韓亞偉 王西華 陳利平 時桂芹 孫麗萍 周文珊

（鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，鄭州　450001）

NNK對NCTC 1469細胞毒性作用的研究

韓亞偉 王西華 陳利平 時桂芹 孫麗萍 周文珊

（鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，鄭州450001）

研究4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）對小鼠肝細胞NCTC 1469細胞的毒性作用。利用MTT比色法檢測5個不同NNK濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）對細胞的毒性作用；倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；實時熒光定量PCR檢測凋亡基因Bcl-2和Bax的表達。MTT顯示，NNK能降低NCTC 1469細胞存活率，并呈劑量和時間依賴性。鏡檢結果可見細胞皺縮，密度降低；流式細胞儀檢測顯示，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的NNK作用24 h后凋亡率分別為（16.79±2.01）%、（26.87±1.67）%、（41.78±3.19）%、（50.89±3.94）%和（65.86±4.54）%，顯著高于對照組（7.46±1.58）%；熒光定量PCR結果顯示，隨著NNK濃度的增加，Bcl-2 mRNA的表達減少，Bax mRNA的表達逐漸上升。NNK能夠降低NCTC 1469細胞存活率并誘導其凋亡，作用呈劑量和時間依賴性。

NNK；NCTC 1469細胞；細胞凋亡；流式細胞儀

卷煙煙氣的化學成分多達3 800多種［1］，其中大多數(shù)成分是無害的，只有少數(shù)有害［2］。弄清楚這些有害成分的致病作用機制及其抑制途徑，對于保護卷煙消費者的健康具有重要意義。煙草特有亞硝胺（TSNAs）是由煙草內(nèi)源性生物堿通過亞硝胺化作用而產(chǎn)生的，是只存在于煙草、煙草制品和煙草煙氣中的亞硝胺類化合物。到目前為止，尚未在其他食品中發(fā)現(xiàn)［3］。有關TSNAs的研究報道很多，不僅是因為它們是煙草制品的主要有害成分之一，它還對機體健康造成極大危害，有證據(jù)表明，TSNAs與肺部、口腔、食道、胰臟、肝臟等部位發(fā)生的病變有關［4］。而4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）是TSNAs中含量高、致癌能力強的一種烷化劑類致癌物［5］，是卷煙主流煙氣的代表性有害成分之一［6，7］，國際癌癥組織將其列為一級致癌物［8］。實驗研究證實，NNK可誘發(fā)多種動物的多種腫瘤發(fā)生。我們研究組所構建的小鼠毒理模型顯示，吸煙和灌胃的動物模型中，對小鼠的肺部細胞和肝部細胞損傷最大［9，10］。鑒于報道的動物體內(nèi)實驗及我們前期研究的結果，本實驗以體外培養(yǎng)小鼠正常肝細胞（NCTC 1469細胞）為研究對象，采用四氮唑鹽比色分析法（MTT法）和流式細胞儀檢測細胞凋亡，觀察不同劑量NNK對NCTC 1469的細胞毒性及凋亡情況，為進一步研究NNK誘導肝細胞損傷奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肝細胞NCTC 1469購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；NNK購自Toronto Research Chemicals Inc；DMEM培養(yǎng)液、噻唑藍、胰蛋白酶購自Solarbio公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自寶生物大連有限公司；CO2培養(yǎng)箱HF160W（Heal Force）；倒置相差顯微鏡（Observer A1，Zeiss）；流式細胞儀（Becton-Dickinson，F(xiàn)ACS Calibur）；酶標儀（GENEios Plus，TECAN）；熒光定量PCR（Stepone Plus，ABI）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞株于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于試驗研究。

1.2.2 NNK對細胞毒性作用的檢測 采用MTT比色法，用DMEM（含10%新生小牛血清）培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，以1×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL細胞懸液，置37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h后棄原培養(yǎng)液，再分別加入含NNK濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的新鮮DMEM培養(yǎng)液200 μL，陰性對照組加入不含NNK的等量完全培養(yǎng)基。同時設空白組對照調(diào)零，空白對照組除不加細胞外其余條件與陰性對照組相同，每組均設5個平行孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24和36 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液 20 μL，孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL/孔振蕩10 min后，檢測490 nm波長下吸光度值（A）。按公式計算各組細胞存活率，細胞存活率=［（實驗孔A值-空白孔A值）（/對照孔A值- 空白孔A值）］×100%。實驗重復3次。

1.2.3 NNK脅迫NCTC 1469細胞的形態(tài)觀察 將生長良好的細胞分為對照組（正常培養(yǎng)的細胞）和實驗組，實驗組中分別加入NNK 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，對照組不加NNK，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài)的變化。

1.2.4 細胞凋亡檢測 將對數(shù)生長期的細胞消化接種到六孔板中，次日，待細胞貼壁后，分別加入含NNK濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的新鮮DMEM培養(yǎng)液，同時設立陰性對照組；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至5×105mL，常規(guī)加入Annexin V-FITC及PI染色，流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.5 凋亡基因Bcl-2和Bax的表達 取對數(shù)生長期的細胞分為實驗組和對照組，對照組未加藥物，實驗組加入NNK使其終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，實驗組和對照組NCTC 1469細胞分別用Trizol試劑提取RNA，依照提取試劑盒操作得到白色沉淀，加入0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）40 μL，使RNA完全溶解。紫外分光光度計法測定RNA的A260和A280比值和含量，用DEPC水將各組總RNA調(diào)整至同一濃度，分別逆轉錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR，基因引物序列詳見表1。根據(jù)Ct值計算出內(nèi)參基因和處理組基因的△Ct，再用對照組△Ct-處理組△Ct得到△△Ct，最終根據(jù)2-△△Ct得出處理組樣本基因相對于對照組樣本基因的量。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量指標用±s表示，組間比較用單因素方差分析（ANOVA），檢驗水準α=0.05。

表1 基因引物序列

2 結果

2.1 NCTC 1469細胞形態(tài)學的變化

倒置相差顯微鏡如圖1觀察可見，對照組細胞貼壁生長，細胞排列均勻，大小基本一致，輪廓清晰，懸浮細胞少。隨NNK濃度上升，細胞生長密度逐漸下降，出現(xiàn)細胞皺縮等形態(tài)學改變、細胞數(shù)量及生長密度逐漸減少、細胞顆粒增多。經(jīng)0.1 mg/mL NNK作用24 h后的細胞，正常細胞減少，開始出現(xiàn)細胞碎片。并且隨著NNK濃度逐漸增加，上述變化更加明顯。

圖1 不同濃度NNK作用24 h后NCTC 1469細胞形態(tài)學的改變（200x）

2.2 NNK對NCTC 1469細胞毒性作用

細胞存活率是細胞毒理作用的檢測指標之一，MTT結果（表2）顯示，在不同濃度NNK的作用下，各藥物濃度組細胞存活率與同時間點對照組比較均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。線性回歸分析，存在明顯的劑量-效應關系（12 h∶b= -0.085，P＜0.05；24 h∶b=-0.117，P＜0.05；36 h∶b=-0.138，P＜0.05）。且隨著時間逐漸延長，與同濃度組比較均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？梢姡琋NK能降低NCTC 1469細胞存活率，并呈濃度和時間依賴性。

表2 不同濃度NNK在不同時間作用下對NCTC 1469細胞存活率的影響（%）

2.3 NCTC 1469細胞的凋亡情況

流式細胞儀Annexn V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡如圖2所示，由于晚期凋亡細胞和壞死細胞（右上象限）多為早期凋亡細胞（右下象限）繼發(fā)而來，故將兩者之和記為總體凋亡率。對照組細胞凋亡率僅約（7.46±1.58）%，NNK作用24 h后NCTC 1469細胞的凋亡率分別為（16.79±2.01）%、（26.87±1.67）%、（41.78±3.19）%、（50.89±3.94）%和（65.86±4.54）%。與對照組比較，不同濃度組間凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 NNK對NCTC 1469細胞Bcl-2和Bax基因表達的影響

如圖3所示，隨著NNK作用濃度的增加，NCTC 1469細胞的Bcl-2基因mRNA表達明顯減少，而Bax基因的mRNA表達上升，Bcl-2/Bax比值趨小。

3 討論

吸煙能引起并發(fā)癥已是不爭的事實［11］。香煙中主要的致癌物有兩大類：一是多環(huán)芳烴類，如苯并芘；二是亞硝胺，一支香煙燃燒產(chǎn)生的煙氣中有0.1-0.5 μg NNK［12］，NNK可引起DNA鏈斷裂、堿基突變、DNA加合物形成等，從而導致細胞病變［13-15］。小鼠毒理模型顯示煙氣能夠導致肝部損傷，可能與煙草特有亞硝胺有關。

圖2 NNK體外作用對NCTC 1469細胞凋亡率的影響

本研究之所以選用肝部細胞作為研究對象，主要基于前期的研究基礎，為進一步揭示NNK損傷肝部細胞的機理而展開的。在我們的前期研究中，無論吸煙還是灌胃的毒理模型中均顯示，肺部和肝部是損傷最大的組織。本研究通過NNK對小鼠正常肝細胞NCTC 1469的脅迫作用，并為后期進一步作用機制的研究奠定基礎。MTT結果表明，NNK在體外能顯著降低NCTC 1469細胞的存活率，隨著NNK濃度的加大和作用時間的延長，細胞存活率逐漸下降，提示NNK濃度和時間依賴性地影響細胞存活率。

細胞凋亡是由基因控制細胞主動性自殺過程，其細胞增殖調(diào)節(jié)機制的失控與癌變過程密切相關，且可促進腫瘤的發(fā)生。經(jīng)NNK作用后的NCTC 1469細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，可見細胞生長密度逐漸下降，體積縮小。作用24 h后，有大量不規(guī)則細胞脫落，細胞碎片較多。上述細胞形態(tài)變化說明，NNK對NCTC 1469的脅迫能通過細胞凋亡程序來啟動細胞抑制作用。該研究采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測NNK體外作用對NCTC 1469細胞凋亡的影響。隨著NNK濃度的增加凋亡率逐漸上升，說明NNK通過誘導NCTC 1469細胞程序性凋亡來抑制生長。抑制機制可能有直接損傷細胞膜、影響線粒體的通透性［16］、阻滯細胞周期、降低MMP等。

圖3 不同濃度NNK處理NCTC 1469細胞24 h后Bcl-2和Bax m RNA的表達

細胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，其原因和途徑是復雜多樣的，許多基因共同參與這一過程，包括抗凋亡基因和促凋亡基因。其中Bcl-2家族成員在細胞凋亡的過程中起著至關重要的作用［17］。Bcl-2家族按其功能可分為兩大類：一類是促凋亡基因，代表基因是Bax基因，主要分布于線粒體的外膜上。Bax過度表達可以誘導某些細胞自發(fā)凋亡，且可以 參與并促進其他因素誘導的細胞凋亡。另一類是抗細胞凋亡基因，代表基因是Bcl-2，與腫瘤的發(fā)生和耐藥性密切相關。若Bcl-2和Bax表達量平衡則細胞正常生存，Bcl-2表達水平上升時可以和Bax結合形成異源二聚體抑制細胞凋亡，Bax表達水平上升可形成同源二聚體拮抗Bcl-2的作用，促進細胞凋亡［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度NNK作用NCTC 1469細胞后檢測Bcl-2和Bax基因的表達水平，隨著藥物濃度的上升，Bcl-2基因的mRNA表達量下降，而Bax基因的mRNA表達上升，Bcl-2/Bax比例下降，呈現(xiàn)負相關性的關系，由此說明，NNK誘導NCTC 1469細胞凋亡的機制可能是通過下調(diào)Bcl-2 mRNA和上調(diào)Bax mRNA表達量來實現(xiàn)的。

本實驗是細胞毒理模型初步建立階段，我們選擇經(jīng)典的Bcl-2和Bax基因作為研究對象，雖然mRNA定量PCR結果能反映出NNK能誘導Bcl-2和Bax發(fā)生相應的表達變化，但兩基因翻譯成功能蛋白還需要經(jīng)過轉錄后的修飾和蛋白質翻譯的調(diào)控；如果僅通過Western blot來驗證Bcl-2和Bax表達蛋白的量的變化，既脫離不了常規(guī)的研究方法，又不能對兩基因的調(diào)控機理作以解釋，因此本實驗未利用Western blot驗證兩基因的蛋白水平上的變化，我們正通過其它分子生物學方法研究兩基因的調(diào)控機理，這將在后續(xù)研究結果中加以報道。

4 結論

NNK能降低NCTC 1469細胞存活率，并誘導其凋亡，且通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的相對表達量誘導其凋亡，具體機制及與其它凋亡信號通路的關系有待進一步研究。

［1］毛友安. 卷煙煙氣中煙草特有亞硝胺的新分析技術及其對酶活性影響的研究［R］. 湖南大學博士后研究工作報告. 長沙：2004.

［2］Rodgrman A. The composition of cigarette smoke：problems with lists of tumorigens［J］. Bitr Tabakforsch Int， 2003， 20：402-437.

［3］劉萬峰， 王元英. 煙草中煙草特有亞硝胺的研究進展［J］. 中國煙草科學， 2002， 24（2）：11-14.

［4］Hecht SS. Biochemistry， biology， and carcinogenicity of tobaccospecific N-nirosamines［J］. Chem Res Toxicol， 1998， 11：559-603.

［5］Djordjevic MV， Brunnemann KD， Hoffmann D. Identification and analysis of a nicotine-derived N-nitrosamino acid and other nitrosamino acids in tobacco［J］. Carcinogenesis， 1989， 10（9）：1725-1731.

［6］World Health Organization technical series：No. 95 1. The scientific basis of tobacco product regulation［R］. Genewa：World Health Organization， 2008：69.

［7］謝劍平， 劉惠民， 朱茂祥， 等. 卷煙煙氣危害性指數(shù)研究［J］.煙草科技， 2009（2）：5-15.

［8］International Agency for Research on Cancer（IARC）. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans：V01. 89. Smokeless tobacco and some tobacco-specific N-nitrosamines［M］. Lyon：International Agency for Research on Cancer， 2007：59.

［9］寧維， 陳利平， 李瑜， 等. 卷煙煙氣體內(nèi)安全評價方法研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學， 2013， 42（9）：152-156.

［10］寧維， 陳利平， 李瑜， 等. 全煙氣致小鼠肺損傷模型的建立［J］.煙草科技， 2013， 11：36-40.

［11］鄒小農(nóng). 中國肺癌流行病學［J］. 中華肺癌防治雜志， 2007，14（12）：881-883.

［12］Wynder EL， Hoffmann D. Smoking and lung cancer：scientific challenges and opportunities［J］. Cancer Res， 1994， 54（20）：5284-5295.

［13］Wu X， Zhao H， Suk R， et al. Genetic susceptibility to tobacco related cancer［J］. Oncogene， 2004， 23（38）：6500-6523.

［14］Akopyan G， Bonavida B. Understanding tobacco smoke carcinogen NNK and lung tumorigen- esis［J］. Int J Oncol， 2006， 29（4）：745-752.

［15］Haussmann HJ. Smoking and lung cancer：future research directions［J］. Int J Toxicol， 2007， 26（4）：353-364.

［16］Zhang H， Yang J Y， Zhou F， et al. Seed Oil of Brucea javanica induces apopotic death of acute myeloid leukemia cells via both the death receptors and the mitochondrial-related pathways［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2011， 28：965-969.

［17］Tsukaharas S， Yamamoto S， Shew TT， et al. Inhalation of low level formaldehyde increases the bcl 2/bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice［J］. Neuroimmunomodulation， 2006， 13（2）：63-68.

［18］Parikh N， Koshy C， Dhayabaran V， et al. The N-terminus and alpha-5， alpha-6 helices of the pro-apoptotic protein Bax， modulate functional interactions with the anti-apoptotic protein Bcl-xL［J］. BMC Cell Biol， 2007， 8：16-20.

（責任編輯 李楠）

Toxic Effects of NNK on NCTC 1469 Cells

Han Yawei Wang Xihua Chen Liping Shi Guiqin Sun Liping Zhou Wenshan
（College of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450001）

This work is to investigate the cytotoxicity in NCTC 1469 cells induced by 4-（methyInitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone（NNK）. MTT assay was used to analyze the toxic effects on NCTC 1469 cells under various concentrations（0.1， 0.2， 0.3， 0.4， and 0.5 mg/mL）of NNK at different times. Morphologic changes of treated NCTC 1469 cells with NNK were observed by the inverted microscopy. Flow cytometry（FCM）and real-time quantitative PCR were applied to measure the apoptosis rate and the expression of apoptotic gene Bcl-2 and Bax mRNA. NNK depressed the viability of NCTC 1469 cells with a pattern of the dose-dependent and time-dependent. Typical morphological changes of cells shrinkage and the decrease of density were observed by the inverted microscopy. FCW revealed that inhibited cell proliferation and induced death were of dose-dependent， i.e.， apoptotic rates were（16.79 ± 2.01）%， （26.87 ± 1.67）%， （41.78 ± 3.19）%， （50.89 ± 3.94）% and（65.86 ± 4.54）% respectively at 24 h after the cells treated with the concentrations（0.1， 0.2， 0.3， 0.4， and 0.5 mg/mL）of NNK， showing much higher than the control of（7.46 ± 1.58）%. Real-time quantitative PCR showed that with the raising of NNH concentration， the expression of gene Bcl-2 decreased and the expression of gene Bax gradually increased. Conclusively， NNK could obviously abate the viability of NCTC 1469 cells and induce the apoptosis of NCTC 1469 cells in a pattern of dose-dependent and time-dependent.

NNK；NCTC 1469 cells；apoptosis；flow cytometry

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.031

2015-01-09

鄭州市科技局科技攻關項目（121PPTGG362-16），河南省教育廳青年骨干教師項目（2012GG-117）

王西華，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：13673615603@163.com

韓亞偉，男，博士，副教授，研究方向：煙草分子毒理評價；E-mail：opsar@163.com