閆洪波王威李令娣安萬昌

（1.濱州生物技術(shù)研究院，濱州 256600；2.山東民強生物科技股份有限公司，濱州 256600）

原核細胞精氨酸生物合成途徑的研究進展

閆洪波1，2王威2李令娣2安萬昌2

（1.濱州生物技術(shù)研究院，濱州 256600；2.山東民強生物科技股份有限公司，濱州 256600）

原核生物的精氨酸生物合成包含8個酶系，起始于乙酰谷氨酸激酶催化的谷氨酸的乙?；５降谖宀揭阴；鶊F脫離，乙酰谷氨酸通過3個酶的作用，進一步合成乙?；虚g產(chǎn)物。鳥氨酸被氨甲?；晒习彼幔於彼峤槿牒笮纬删辩晁?，最后形成終產(chǎn)物精氨酸。主要就精氨酸生物合成途徑、合成過程中主要酶系及反饋抑制蛋白的作用機制進行了概述。此外，提出了目前精氨酸代謝研究中存在的問題及未來的研究方向。

精氨酸；乙酰谷氨酸合成酶；乙酰谷氨酸激酶；鳥氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶；ArgR

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.003

目前，生物發(fā)酵的氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)主要是通過控制微生物的代謝合成過程來實現(xiàn)，涉及微生物代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制。在精氨酸的微生物發(fā)酵過程中，它既是目標產(chǎn)物處于代謝鏈的下游，也是腐胺、多胺和精胺的合成前體，這些聚胺類物質(zhì)涉及幾個生理過程是機體最佳生長所必須的。此外，當(dāng)?shù)慈狈l件下，通過精氨酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶的作用精氨酸可充當(dāng)微生物生長的氮源［1，2］。目前，國內(nèi)外尚無關(guān)于L-精氨酸生物合成途徑的專一綜述性論文。因此，本文對精氨酸生物合成途徑的研究概述以期為精氨酸發(fā)酵工藝控制與優(yōu)化、發(fā)酵菌種的定向選育及基因工程菌株的構(gòu)建提供理論指導(dǎo)；開拓L-精氨酸的應(yīng)用研究的思路，以及為其在臨床醫(yī)療和運動保健等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 精氨酸的應(yīng)用

高血氨癥是一個臨床難題，可嚴重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要由肝臟疾病或者遺傳性新陳代謝紊亂引起。L-精氨酸是生物體內(nèi)的一種半必需堿性氨基酸，是尿素循環(huán)途徑中重要代謝產(chǎn)物之一，可把高濃度的氨轉(zhuǎn)換為尿素隨尿液排出，從而有效解除血氨中毒［3］。L-精氨酸是一氧化氮的自然前體物質(zhì)，在一氧化氮信號途徑中通過一氧化氮合酶（Nitricoxide synthase，NOS）的催化生成一氧化氮和瓜氨酸，從而具有松弛血管平滑肌的功能［4-7］。此外，其抗腫瘤、治療腎衰竭等免疫功能也成為研究熱點［8-10］。因此，L-精氨酸在醫(yī)療、保健等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

2 精氨酸生物合成途徑概述

在原核細胞內(nèi)，精氨酸的生物合成是涉及連續(xù)的8個酶的催化過程，起始于L-谷氨酸的乙?；饔?，這個反應(yīng)是通過乙酰谷氨酸合成酶（N-acetylglutamate synthase NAGS）催化完成，精氨酸合成的首要步驟要防止谷氨酸環(huán)化及進一步合成脯氨酸［11］。精氨酸起始合成涉及乙酰谷氨酸是大多數(shù)原核生物、真菌、植物（包括單細胞藻類）的重要特征［12］。在乙酰谷氨酸合成之后，通過3個酶催化進一步合成乙酰化中間產(chǎn)物，該過程直到第五步乙?；鶊F脫除生成鳥氨酸。鳥氨酸氨甲?；晒习彼?，而天冬氨酸介入合成了精氨琥珀酸，繼而生成終產(chǎn)物精氨酸［13］。鑒于在所有生物體中精氨酸代謝的重要性以及哺乳動物體內(nèi)精氨酸合成并未涉及乙?；闹虚g產(chǎn)物［14，15］，微生物和植物的精氨酸合成途徑提供了一種潛在的抗菌或滅菌復(fù)合物的開發(fā)機制［16］。

由乙?；鶊F脫離方式的差異，可分為2條不同的精氨酸生物合成途徑。有些細菌（腸桿菌科Enterobacteriaceae、弧菌科Vibrionaceae、黃色黏球菌Myxococcus xanthus和古菌類的硫化葉菌Sulfolobus solfataricus等）使用線性途徑，其特征是通過乙酰鳥氨酸脫乙?；杆庖阴ｘB氨酸生成醋酸和鳥氨酸，在這些生物體內(nèi)，合成路徑第一個酶乙酰谷氨酸合成酶是精氨酸反饋抑制的靶點［17-20］（圖1-A）；其他的細菌（奈瑟氏菌Neisseria spp.和鏈霉菌Streptomyces spp.）包括棒桿菌（Corynebacterium）使用更經(jīng)濟的乙?；h(huán)途徑［21］，通過鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶催化乙?；鶊F從乙酰鳥氨酸到谷氨酸轉(zhuǎn)移，從而使乙酰谷氨酸再次循環(huán)進入精氨酸合成過程，此過程中受到精氨酸反饋抑制的是乙酰谷氨酸激酶（圖1-C）。近幾年，人們在黃單胞菌（Xanthomonas campestris）中發(fā)現(xiàn)一條新穎的精氨酸合成線性途徑［22］，在乙酰鳥氨酸氨甲酰基磷酸酶作用下，鳥氨酸的合成前體乙酰鳥氨酸直接轉(zhuǎn)換為乙酰瓜氨酸，并且推斷乙酰鳥氨酸脫乙?；缸饔糜谝阴９习彼幔怪摮阴；晒习彼幔▓D1-B）。

3 精氨酸生物合成的酶系與基因

在某些細菌（假單胞菌Pseudomonas spp.和藍藻菌Cyanobacterium spp.）中，精氨酸生物合成基因是分散在染色體上的［23，24］，而在另外一些細菌（結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis和谷氨酸棒桿菌C. glutamicum）中是成簇集中的［25，26］。谷氨酸棒桿菌中存在由8個結(jié)構(gòu)基因組成的精氨酸生物合成基因簇argCJBDFRGH，其分別從argC和argG的啟動子開始獨立轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生與之對應(yīng)的兩個有序排列的操縱子argCJBDFR和argGH［26，27］，可編碼從谷氨酸到精氨酸代謝合成必需的所有酶系（圖2-A）。

3.1 乙酰谷氨酸合成酶（NAGS）在精氨酸生物合成中的作用機制

乙酰谷氨酸（N-acetylglutamate，NAG）是哺乳動物細胞內(nèi)肝臟尿素合成所必需的酶輔因子，同時也是微生物和植物細胞內(nèi)精氨酸生物合成途徑最初的中間產(chǎn)物，這一過程是在乙酰輔酶A存在條件下，由乙酰谷氨酸合成酶（NAGS）催化底物谷氨酸完成［28］。采用線性途徑合成精氨酸的細菌或植物細胞內(nèi)，NAGS受到精氨酸的反饋抑制，而哺乳動物細胞內(nèi)NAGS受到精氨酸的正向調(diào)節(jié)［29，30］。

在大多數(shù)微生物中，精氨酸合成途徑的第一步是通過NAGS催化的，人們首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了NAGS的活性［31］，它是一個同源六聚體，其中280個殘基的N端被稱為氨基酸激酶域（Amino acid kinase domain，AAK），類似于乙酰谷氨酸激酶（NAGK）［32-34］，還具有150個殘基的C端GNAT域［29，33］，這兩個結(jié)合域分別是作為精氨酸反饋抑制和催化底物的結(jié)合位點［33］。在NAGS中，3個AAK域二聚物通過N端的螺旋連接成同一的六聚環(huán)狀，相鄰AAK域二聚物均帶有一個GNAT位點［33］。在綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）中，通過改變上述兩個結(jié)構(gòu)域間“短連接器”的長度與順序可以顯著降低甚至消除精氨酸對于NAGS的抑制作用，恢復(fù)適當(dāng)酶活性，這個“連接器”在精氨酸的調(diào)控中具有至關(guān)重要的作用［34］。

圖1 原核細胞精氨酸生物合成途徑［20-22］

圖2 精氨酸生物合成基因簇及ArgR蛋白對其調(diào)控機制［26，27］

3.2 乙酰谷氨酸激酶（NAGK）在精氨酸合成中的作用機制

乙酰谷氨酸激酶（N-acetyl-L-glutamate kinase，NAGK）是氨基酸激酶家族酶系之一，利用ATP催化乙酰谷氨酸（N-acetyl-L-glutamate，NAG）的γ-COO-群組磷酸化生成無水?；姿猁}，且這個過程具有可逆性［35，36］。大腸桿菌的NAGK具有氨基酸家族最典型的結(jié)構(gòu)特征，27 kD亞基的同型二聚體高分辨率結(jié)構(gòu)被測定，復(fù)合物帶有亞胺二磷酸腺苷（AMPPNP）和NAG基質(zhì)（PDB，1GS5）或者帶有二磷酸腺苷（ADP）和硫酸根（PDB，1OHB）［16，35，36］。此外，嗜熱細菌（Thermus thermophilus）、海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的NAGK晶體結(jié)構(gòu)也相繼被測定［37，38］，這對于深入了解NAGK在精氨酸合成途徑中的作用奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

精氨酸生物合成的經(jīng)濟循環(huán)途徑中，argB編碼的乙酰谷氨酸激酶NAGK是精氨酸生物合成一個關(guān)鍵酶，其受到精氨酸的反饋抑制和反饋阻遏［39］。谷氨酸起始的下游代謝主要包括脯氨酸、谷氨酰胺和精氨酸3個途徑。ChIP分析顯示，添加代謝物脯氨酸，特異性減弱了ArgR與argB上游的結(jié)合能力，影響argB基因表達水平，導(dǎo)致鳥氨酸合成代謝增強，這表明argB上游區(qū)域在ArgR蛋白和arg操縱子的相互作用中起重要作用［40］。另有試驗證明，鳥氨酸合成代謝受到ArgR調(diào)控，但其反饋抑制調(diào)控依賴于其與arg操縱子的DNA結(jié)合能力而不是ArgR蛋白的表達水平［41］。近期研究表明，谷氨酸棒桿菌ArgR蛋白在argB啟動子區(qū)的結(jié)合位點是-77到-25，而另一個已被證明也可以結(jié)合到argB啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄抑制子FarR在argB啟動子區(qū)結(jié)合位點是-57到-77，二者結(jié)合域恰好重疊。一個值得注意的現(xiàn)象是，如果ArgR先結(jié)合到argB啟動子區(qū)-77到-25位置，那FarR將無法結(jié)合到argB的啟動子區(qū)域，相反，若FarR先結(jié)合到argB啟動子區(qū)的-57到-77位置，那ArgR將轉(zhuǎn)移結(jié)合到argB啟動子區(qū)-49到-25位置，這表明在NAGK的反饋抑制過程中兩個調(diào)控蛋白間也具有相互作用［42］。

3.3 鳥氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（OAT）在精氨酸生物合成中的作用機制

鳥氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（Ornithine acetyltransferase，OAT）是由argJ基因編碼，最初在人類致病菌奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）中被檢測并進行了基因克隆與序列分析［43-45］。采用經(jīng)濟循環(huán)途徑合成精氨酸的原核生物體內(nèi)，OAT兼具谷氨酸合成酶NAGS與乙酰鳥氨酸脫乙?；福∟-acety-L-ornithine deacetylase，NAO）的功能，在乙?；鶊F的循環(huán)利用過程中發(fā)揮著重要作用，同時argJ編碼的OAT酶會受到鳥氨酸的反饋抑制［39］。隨后多個物種的OAT酶被研究，涉及編碼基因及序列分析、酶學(xué)功能分析、動力學(xué)機制分析和系統(tǒng)進化理論等［12，39，46-48］，有些物種的OAT酶不具有雙重活性，它們無法利用作為乙酰基團來源的乙酰輔酶A［47］。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）OAT具有雙官能團，其活性來自于前體蛋白在高保守ATML序列的丙氨酸（A）和蘇氨酸（T）殘基間自我催化裂解，形成α亞基和β亞基后再聚合成一個異四聚體［48］，β亞基已經(jīng)證實在乙酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中可形成一個乙?；虚g產(chǎn)物［48］。通過定點突變技術(shù)證實Thr97在OAT前體蛋白自我催化裂解而具有催化活性這一過程內(nèi)具有重要作用［48］。在經(jīng)濟循環(huán)途徑中，大多數(shù)的乙酰谷氨酸主要是由OAT催化谷氨酸和乙酰鳥氨酸產(chǎn)生，這種情況下，少量的NAGS在精氨酸合成過程中起到必要的補充功能［11］。

4 ArgR蛋白在L-精氨酸生物合成中起負調(diào)控作用

早期對于ArgR的研究主要圍繞大腸桿菌（E. coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）開展［49-51］，隨后的研究證實ArgR蛋白及其調(diào)控機制在其他多個生物體中保守存在，如綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum）、天藍鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）和結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）等［41，52-54］。

ArgR蛋白是由argR基因編碼，作為精氨酸生物合成的抑制子，其協(xié)同L-精氨酸負調(diào)控精氨酸代謝途徑中酶系的合成［55］。在大腸桿菌（E.coli）中，ArgR是一個典型的反饋調(diào)節(jié)器，可有效傳導(dǎo)胞內(nèi)L-精氨酸信號，二者結(jié)合成為一個共抑制子［56，57］。ArgR不同于細菌里其他抑制子，它以相同16.5 kD多肽構(gòu)成的六聚體形式發(fā)揮功能［55，57］，大腸桿菌（E.coli）精氨酸生物合成的8個結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)域都具有兩個相鄰的18 bp的保守回文序列，這是ArgR結(jié)合的靶標位點，通常稱為ARG盒［58，59］。

谷氨酸棒桿菌的ArgR蛋白也是一個同等亞基聚合而成的六聚體，蛋白分子量為110 kD。對ArgR蛋白序列分析顯示，在N端存在一個“SR”（Ser57-Arg58）基序，這是一個保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA結(jié)合位點；同時在C端存在一個“GTIAGDDTV”基序，是L-精氨酸的結(jié)合位點，其中“DD”殘基是已知的對ArgR蛋白有充分低聚作用［27］。通過體內(nèi)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析，證實了ArgR蛋白與argC、argJ、argB、argD、argF、argR、argG和argH基因上游操縱子位點的相互作用［40］。通過argR基因過表達和基因敲除，證實了谷氨酸棒桿菌的ArgR抑制子在argC和argG的啟動子上的作用（圖2-B）。通過lacZ活性和argR突變分析，L-精氨酸存在的條件下，ArgR作用于argC的啟動子來調(diào)控精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR的轉(zhuǎn)錄。凝膠遷移（EMSA）試驗顯示ArgR的六聚體可直接綁定在argC的啟動子上，也證實了上述結(jié)果，但是argGH的轉(zhuǎn)錄并未響應(yīng)argR抑制和精氨酸的水平［27］。

5 展望

L-精氨酸涉及NO途徑和尿素循環(huán)途徑，同時也是多個蛋白和氨基酸的前體物質(zhì)，因此被廣泛用于醫(yī)藥和保健品的開發(fā)。精氨酸生物發(fā)酵是以微生物的代謝途徑為基礎(chǔ)，通過人工誘變和基因工程改造等手段減弱或消除終產(chǎn)物的反饋抑制，從而實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。通過對多個生物體內(nèi)精氨酸生物合成途徑的研究，目前對于精氨酸的合成代謝途徑了解較為清晰，這為基因工程菌株的構(gòu)建提供了重要的理論依據(jù)［13，27，60］。我國用來產(chǎn)精氨酸的菌種多為谷氨酸棒桿菌、鈍齒棒桿菌和黃色短桿菌的人工誘變菌株［61，62］，因存在產(chǎn)酸量較低，發(fā)酵時間長、糖酸轉(zhuǎn)化率較低和污染嚴重等問題，使規(guī)?；a(chǎn)受困，而定向基因工程改造可以作為解決這些問題的一種有效手段。其次，對于L-精氨酸的對合成代謝過程的反饋調(diào)節(jié)機制的研究需要進一步深化，特別是L-精氨酸對NAGK的反饋抑制、L-鳥氨酸對OAT的反饋抑制、ArgR蛋白對于精氨酸生物合成基因簇的調(diào)控機制，以及該蛋白在生物體其他代謝途徑中的功能與作用的研究對于有效解除L-精氨酸的反饋抑制具有重要的理論指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress of the Arginine Biosynthetic Pathway in Prokaryotic Cells

Yan Hongbo1Wang Wei1，2Li Lingdi1，2An Wanchang2
（1.Binzhou Institute of Biotechnology，Binzhou 256600；2.Shandong Mingqing Biotechnology co.，LTD，Binzhou 256600）

Arginine biosynthesis in prokaryotes consists of eight enzymatic steps， starting with acetylation of glutamate， catalysed by N-acetylglutamate synthase（NAGS）. After metabolisation of N-acetylglutamate， biosynthesis proceeds via three enzymatic steps which form further acetylated intermediates， until the acetyl group is removed in the fifth step of this process. The resulting ornithine is carbamoylated to citrulline. Addition of aspartate leads to N-argininosuccinate， which is finally converted to L-arginine. Here we summarize the arginine biosynthetic pathway， catalytic mechanisms of enzymes and the molecular mechanisms of feedback inhibition of ArgR protein. In addition， we briefly outline existing problems in the research of arginine metabolism and directions for future research.

arginine；NAGS；NAGK；OAT；ArgR

2014-04-18

山東省科技發(fā)展項目（2013GSF12118）

閆洪波，男，博士，研究方向：工業(yè)微生物基因工程改造；E-mail：hongbo_1981@126.com