黎玉順 劉逸泠 劉步倉 穆建強 祝建波

（石河子大學生命科學學院　農業(yè)生物技術重點實驗室，石河子　8320003）

新疆雪蓮水孔蛋白sikPIP1基因的克隆與功能分析

黎玉順 劉逸泠 劉步倉 穆建強 祝建波

（石河子大學生命科學學院農業(yè)生物技術重點實驗室，石河子8320003）

利用PCR技術從已建立的新疆雪蓮cDNA文庫中克隆雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1，構建植物表達載體pBI121-sikPIP1，利用農桿菌介導法獲得轉基因煙草，PCR和RT-PCR檢測證明該基因成功導入并得以轉錄，并對檢測結果均為陽性的植株通過水分脅迫和溫度脅迫進行抗旱性和抗寒性分析。結果顯示：（1）克隆得到長為880 bp，具有水孔蛋白特性的sikPIP1基因，完整ORF為840 bp。（2）水分脅迫中，斷水7 d后轉基因煙草生長表型明顯優(yōu)于野生型煙草，生理指標測定結果顯示，轉基因煙草的相對電導率和丙二醛含量均低于野生型煙草，相對含水量高于野生型煙草。（3）不同溫度脅迫處理，轉基因煙草表型顯著優(yōu)于野生型，特別是0℃以下低溫脅迫，野生型煙草出現(xiàn)嚴重的萎蔫，而轉基因煙草受傷害程度較輕；生理指標結果顯示轉基因煙草相對電導率、丙二醛含量低于野生型煙草。結果表明，轉sikPIP1基因提高了煙草抗旱能力和抗寒能力。

新疆雪蓮；水孔蛋白；sikPIP1基因；煙草；抗寒性；抗旱性

水分是限制陸地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的主要環(huán)境因子，而植物自身對水分的調節(jié)能力決定了它們對環(huán)境壓力的耐受性，很多環(huán)境因子如干旱、鹽堿和極端溫度都將影響植物各種生理過程中對水分的吸收、轉運、儲存和利用。水孔蛋白（Aquaporins，AQPs）是廣泛存在于動物、植物、微生物細胞膜上轉運水分子的特異通道蛋白，屬于MIP（Major intrinsic protein）家族。人們最早在動物中發(fā)現(xiàn)并命名為AQP［1］，主要是研究它的水通道作用。然而在對植物AQP的研究中發(fā)現(xiàn)AQPs不僅能特異性的轉運水分子［2，3］，還能轉運甘油、H2O2、尿素、NH3、CO2等多種物質［4-8］，并且對植物的生長、發(fā)育、適應環(huán)境變化等方面［9-12］也有著重要的作用。在植物基因組研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥中有35個AQPs、水稻有33個AQPs、玉米36個AQPs，苔蘚23個AQPs，番茄37個AQPs、白楊55個AQPs［13-15］根據(jù)氨基酸序列的同源性及結構特征，植物AQP通常分為5類：質膜內在蛋白（Plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）；液泡膜內在蛋白（Tonoplast intrinsic proteins，TIPs）；類 Nod26 膜內在蛋白（Nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs）存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上；小分子堿性膜內在蛋白（Small and basic intrinsic proteins，SIPs）； 以及類 GlpF（Glycerolfacilitator） 膜 內 蛋 白（GlpF-like intrinsic proteins，GIPs）［16］。質膜內在蛋白（PIPs）作為AQP家族中的重要成員之一，包含PIP1和PIP2兩個子類。研究表明，它們不僅參與細胞對外界水分的選擇性運輸，而且對植物生長過程中的干旱、低溫等脅迫都有重要的作用［17-20］。Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)在酵母細胞和擬南芥中過表達棉花GhPIP2；7基因能顯著提高其對干旱的耐受能力。李嶸等［22］在水稻中過表達 OsPIP2；6，在干旱、低氧、高鹽等逆境脅迫下轉基因植株耐受能力均顯著高于野生型，植株中OsPIP2；6的表達量也明顯增高。Matsumoto等［23］發(fā)現(xiàn)PIP1過表達水稻植株比野生型對寒冷有更強的耐受。

新疆雪蓮（Sasussured involucrata Kar. et Kir），屬菊科（Compositae）菜薊族（Trib. Cynareae Less.）鳳毛菊屬（Saussurea DC.）雪蓮亞屬；多年生一次性開花結實的高山冰緣宿根草本植物。主要生長在海拔2 400-4 100 m的高山冰漬石、流石灘、石隙、懸崖峭壁以及沙質濕地中［24，25］。新疆雪蓮能在常年低溫、低氧、強紫外且氣候復雜多變的情況下完成生活史，其自身形成了一套與環(huán)境相適應的響應機制，并且在抵抗的過程中自身也具有與之有關的抗逆基因［26-28］，從而使雪蓮得以適應環(huán)境。因此，對天山雪蓮基因功能的研究，不僅可以了解天山雪蓮特殊的生理機能，而且通過基因工程手段將天山雪蓮的基因轉入農作物中，對培育抗逆作物也提供了一種有效的途徑。

目前，針對PIPs的研究大多是關注其水分運輸以及逆境脅迫下的內源表達，對單個基因的功能，以及外源表達研究較少。為進一步研究質膜內在蛋白基因PIPs與低溫、干旱的關系，本研究從新疆雪蓮cDNA文庫中克隆質膜內在蛋白基因sikPIP1，構建植物表達載體pBI121-sikPIP1，通過農桿菌介導轉化煙草，水分脅迫進行抗旱性分析和冷凍脅迫進行抗寒性分析，旨在進一步了解sikPIP1基因對逆境的耐受性，從而為水孔蛋白研究和利用提供理論依據(jù)與奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、農桿菌GV3101、植物表達載體pBI121、‘NC89’野生型煙草（Nicotiana tabacum L.）由石河子大學生命科學學院農業(yè)生物技術重點實驗室保存?？寺≥d體pGM-T Easy購自天根生物公司。其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑，引物合成、測序均由上海生物工程公司進行。

1.2 方法

1.2.1 sikPIP1基因的克隆 從已建立的天山雪蓮cDNA文庫中隨機挑取單克隆，采取通用引物M13進行PCR擴增并測序。選擇與水孔蛋白基因同源的序列作為模板，利用Primer5.0設計PCR引物PP1和PP2。PP1：5'-TGCTCTAGAGCATGAGTTTTAGAG AGAGAAATGTCG-3'（Xba I），PP2：5'-TGCGAGCTCATTAATTTGTAGCATTGCTTCTGA-3'（Sac I）。采用Tiangen公司的Trizol總RNA提取試劑，提取天山雪蓮的總RNA，以Oligo dT為引物將RNA反轉錄成cDNA，以PP1和PP2為引物進行PCR擴增。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，61℃復性30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，目的片段命名為sikPIP1；使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因；將回收的目的片段連接至載體pGM-T Easy，將陽性克隆命名為pGM-sikPIP1；酶切鑒定后送上海生工測序。利用DNAman軟件分析測序結果序列，確定開放閱讀框，推導相應的多肽序列。蛋白質氨基酸比對在NCBI的BlastT中分析；運用Mega軟件對推導的多肽序列與已知報道的植物氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析。

1.2.2 植物表達載體的構建與轉化 用Xba I/Sac I雙酶切重組質粒pGM-sikPIP1和植物表達載體pBI121，1%的瓊脂糖凝膠電泳后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因和載體大片段。兩片段經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過夜，重組子轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，含卡那霉素（60 mg/L）的平板培養(yǎng)過夜，挑選單菌落培養(yǎng)，PCR檢測，提取PCR檢測為陽性質粒并進行酶切鑒定。鑒定為雙陽性的質粒即是pBI121-sikPIP1，將重組質粒用電擊法轉入農桿菌GV3101。

1.2.3 轉基因煙草的獲得及鑒定 經(jīng)農桿菌pBI121-sikPIP1/GV3101介導葉盤法轉化煙草‘NC89’，獲得再生植株，移栽入營養(yǎng)土中。采用CTAB法提取再生煙草植株的基因組DNA，以pBI121-sikPIP1質粒為陽性對照，野生型受體DNA 為陰性對照，對目的基因進行PCR檢測。用TRIzol法提取PCR檢測結果為陽性的煙草植株以及受體煙草的總RNA，采用RT-PCR檢測目的基因的轉錄水平。

1.2.4 轉基因煙草水分脅迫實驗 選擇室內培養(yǎng)2個月，長勢相近的野生型煙草和來自不同株系的轉sikPIP1煙草各3株。實驗前充分澆水，待底部托盤無水分進出時開始計時，進行自然干旱處理。停止供水13 d，第14天復水，實驗共進行16 d。從第1天斷水開始，每隔3 d根據(jù)李合生［29］的方法測量一次相對電導率、丙二醛、葉片相對含水量，實驗重復3次，并記錄煙草形態(tài)變化。

1.2.5 轉基因煙草冷凍脅迫實驗 整體植株的冷凍處理，選擇室內培養(yǎng)2個月，長勢相近的野生型煙草和來自不同株系的轉sikPIP1煙草各3株，分別放入4℃、0℃、-2℃和-4℃的生化培養(yǎng)箱進行冷凍脅迫，4℃處理12 h，0℃、-2℃和-4℃處理4 h。記錄各階段煙草形態(tài)變化，測定煙草相對電導率和丙二醛含量，實驗重復3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)處理均用Excel2003和SPSS Statistics軟件分析處理，氨基酸序列分析用DNAman、Mega以及在線工具完成。

2 結果

2.1 s ikPIP1基因的克隆與分析

以天山雪蓮cDNA為模板，利用設計好PCR引物PP1和PP2進行RT-PCR擴增，獲得大小約為880 bp DNA片段，將目的片段sikPIP1克隆于pGM-T Easy載體，獲得pGM-sikPIP1，用Xba I/Sac I雙酶切鑒定，證明新疆雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1克隆成功。測序結果分析表明，sikPIP1基因的最大開放閱讀框為840 bp，編碼279個氨基酸，分子量為29.01 kD，pI為9.26。

圖1 sikPIP1的氨基酸序列

目前研究發(fā)現(xiàn)在PIP、TIP、NIM和SIP四個亞家族中都具有共同的特征，即都有6個跨膜區(qū)、較短的保守AA基序PA和信號序列SGXHXNPAVT［30］。序列分析（圖1）表明，sikPIP1不但具有MIP家族信號序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPAR-SI/FGAAI/VI/VF/YN［12］。此外，序列分析還表明sik-PIP1具有一個PKA磷酸化位點（Ser113）和一個PKC的磷酸化位點（Ser186）。

根據(jù)推定的天山雪蓮質膜水孔蛋白基因sikPIP1多肽序列在NCBI進行BLAST比對，挑選同源性高的比對結果，利用Mega軟件構建不同物種間植物水孔蛋白基因的分子進化樹（圖2）發(fā)現(xiàn)，該蛋白與葡萄（Vitis vinifera）、無梗花櫟（Quercus petraea）、甜菜（Beta vulgaris）親緣關系最近，此外還與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、胡桃（Juglans regia）等不同科屬間植物親緣關系較近，說明水孔蛋白基因在物種間進化比較保守，比對發(fā)現(xiàn)這些基因多為PIP2亞家族，因此可推測雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1也應屬于PIP2亞家族。

圖2 sikPIP1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 植物表達載體pBI121-sikPIP1的構建

用Xba I/Sac I雙酶切植物表達載體pBI121和陽性克隆載體pGM-sikPIP1，構建植物表達載體pBI121-sikPIP1。提取PCR鑒定為陽性菌落的質粒，用Xba I/Sac I進行雙酶切鑒定（圖3），證明植物表達載體pBI121-sikPIP1構建成功。構建成功的植物表達載體通過電擊法轉化農桿菌GV3101，挑選單菌落進行PCR鑒定（圖4）。

2.3 轉基因煙草的獲得及鑒定

以野生型煙草“NC89”為受體，用農桿菌pBI121-sikPIP1/GV3101介導轉化，經(jīng)卡那霉素篩選獲得抗性再生植株，移栽入營養(yǎng)缽。對移栽煙草植株進行PCR（圖5）和RT-PCR鑒定（圖6）。將鑒定結果均為陽性的煙草進行進一步的生理指標測定。

圖3 pBI121-sikPIP1質粒酶切鑒定

圖4 pBI121-sikPIP1/GV3101 PCR檢測

圖5 pBI121-sikPIP1轉基因煙草PCR檢測

圖6 pBI121-sikPIP1轉基因煙草RT-PCR檢測結果

2.4 水分脅迫下轉基因煙草的形態(tài)特征及生理指標

2.4.1 形態(tài)特征 斷水后7 d野生型煙草基部開始出現(xiàn)輕度萎蔫，葉片由下而上開始出現(xiàn)黃化，第10天已經(jīng)嚴重萎蔫，第13天野生型煙草整株萎蔫；而轉基因煙草第10天才出現(xiàn)輕度萎蔫現(xiàn)象，第13天葉片中度萎蔫（圖7），復水2 d后轉基因煙草恢復情況明顯優(yōu)于野生型煙草?？梢姡D雪蓮sikPIP1基因煙草比對照野生型煙草表現(xiàn)出更強的耐旱性。

圖7 水分脅迫下野生型煙草與轉sikPIP1基因煙草的形態(tài)特征

2.4.2 生理指標 對水分脅迫下各階段轉sikPIP1基因煙草和野生型對照煙草的相對電導率、丙二醛（MDA）含量、相對含水量進行檢測，結果（圖8）表明，轉基因煙草在水分脅迫中表現(xiàn)出較強的抗旱性。除第1天外，轉基因煙草的相對電導率和MDA含量均低于野生型煙草，隨著脅迫時間的增長，轉基因煙草和野生型煙草的相對電導率和MDA含量都呈逐漸上升趨勢，但野生型增加幅度和速度均大于轉基因煙草，且差異顯著（P＜0.05）。轉基因煙草的葉片相對含水量則高于野生型煙草，隨著脅迫時間的延長，轉基因煙草和野生型煙草的相對含水量均表現(xiàn)出下降趨勢，野生型下降速度和幅度均大于轉基因煙草。結果表明，轉基因煙草比野生型煙草有更強的耐旱性。生理指標變化與形態(tài)特征變化保持一致，表明外源導入雪蓮sikPIP1基因，能夠提高煙草抗旱性，減少水分虧缺對植物的傷害。

2.5 溫度脅迫對轉基因煙草形態(tài)特征和生理指標的影響

2.5.1 形態(tài)特征 4℃處理12 h野生型煙草與轉基因煙草表型均無明顯變化，0℃處理4 h野生型煙草葉片出現(xiàn)少量傷斑，轉基因煙草仍無明顯變化；-2℃處理4 h轉基因煙草葉片出現(xiàn)傷斑，組織出現(xiàn)輕微疲軟，野生型煙草葉片嚴重萎蔫；-4℃處理4 h轉基因煙草出現(xiàn)中度萎蔫，野生型煙草出現(xiàn)整株萎蔫（圖9）。表明轉入sikPIP1基因能提高煙草對低溫的耐受能力。

圖8 水分脅迫下野生型煙草和轉基因煙草植株的生理指標變化

圖9 不同溫度脅迫下野生型煙草和轉sikPIP1基因煙草的形態(tài)特征

圖10 溫度脅迫下野生型煙草和轉基因煙草植株的生理指標變化

2.5.2 生理指標 在溫度脅迫實驗中，對不同溫度處理的野生型煙草和轉基因煙草進行電導率和丙二醛含量的測定（圖10）。全過程中野生型煙草的相對電導率和MDA含量都高于轉基因煙草，且隨著溫度的降低野生型煙草和轉基因煙草的相對電導率和MDA含量均呈上升趨勢；4℃處理下野生型煙草與轉基因煙草的相對電導率和MDA差異均不大；但在0℃、-2.0℃和-4.0℃處理下，野生型煙草的電導率和MDA上升速度與幅度均高于轉基因煙草，且差異顯著（P＜0.05）。表明轉基因煙草膜脂受傷程度較低，抗寒性相對較高，與形態(tài)特征結果保持一致，說明轉入雪蓮sikPIP1基因能提高煙草對低溫的耐受性，降低植物在低溫中的傷害。

3 討論

AQP作為重要的生物膜功能蛋白，參與了多種重要的生理過程。其調節(jié)機制主要分為兩種：一是通過調節(jié)AQP活性進行調節(jié)（如磷酸化、激素和Ca2+等）；二是改變膜上AQP數(shù)量進行調節(jié)。近年來植物AQP的相關研究備受關注，越來越多的植物AQP被成功分離、并進行功能分析和調控機理的解析。植物AQP在受到不同環(huán)境因子或存在物種差異等因素時，往往表現(xiàn)出不同的反應，因此研究植物AQP在植物對不同環(huán)境因子（尤其是對水分和溫度）適應中所起的作用就具有重要的意義。

AQP對于植物的最主要作用是水分運輸，在水分虧缺情況下，AQP在植物應對水分脅迫的應答機制中起著重要的作用。Aharon等［31］通過對轉入擬南芥PIP1b的轉基因煙草研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，轉PIP1b煙草長勢優(yōu)于對照，在干旱脅迫下，PIP1b超表達為負作用，植株萎蔫速度快于對照。本研究對轉新疆雪蓮sikPIP1基因煙草干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，轉基因植株抗旱能力明顯優(yōu)于對照，這與李嶸等［22］和Zhang等［21］外源表達PIP基因結果一致。說明AQP在植物響應水分脅迫時表現(xiàn)出不同的功能。

目前對植物低溫耐受性研究主要集中在冷害（0℃以上低溫）的研究中，本研究選擇耐寒植物新疆雪蓮為材料克隆水孔蛋白sikPIP1基因并轉化煙草，結果發(fā)現(xiàn)轉基因煙草抗寒（冰點以下低溫）能力明顯增強，這一結果與焦天奇等［26］克隆的雪蓮水孔蛋白sikPIP3基因在煙草中表達結果一致，Lin等［32］在擬南芥中表達另一種耐寒植物人參的液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1結果發(fā)現(xiàn)，過表達PgTIP1基因提高擬南芥的抗鹽和抗旱能力，并展示出了更低的耐受溫度。干旱和低溫主要影響植物對水分的運輸，在前人外源表達PIP1與PIP2基因的研究中發(fā)現(xiàn)PIP2基因比PIP1基因有更強的水通道特性，而PIP1與PIP2形成的異源四聚體比PIP2形成的同源四聚體也有更高的水透性，這一結果在水稻和玉米中都得以證實，說明PIP1與PIP2基因間存在協(xié)同作用［23，33］，而雪蓮的PIP1基因與PIP2基因間是否也存在這種協(xié)同作用，同時外源表達這兩個基因能否進一步提高植株的抗逆能力，選擇抗逆性強的基因材料來源是否可以表現(xiàn)出內源表達相似的結果，并且sikPIP1基因是否與其他抗逆基因間也存在這種協(xié)同作用值得我們進一步研究。

4 結論

本研究克隆了新疆雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1，并成功轉化煙草。對獲得的轉基因植株進行逆境脅迫實驗，結果表明，與野生型相比較，轉sikPIP1基因煙草顯著增強了對干旱和低溫逆境條件的適應性。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Function Analysis of Aquaporin Protein Gene sikPIP1from Saussurea involucrata Kar. et K ir

Li Yushun Liu Yiling Liu Bucang Mu Jianqiang Zhu Jianbo
（Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，College of Life Science，Shihezi University，Shihezi8320003）

Saussurea involucrata aquaporin protein gene sikPIP1was cloned from established cDNA library by PCR technique. Then a plant expression vector of pBI121-sikPIP1was constructed and transgenic tobacco plants were obtained by Agrobacterium-mediated method. The analysis by PCR and RT-PCR indicated that the aquaporin protein gene sikPIP1had been integrated and transcribed into the tobacco genome. The drought and cold resistance by water stress and low-temperature stress for the positive plants from above PCR and RT-PCR examination were analyzed. The results showed that：（1）The plasma membrane aquaporin gene sikPIP1was cloned with the length of 880 bp and complete ORF of 840 bp. （2）Under the water stress， the growth phenotype of transgenic tobacco was evidently better than wild-type after 7 days’ waterbreak， the results of physiological index showed that relative conductivity and MDA content of transgenic tobacco were lower than those of wild-type. However， the relative water content of transgenic tobacco was higher than that of wild-type. （3）The growth phenotype of transgenic tobacco was significantly better than that of wild-type under the different temperature stress. Especially below the 0 degree， the wild-type ones were wilting seriously， however， the transgenic tobacco had less damages. The results of physiological index showed that relative conductivity and MDA content of transgenic tobacco were lower than that of wild-type. The testing results showed that sikPIP1gene improved tobacco’s tolerance of drought and cold.

Sasussured involucrate；aquaporin protein；sikPIP1gene；tobacco；drought tolerance；cold tolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.013

2015-01-27

國家自然科學基金項目（C020406，C020407）

黎玉順，男，碩士研究生，研究方向：植物適應逆境的分子機理；E-mail：liyushunshz@163.com

祝建波，男，研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：zjbshz@163.com