(shí)間、料液比為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析，采用 Box-Benhnken法對(duì)香菇多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表，見表1。

表1 因素和水平Box-Benhnken設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果

圖1 超聲波功率對(duì)香菇多糖得率的影響

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對(duì)香菇多糖得率的影響 超聲波功率對(duì)香菇多糖得率的影響（圖1）表明，隨著超聲功率的增大，香菇多糖得率增大，在 300 W時(shí)多糖得率出現(xiàn)最大值。但超聲功率繼續(xù)增大，香菇多糖得率反而降低。因此選擇超聲功率為300 W進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響 超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響（圖2）表明，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，香菇多糖得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，超過25 min后，多糖得率逐漸下降，在25 min時(shí)出現(xiàn)最大值。圖2顯示，超聲時(shí)間為20 min所對(duì)應(yīng)的多糖得率與25 min所對(duì)應(yīng)的最大值相差不大，考慮到超聲波所產(chǎn)生的耗費(fèi)問題，選擇超聲時(shí)間為20 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響

2.1.3 料液比對(duì)香菇多糖得率的影響 液料比對(duì)香菇多糖得率的影響（圖3）表明，隨著液料比的增加，香菇多糖得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，在液料比為30∶1處，多糖得率趨于平緩?？紤]到節(jié)約原料的問題，選擇液料比為30∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 液/料比對(duì)香菇多糖得率的影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)香菇多糖得率的影響 反應(yīng)溫度對(duì)香菇多糖得率的影響（圖4）表明，隨著反應(yīng)溫度的升高，香菇多糖得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在溫度為60℃時(shí)，多糖得率出現(xiàn)最大值，但圖4顯示，各溫度所對(duì)應(yīng)的多糖得率最大值與最小值間相差不大，因此選擇反應(yīng)溫度為60℃進(jìn)行試驗(yàn)，但不選擇反應(yīng)溫進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)香菇多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken法設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲波功率、料液比、超聲時(shí)間為自變量，香菇多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)軟件設(shè)計(jì)，香菇多糖提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)共有17組，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立和數(shù)據(jù)分析 根據(jù)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件Design-Expert 7.1.3進(jìn)行多元回歸擬合，得到多糖得率（Y）對(duì)試驗(yàn)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負(fù)反映了影響的方向［5］。 由于方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，可以推斷方程代表的拋物面開口向下，因而具有極大值點(diǎn)，可以進(jìn)行優(yōu)化分析［6］。由方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以得出，影響超聲波輔助提取法的香菇多糖得率的因素的主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間，料液比，超聲功率。

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表3）顯示，方程的模型顯著性P＜0.000 1，是極顯著的，說明模型有意義；失擬差＞0. 05，不顯著，即模型與試驗(yàn)值的差異較小說明該模型能解釋97.70%的響應(yīng)值的變化；相關(guān)系數(shù)R2=0.989 9＞0.9，說明該模型擬合程度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差較小，可以用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［7］。表中一次項(xiàng)、交互項(xiàng)和二次項(xiàng)中都有顯著性因素。一次項(xiàng)A、C達(dá)到極顯著水平，B達(dá)到顯著水平；交互項(xiàng)AC、BC達(dá)到顯著水平；二次項(xiàng)A2、B2達(dá)到極顯著水平，C2達(dá)到顯著水平。從表中各因素的F值和P值可知，超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響最大；其次是料液比和超聲功率。

表3 回歸分析表

2.2.3 響應(yīng)面分析圖 根據(jù)回歸方程建立響應(yīng)曲面圖，考察響應(yīng)曲面形狀，分析超聲波功率、料液比、超聲時(shí)間對(duì)響應(yīng)值香菇多糖得率的影響。各因素之間的交互作用對(duì)香菇多糖得率影響的響應(yīng)面圖如圖5-7所示。圖中能夠看出多糖得率（Y）隨超聲時(shí)間的加長(zhǎng)而先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值。料液比的改變也會(huì)不同程度的影響多糖得率（Y）的變化，而超聲功率對(duì)多糖得率（Y）的影響相對(duì)不明顯。響應(yīng)曲面的坡度的陡峭程度說明隨著影響因素的變化，其對(duì)應(yīng)響應(yīng)值的變化情況。而等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［8］。

由圖5可知，響應(yīng)曲面陡峭，表明料液比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)香菇多糖得率影響較大。從等高線形狀可以看出，超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響要大于料液比。

由圖6可知，響應(yīng)曲面較陡峭，表明超聲波功率和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)香菇多糖得率影響較大。從等高線形狀可看出，超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響要大于超聲波功率。

由圖7可知，響應(yīng)曲面也較陡峭，表明超聲波功率和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)香菇多糖得率影響也較大。從等高線形狀可看出，料液比對(duì)多糖得率的影響要大于超聲波功率。

綜上所述，超聲時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響最大；其次是料液比和超聲波功率［9］。

圖5 料液比和超聲時(shí)間的相互影響及等高線分析圖

圖6 超聲波功率和超聲時(shí)間的相互影響及等高線分析圖

圖7 超聲波功率和料液比的相互影響及等高線分析圖

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證模型 通過響應(yīng)面試驗(yàn)分析，確定超聲波輔助提取法提取香菇多糖最佳因素水平為：超聲時(shí)間25 min，料液比1∶30，超聲功率300 W，香菇多糖得率的最大預(yù)測(cè)值為25.55%。在上述條件下，進(jìn)行3組驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 超聲波提取法的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)驗(yàn)證，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間擬合較好，誤差在允許范圍內(nèi)，說明利用響應(yīng)面法對(duì)熱水浸提法和超聲提取法提取香菇多糖的結(jié)果分析是可行、有效的［10］。

2.3 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)方法的比較

由單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可知，熱水浸提法提取香菇多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶17.5、提取時(shí)間3 h、提取溫度80℃，在此條件基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果得香菇多糖得率為20.57%。超聲波輔助提取法與熱水浸提法提取香菇多糖的比較（表5）表明，超聲輔助提取法與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，香菇多糖得率具有明顯提高的同時(shí)，其提取時(shí)間和反應(yīng)溫度均有減小，因此超聲波輔助提取法較傳統(tǒng)提取方法更有優(yōu)勢(shì)，既節(jié)約了原料，又減少了能耗。

表5 超聲輔助提取與傳統(tǒng)熱水浸提法的比較

3 討論

本研究首先考察了香菇多糖的單因素試驗(yàn)，然后以香菇多糖得率為指標(biāo)，對(duì)超聲提取過程中影響香菇多糖提取的超聲功率、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)因素，采用中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立回歸模型。通過分析各因素的顯著性和交互作用，優(yōu)化得到香菇多糖超聲提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

單因素試驗(yàn)中，多糖得率隨超聲功率、超聲時(shí)間、料液比和溫度的變化趨勢(shì)均為先升高然后下降。溫度的升高，有利于增加溶劑的滲透能力，加快香菇多糖從細(xì)胞向外擴(kuò)散的速率，使得多糖得率升高。溫度過高，會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)影響其生物活性；同時(shí)高溫提取對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)的設(shè)備也提出嚴(yán)格要求［11］；超聲功率的逐漸增大，多糖得率也隨之加大，這是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械剪切作用加強(qiáng)，香菇粉末的細(xì)胞破壞更充分，有助于多糖從細(xì)胞中溶出。超聲功率在300-500 W間，多糖得率下降，主要因?yàn)楫?dāng)超聲功率大于300 W時(shí)，超聲作用進(jìn)一步加速了提取液的流動(dòng)，減少了物料在超聲場(chǎng)中的停留時(shí)間，破壁作用也就隨之減弱，同時(shí)超聲波的剪切作用也會(huì)在一定程度上破壞香菇多糖的結(jié)構(gòu)，從而影響多糖得率［12］；在一定時(shí)間內(nèi)，香菇多糖隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷被溶解出，超聲時(shí)間愈長(zhǎng)，多糖得率越高。但擴(kuò)散達(dá)到平衡后，超聲時(shí)間過長(zhǎng)，香菇多糖得率反而降低，這是因?yàn)槌暡ň哂休^強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)使大分子的多糖斷裂，從而損失增大而影響多糖得率［13］；隨著液料比的增大，香菇多糖得率增加，但當(dāng)液料比超過一定范圍后，多糖得率增加的不再明顯。這是因?yàn)閷?duì)于一定量的香菇粉末來說，溶劑用量的增加，增加了原料與溶劑接觸界面的濃度差，從而提高了香菇多糖與溶劑的擴(kuò)散速度，多糖得率增大。溶劑量太多，顆粒細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等物質(zhì)析出，降低了提取液的固形物含量，不利于以后的分離，且加重了工業(yè)生產(chǎn)中后續(xù)工藝［11］。

試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波法的多糖得率高于傳統(tǒng)熱水浸提法，且超聲波提取法具有快速、節(jié)能、操作簡(jiǎn)便、不改變香菇多糖原有性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。尤其是提取時(shí)間可以縮短5倍，是工業(yè)生產(chǎn)中有價(jià)值的提取工藝。與以往香菇多糖提取的相關(guān)研究［14］相比，本試驗(yàn)超聲輔助提取法提取香菇多糖的提取時(shí)間短，能耗小、提取劑用量少、香菇多糖得率高。

4 結(jié)論

通過Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面（RSM）分析，建立超聲提取香菇多糖的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)香菇多糖得率。利用模型的響應(yīng)面及其等高線，對(duì)影響香菇多糖得率的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討，通過典型分析并考慮到實(shí)際操作的便利性得到的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間25 min、料液比1∶30、超聲功率300 W，在此優(yōu)化條件下，香菇多糖得率的理論值為25.55%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行3次，測(cè)得超聲提取香菇多糖的驗(yàn)證試驗(yàn)，香菇多糖得率分別為：25.52%、25.92%和25.69%，其平均值為25.71%，與理論值（25.55%）相比，相對(duì)誤差較小，為0.63%。經(jīng)中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析優(yōu)化后，多糖得率平均值比傳統(tǒng)法熱水浸提法提高了5%左右。

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［12］李萍， 孔明航. 超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測(cè)定研究［J］. 農(nóng)產(chǎn)食品科技， 2009， 3（3）：24-28.

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Lentinan by Response Surface Methodology

Wan Yue1Qi Jiying1Zeng Hong1Han Yang2Han Jing1
（1. College of Pharmacy Engineering，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016；2. College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032）

Technological conditions of extraction of Lentinan with ultrasonic extraction are optimized for developing and utilizing the resource of Mushrooms by using the response surface method（RSM）. Firstly， single factor experiment was investigated， and then based on single factor experiment， a 3-factor， 3-level Box-Benhnken experiment was designed， in which ultrasonic power， ultrasonic time and the ratio of solid to liquid were chosen as influencing factors， and the yield of polysaccharide was selected as response value. The result shown that the regression model fit well with experimental data， and it can well predict the polysaccharide yield of Lentinan. The optimum conditions of ultrasonic extraction were ultrasonic power of 300 W， ultrasonic extraction time of 25 min and solid-to liquid ratio of 1∶30， and the polysaccharide yield was 25.71%. Compared with the theoretical value（25.55%）， it has a smaller relative error at 0.63%. Compared with traditional method， ultrasonic extraction method is more efficient and less time consuming， so it is the ideal extraction method of Lentinan.

hot water extraction；ultrasonic assisted extraction method；polysaccharide yield；response surface optimization；single factor experiment

2014-06-11

萬(wàn)閱，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化及制劑；E-mail：wanyue19890830@126.com

韓靜，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：制藥工程技術(shù)（納米、干燥、提取分離）的應(yīng)用；E-mail：huagonglou314@163.com