徐燈耿麗麗張敏紅盧凡張杰

（1.　湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢　430068；2.　中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所　植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193；3.　中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京　100193）

轉(zhuǎn)基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉雞腸道中的殘留檢測(cè)

徐燈1，2耿麗麗2張敏紅3盧凡1張杰2

（1.湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢430068；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

旨在研究轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)飼喂肉雞的影響，以含有轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因水稻的飼料飼喂肉雞，分析了肉雞空腸、回腸、盲腸、直腸中cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留情況，并用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了外源基因的降解情況。結(jié)果表明，飼喂轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因水稻21 d和42 d的肉雞腸道4個(gè)部位中沒有檢測(cè)到cry1Ab/Ac基因殘留，體外消化外源基因的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源基因在肉雞腸道中約4 h后開始逐步降解。對(duì)上述4個(gè)部位內(nèi)容物進(jìn)行ELISA和Western blot分析，均未檢測(cè)到 Cry1Ab/Ac蛋白殘留。綜合分析表明，轉(zhuǎn)基因水稻中的外源基因和蛋白在肉雞腸道中易被消化和降解。

轉(zhuǎn)基因水稻；肉雞；基因及蛋白殘留；體外消化

水稻是我國(guó)主要的糧食作物之一，轉(zhuǎn)基因水稻主要有抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆環(huán)境以及提高水稻品質(zhì)等多個(gè)品種。轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因水稻（華恢1號(hào)）是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育的對(duì)二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等具有較強(qiáng)殺蟲活性的水稻品種［1］，2009年轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻華恢1號(hào)和汕優(yōu)63獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（生產(chǎn)應(yīng)用）［2］，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化和大規(guī)模種植［3］，在一定程度上緩解了糧食緊缺的問題，但轉(zhuǎn)基因作物可能會(huì)對(duì)動(dòng)物等非靶標(biāo)生物或生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一些非預(yù)期效應(yīng)，所以推廣轉(zhuǎn)基因作物的前提是要確保其安全性。

對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)主要從環(huán)境和食用安全性兩方面考慮，食品安全性評(píng)價(jià)包括對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子、毒性、過敏性、抗生素抗性等方面進(jìn)行全面評(píng)估［4］。轉(zhuǎn)基因作物被動(dòng)物攝食后消化規(guī)律是否改變，外源基因及蛋白在腸道及糞便中是否殘留，是否存在轉(zhuǎn)移到重要器官和血液中的風(fēng)險(xiǎn)；如果動(dòng)物體內(nèi)有外源基因和蛋白殘留，是否會(huì)在人體內(nèi)積累殘留，這些問題都備受關(guān)注。大量的研究發(fā)現(xiàn)飼喂轉(zhuǎn)Bt基因或抗除草劑基因的玉米肉雞，在空腸、回腸、盲腸和排泄物以及重要內(nèi)臟和血液無外源基因殘留［5，6］，在肝臟、雞蛋排泄物中均未發(fā)現(xiàn)外源蛋白的殘留［7］。而對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因和蛋白殘留的報(bào)道僅有兩例，發(fā)現(xiàn)肉雞小腸壁、血液、肌肉和脾臟等器官中無cry1Ab基因殘留［8］，在肉雞十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物和脾臟等器官中無Cry1Ac蛋白殘留［9］；迄今國(guó)內(nèi)外尚無轉(zhuǎn)cry1Ab/ Ac基因水稻中外源基因及蛋白在肉雞體內(nèi)殘留研究的報(bào)道。

針對(duì)目前基因殘留檢測(cè)中引物單一、覆蓋率低等問題，本研究在轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)的支持下，以飼喂轉(zhuǎn)Bt基因水稻21 d和42 d的肉雞為材料，采用小片段全覆蓋的策略，分析肉雞腸道內(nèi)容物中cry1Ab/Ac基因的殘留情況，同時(shí)采用ELISA和Western blot兩種方法檢測(cè)蛋白殘留，旨在為轉(zhuǎn)基因水稻安全性評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 供試水稻品種為華恢1號(hào)轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因水稻，親本明恢63為對(duì)照組，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.1.2 試劑 實(shí)驗(yàn)所需E. coli DH5α菌株由抗蟲生物技術(shù)組保存；pMD19-T載體等購(gòu)自TaKaRa 公司；PVDF膜購(gòu)自Pall 公司；QIAamp DNA Stool Mini Kit購(gòu)自QIGEN 公司，QualiPlate試劑盒購(gòu)自Envirologix公司。鼠源一抗由本實(shí)驗(yàn)室制備，二抗鼠抗羊lgG HRP購(gòu)自北京天德悅生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 肉雞飼喂 實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)肉雞日糧配制根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T33-2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》中肉雞營(yíng)養(yǎng)需要。一共140只雞分成14組，其中7組飼喂含有轉(zhuǎn)基因水稻飼料，另7組飼喂對(duì)照組水稻飼糧。1-21 d日糧中稻米含量為51.72%，22-42 d稻米含量為56.54%。

在21 d和42 d分別從每個(gè)處理中隨機(jī)取7只雞，屠宰前使肉雞禁食12 h，放血處理后解剖肉雞，分別取空腸、回腸、盲腸、直腸部位置于離心管中液氮冷凍保存。

1.2.2 肉雞腸道中外源基因殘留檢測(cè) 肉雞腸道內(nèi)容物DNA提取用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒，按照說明書中的方法提取。方法稍作改動(dòng)，腸道內(nèi)容物加入1.6 mL Buffer ASL振蕩至均質(zhì)，加入InhibitEX藥片用于去除雜質(zhì)和PCR干擾物，加入蛋白酶K去除體系中的蛋白，用無水乙醇沉淀DNA，過QIAamp spin柱洗脫后加入200 μL 超純水。DNA提取后采用DNA定量?jī)x（Thermo公司）測(cè)定DNA樣品的濃度，并以O(shè)D260-280nm檢測(cè)DNA的純度。DNA樣品用超純水稀釋至40-50 ng/μL，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

為了檢測(cè)外源基因、水稻內(nèi)源基因殘留，分別根據(jù)cry1Ab/Ac基因以及水稻內(nèi)源蔗糖磷酸合酶基因SPS（Sucrose phosphate synthase gene，U33175）［10］和淀粉分支酶基因RBE4（Starch branching enzyme，EF055878）［11］、肉雞內(nèi)源基因卵清蛋白o(hù)v基因設(shè)計(jì)引物25對(duì)，其中包括擴(kuò)增cry1Ab/Ac基因全長(zhǎng)引物1對(duì)和100 bp小片段引物9對(duì)、擴(kuò)增SPS基因100 bp小片段引物11對(duì)、擴(kuò)增RBE4基因全長(zhǎng)引物1對(duì)和100 bp小片段引物2對(duì)、擴(kuò)增ov基因引物1對(duì)，引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度，見表1，所有引物由生工生物工程公司合成。

PCR反應(yīng)設(shè)置水空白對(duì)照、陽性對(duì)照、待測(cè)樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增cry1Ab/Ac基因反應(yīng)條件：94℃ 預(yù) 變 性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增SPS、ov基因反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增RBE4基因反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系，見表2。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.3 體外消化cry1Ab/Ac基因模擬實(shí)驗(yàn) cry1Ab/Ac基因50 ng和水稻基因組10 μg加肉雞腸道內(nèi)容物5 mg以及對(duì)照組cry1Ab/Ac基因50 ng和水稻基因組10 μg分別在37℃溫浴0、4、8和12 h，溫浴后的產(chǎn)物用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取DNA，DNA產(chǎn)物用根據(jù)cry1Ab/Ac基因所設(shè)計(jì)的10對(duì)引物檢測(cè)cry1Ab/Ac基因片段。PCR反應(yīng)條件同1.2.2，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 肉雞腸道中的外源蛋白殘留檢測(cè) 肉雞腸道內(nèi)容物總蛋白用PBS（pH7.4）緩沖液提取，總蛋白定量采用BCA方法，試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。Cry1Ab/Ac蛋白殘留檢測(cè)采用ELISA雙抗夾心法，QualiPlate試劑盒購(gòu)自美國(guó)Envirologix公司，方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，重復(fù)3次；其中放置溫度均改為37℃，檢測(cè)結(jié)果用Western blot驗(yàn)證。Western blot方法如下：待測(cè)樣經(jīng)過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，將膜用TBS-T 溶液漂洗后用20 mL 5%脫脂奶粉封閉2 h，加入含一抗（0.5 μL）的TBS-T漂洗液15 mL，4℃孵育過夜或室溫1 h，加入含鼠抗兔IgG二抗（1 μL）的TBS-T漂洗液15 mL，室溫1 h，每步結(jié)束后漂洗膜3次，每次10 min，最后膜用顯色液顯色后拍照。

2 結(jié)果

2.1 肉雞腸道中外源基因殘留檢測(cè)

圖1 肉雞腸道內(nèi)容物提取的總DNA中cry1Ab/Ac基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

肉雞腸道內(nèi)容物經(jīng)QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取后，DNA定量?jī)x檢測(cè)DNA的純度（OD260-280nm）均在1.7-1.9，將DNA樣品用超純水稀釋至40-50 ng/μL，每個(gè)樣品取1.0 μL用于檢測(cè)。PCR方法分別檢測(cè)了肉雞腸道內(nèi)容物提取的總DNA中cry1Ab/Ac基因全長(zhǎng)和9個(gè)小片段基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，僅能擴(kuò)增出10個(gè)片段的相應(yīng)正對(duì)照，在腸道內(nèi)容物總DNA中，均未檢測(cè)到cry1Ab/Ac基因全長(zhǎng)和9個(gè)小片段（圖1-A和圖1-B）。同樣，在空腸、回腸、盲腸和直腸內(nèi)容物提取的總DNA中，也檢測(cè)不到水稻內(nèi)源基因SPS及REB4（圖1-C、D和E）；但所有的內(nèi)容物總DNA中都可以檢測(cè)到肉雞內(nèi)源ov基因（圖1-F）。

2.2 體外消化cry1Ab/Ac基因模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從消化時(shí)間上看，不加腸道內(nèi)容物對(duì)照處理中12 h仍能擴(kuò)增出全長(zhǎng)cry1Ab/Ac基因；然而，cry1Ab/ Ac基因在加入了腸道內(nèi)容物后，在4 h就檢測(cè)不到全長(zhǎng)cry1Ab/Ac基因（圖2-A）；但是在4和8 h時(shí)還能檢測(cè)出cry1Ab/Ac基因9個(gè)小片段，而到達(dá)12 h時(shí)，9個(gè)小片段均無法檢測(cè)到（圖2-B）。

圖2 體外消化cry1Ab/Ac基因全長(zhǎng)（A）及片段（B）

2.3 肉雞腸道中Cry1Ab/Ac蛋白殘留檢測(cè)

ELISA檢測(cè)前為避免樣品中的蛋白濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，先用BCA法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，定量至20 μg。用雙抗夾心法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，檢測(cè)結(jié)果中21 d、42 d轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因組中盲腸和直腸樣品21CM、21CZ、21TM、21TZ、42CM、42CZ、42TM和 42TZ出現(xiàn)比較明顯的顯色反應(yīng)，檢測(cè)值表明其中可能存在Cry1Ab/Ac蛋白殘留。

表3 ELISA檢測(cè)結(jié)果

對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果中產(chǎn)生顏色反應(yīng)的樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，結(jié)果顯示SDSPAGE電泳圖中在60 kD處42CZ樣品和42TZ樣品存在疑似條帶，但Western blot分析結(jié)果表明這兩個(gè)樣品中并不存在Cry1Ab/Ac蛋白。

3 討論

家禽腸道中沒有Bt蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，因此，Bt蛋白不會(huì)破壞家禽的腸道繼而影響家禽發(fā)育。但如果轉(zhuǎn)Bt基因水稻中的外源蛋白不易消化，蛋白殘留可能會(huì)對(duì)家禽產(chǎn)生致敏性［12］，基因殘留也可能引起其他非預(yù)期效應(yīng)，需要對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻的消化情況進(jìn)行分析。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂轉(zhuǎn)Bt水稻肉雞腸道中沒有cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留，同時(shí)用體外消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

針對(duì)基因殘留檢測(cè)中引物單一、覆蓋率低等問題，本研究采用多對(duì)引物同時(shí)對(duì)cry1Ab/Ac基因全長(zhǎng)及基因碎片進(jìn)行檢測(cè)。在饑餓12 h的肉雞腸道內(nèi)容物中未檢測(cè)到cry1Ab/Ac基因的殘留，這與Rossi和Tony的結(jié)果是一致的。Rossi［13］在飼喂轉(zhuǎn)Bt玉米肉雞腸道中發(fā)現(xiàn)外源基因僅在肉雞腸道消化系統(tǒng)的前面部分嗉囊中檢測(cè)到，原因是肉雞在這一時(shí)間段不可能完全消化掉飼料。本研究中水稻內(nèi)源基因SPS和REB4與cry1Ab/Ac基因有同樣的降解情況，而Tony等［14］在肉雞腸道空腸之后的部位能檢測(cè)到植物內(nèi)源基因的殘留。為了進(jìn)一步驗(yàn)證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中外源基因在肉雞腸道中的降解情況，本研究進(jìn)行了體外模擬實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明全長(zhǎng)cry1Ab/Ac基因在4 h已經(jīng)降解，而小片段在12 h也降解完全，驗(yàn)證了在饑餓12 h的肉雞腸道內(nèi)容物中檢測(cè)不到cry1Ab/Ac基因的結(jié)果。

圖3 21 d、42 d轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因飼喂肉雞盲腸和直腸內(nèi)容物總蛋白的SDS-PAGE分析（A）及W estern blot分析（B）

本研究ELISA實(shí)驗(yàn)中一些非轉(zhuǎn)基因樣品也出現(xiàn)了明顯顏色反應(yīng)，這與Chowdhμry［15］和Einspanier［16］的結(jié)果相類似，肉雞腸道內(nèi)容物中一些外源或內(nèi)源的污染物可能會(huì)引起顯色反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)樣品中并沒有Bt蛋白殘留［17］，與本研究結(jié)果一致。隨著腸道消化吸收食物，在腸道以外部分如雞的蛋［18］、血液［5］、肌肉［19，20］、內(nèi)臟組織［6，21］、糞便［7］中也未檢測(cè)到外源蛋白的殘留。

上述研究充分說明轉(zhuǎn)基因水稻中的外源基因和蛋白在肉雞腸道內(nèi)容物中無殘留，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步利用宏基因組16S rDNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)飼喂轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)肉雞腸道微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響（數(shù)據(jù)待發(fā)表），當(dāng)然還需要營(yíng)養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)等方面的研究對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻食用安全性做出全面的評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

本研究分析了飼喂轉(zhuǎn)Bt水稻肉雞腸道中外源基因和蛋白的殘留情況，結(jié)果顯示，肉雞腸道內(nèi)容物中沒有cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留，該研究體系為其他轉(zhuǎn)基因作物對(duì)動(dòng)物飼喂安全性評(píng)價(jià)提供了借鑒。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Detection of cry1Ab/Ac Gene and Protein Remained in Gut of Broiler Feeding Transgenic Rice

Xu Deng1，2Geng Lili2Zhang Minhong3Lu Fan1Zhang Jie2
（1. School of Resource & Environmental Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan430068；2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193；3. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193）

To analyze the effects of genetically modified rice on feeding broilers， cry1Ab/Ac gene and protein remained in the jejunum，ileum， cecum and rectum of broiler feeding transgenic rice were detected， and the degradation patterns were testified in vitro. The results showed that there were no residues of cry1Ab/Ac gene in 4 intestinal parts of broilers fed transgenic rice for 21 and 42 d， and cry1Ab/Ac gene gradually degraded after 4 h in the gut in vitro test. No residues of Cry1Ab/Ac protein were detected in contents of the above 4 parts of broilers using ELISA and Western blot. In conclusion， cry1Ab/Ac gene and protein of the transgenic rice were easily digested and degraded in broiler intestines.

transgenic rice；broiler；gene and protein residues；digestion in vitro

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.011

2015-01-28

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2012ZX08011001-005）

徐燈，男，碩士，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)；E-mail：xudg1230@163.com

張杰，男，博士，研究員，研究方向：生防微生物功能基因；E-mail：jzhang@ippcaas.cn盧凡，男，博士，教授，研究方向：藻類生物技術(shù)；E-mail：lulab99@gmail.com