馬越宿玲恰吳丹吳敬

（1.江南大學　食品科學與技術國家重點實驗室，無錫　214122；2.江南大學生物工程學院　工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫　214122）

重組精氨酸脫亞胺酶制備L-瓜氨酸的工藝條件優(yōu)化

馬越1，2宿玲恰1，2吳丹1，2吳敬1，2

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，無錫214122；2.江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫214122）

將來源于Pseudomonas putida ACCC 10185的ADI編碼基因克隆到表達載體pET-24a（+）中，轉化Escherichia coli BL21（DE3），通過超聲波破碎得到粗酶液，酶活檢測ADI酶活為26 U/mL發(fā)酵液。對酶轉化L-精氨酸鹽酸鹽生成L-瓜氨酸的反應條件進行了優(yōu)化，結果表明，當?shù)孜風-精氨酸鹽酸鹽濃度650 g/L，反應初始pH6.0，溫度37℃，加酶量24 U/g底物，轉速100-200 r/min，轉化時間7 h，L-瓜氨酸轉化率達到100%，是目前國內外報道的酶法制備L-瓜氨酸的最高水平。

精氨酸脫亞胺酶；L-瓜氨酸；酶轉化；重組表達

L-瓜氨酸是一種游離的氨基酸，是人體尿素循環(huán)的重要中間代謝物，具有多種生理功能。利尿、護肝，可與L-鳥氨酸、L-精氨酸等共同治療高氨血癥［1，2］；參與內源性細胞舒張因子一氧化氮的合成，有助于擴張血管、抑制動脈硬化，可用于治療高血壓、冠心病及男性性功能障礙等疾?。?-5］；在腸道中L-瓜氨酸通過谷氨酸-鳥氨酸代謝途徑合成，可作為檢驗小腸移植時異體排斥效應程度的指示劑［6］；L-瓜氨酸與精氨酸結構相似，對體內自由基表現(xiàn)出高度的活性，可作為天然高效的新抗氧化劑［7］，由此可見L-瓜氨酸在醫(yī)藥用品、保健食品以及化妝品中應用前景廣闊。隨著人們保健意識的提高，對L-瓜氨酸的需求量日益增多，因此生產L-瓜氨酸具有重大的意義。

L-瓜氨酸主要是由精氨酸脫亞胺酶（arginine deiminase，ADI，EC3.5.3.6）催化L-精氨酸鹽酸鹽水解生成L-瓜氨酸和氨［8，9］。利用ADI催化生成L-瓜氨酸由于原料易得、工藝簡單、產物濃度高等優(yōu)點逐漸成為L-瓜氨酸制備的潛力途徑。

本研究將來源于Pseudomonas putida ACCC 10185［10］的ADI基因（arcA）連接到表達載體pET-24a（+），獲得重組質粒pET-24a（+）-arcA，將其轉化Escherichia coli BL21（DE3）并進行搖瓶發(fā)酵，經超聲波破碎，檢測破壁上清液中的ADI 酶活。在此基礎上，對酶轉化工藝進行研究，旨在獲得高效制備L-瓜氨酸的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida ACCC 10185）：由ACCC菌種保藏中心購買；E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）、表達載體pET-24a（+）：為本實驗室保藏；克隆載體pMD18-T Simple vector：購自TaKaRa公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，卡那霉素0.03，pH7.0。

TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO42.31，KH2PO416.43， 卡 那 霉 素0.03，pH7.0。

1.1.3 試劑 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、PrimerStar HS DNA聚合酶、堿性磷酸酶CIAP、核酸分子量標準及瓊脂糖：購自TaKaRa公司；PCR產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒：天根生化科技有限公司；卡那霉素、氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白質相對分子質量標準、L-精氨酸鹽酸鹽、瓜氨酸標樣：購自生工生物工程（上海）有限公司；其它分析純試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器 凝膠成像儀、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C型核酸電泳儀購自北京六一儀器廠；高效液相色譜儀購自Agilent公司；細胞破碎儀購自北京科實興業(yè)科技有限公司；紫外可見光分光光度計購自日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構建 提取Pseudomonas putida ACCC 10185的基因組，PCR擴增目的基因arcA，將所得片段割膠回收后，連接克隆載體pMD18-T Simple vector，將連接產物轉入E.coli JM109感受態(tài)細胞中，在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質粒得到pMD18-T-arcA，經NdeⅠ和Hin d Ⅲ雙酶切后，將目的基因片段割膠回收，T4連接酶將目的基因與經相同酶切處理的表達載體pET-24a（+）連接，連接產物轉入E.coli JM109感受態(tài)細胞中，在平板培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆進行液體培養(yǎng)，抽提得到重組質粒pET-24a（+）-arcA。將pET-24a（+）-arcA進行雙酶切驗證，驗證正確后轉入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布LB平板培養(yǎng)基，挑取單克隆進行液體培養(yǎng)，保存甘油管，-80℃保存。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵生成ADI

1.2.2.1 種子培養(yǎng) 接一定量-80℃ 甘油管中保存的菌液至LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min，培養(yǎng)8 h。

1.2.2.2 搖瓶發(fā)酵 將種子液以5%的接種量轉接至TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600約為1.0時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG［11，12］，置于25℃、轉速200 r/min進行重組蛋白的誘導表達，誘導18 h后離心收集菌體，用50 mmol/L，pH6.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液復溶菌體至5 OD，超聲波破碎后離心，破壁上清即為ADI粗酶液，測定粗酶液中的ADI酶活，經與發(fā)酵液OD折算后，即為每毫升發(fā)酵液中的ADI酶活。

1.2.3 ADI活性測定 利用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法測定ADI酶活［13］。用50 mmol/L，pH6.0的磷酸鹽緩沖液配制0.2 mol/L L-精氨酸鹽酸鹽溶液作為底物，取100 μL適當稀釋的酶液加入1 mL底物中，于37℃條件下反應30 min，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應，沸水浴5 min，稀釋一定倍數(shù)后測定瓜氨酸含量，并計算酶活。酶活定義：37℃條件下，每分鐘轉化1 μmol L-精氨酸鹽酸鹽生成瓜氨酸的酶量定義為1 U。

1.2.4 L-瓜氨酸的制備及含量測定 以50 mmol/L，pH6.0的磷酸鹽緩沖液配制濃度為650 g/L的L-精氨酸鹽酸鹽溶液，加酶量為24 U/g底物，與一定量的酶液充分混勻后在37℃、100-200 r/min水浴搖床中反應7 h。轉化后的反應液加入等體積的三氯乙酸后，靜置2 h，12 000 r/min離心10 min，取上清進行分析。利用HPLC進行產物分析的色譜條件是：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱250×4.6 mm 5 μm Inertsil ODS-3 Column，Agilent紫外檢測器；流速0.8 mL/min；柱溫40℃。轉化率定義為生成的L-瓜氨酸的摩爾數(shù)/L-精氨酸鹽酸鹽的摩爾數(shù)×100%。

2 結果

2.1 ADI重組菌的構建

2.1.1 重組質粒pET-24a（+）-arcA的構建 提取Pseudomonas putida ACCC 10185的基因組，PCR擴增目的基因arcA，將攜帶目的基因的質粒pMD18-T和本實驗室質粒pET-24a（+）分別經Nde Ⅰ和Hin dⅢ雙酶切后，割膠回收目的基因片段和pET-24a（+），連接后轉入E.coli JM109感受態(tài)細胞，培養(yǎng)重組菌并抽提質粒。重組質粒經Nde Ⅰ和Hin d Ⅲ雙酶切驗證，結果（圖1）顯示，在大約5 300 bp和1 300 bp處有條帶，分別與載顯體及基因大小一致，表明重組表達載體pET-24a（+）-arcA構建成功。

圖1 重組質粒pET-24a（+）- arcA酶切驗證

2.1.2 重組菌E.coli BL21（DE3）/ pET-24a（+）-arcA的構建及培養(yǎng) 將重組質粒pET-24a（+）-arcA轉化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經0.4 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)后收集菌體，處理后得ADI粗酶液。經檢測，ADI酶活為26 U/mL發(fā)酵液。SDS-PAGE（圖2）分析顯示，ADI破壁上清液在大約43 kD處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與理論ADI分子量相符，表明ADI在E.coli BL21（DE3）中成功表達。

2.2 重組ADI制備L-瓜氨酸轉化條件優(yōu)化

2.2.1 反應溫度對酶轉化的影響 以650 g/L L-精氨酸鹽酸鹽為底物，加酶量為24 U/g底物，pH6.0，轉速100-200 r/min，分別在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和70℃水浴搖床中轉化7 h，HPLC檢測L-瓜氨酸生成量。圖3表明，高溫條件下轉化率較低，而低溫條件下轉化率明顯提高，最高值為100%。這是因為低溫有利于酶的穩(wěn)定，而高溫時酶的熱穩(wěn)定性較差，反應過程中酶易失活，導致轉化率較低，因此37℃為最佳轉化溫度。

圖2 精氨酸脫亞胺酶SDS-PAGE分析

圖3 反應溫度對酶轉化的影響

2.2.2 反應初始pH對酶轉化的影響 以650 g/L L-精氨酸鹽酸鹽為底物，加酶量為24 U/g底物，反應溫度37℃，轉速100-200 r/min，分別在pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0中轉化7 h，HPLC檢測L-瓜氨酸生成量。圖4表明，當初始pH為6.0時，L-瓜氨酸轉化率為100%。pH的改變可使酶分子上的側鏈基團處于不同的解離狀態(tài)，影響底物的結合和進一步的反應，或者影響酶的空間結構，從而影響酶的活性，因此過酸或過堿對酶促反應都不利，在pH為6.0時L-瓜氨酸轉化率最高。

圖4 反應初始pH對酶轉化的影響

2.2.3 加酶量對酶轉化的影響 以100 g/L L-精氨酸鹽酸鹽為底物，加入不同量的ADI，加酶量分別為底物12、24和36 U/g，反應溫度37℃，pH6.0，轉速100-200 r/min，轉化3.5 h，HPLC檢測L-瓜氨酸生成量。圖5表明，隨著加酶量的增多，相同時間內L-瓜氨酸轉化率逐漸增大，但是不同加酶量條件下，L-瓜氨酸轉化率均能達到100%?？紤]到經濟性因素，選擇加酶量為底物24 U/g。

圖5 加酶量對酶轉化的影響

2.2.4 底物濃度與反應時間對酶轉化的影響 分別配制濃度為50、100、150、200、300、400和650 g/L的L-精氨酸鹽酸鹽溶液，加酶量為24 U/g底物，反應溫度37℃，pH6.0，轉速100-200 r/min，定時取樣，HPLC檢測L-瓜氨酸生成量。圖6表明，隨著L-精氨酸鹽酸鹽濃度的增大，相同時間內L-瓜氨酸轉化率越來越低，但隨著轉化時間的延長，L-瓜氨酸的濃度不斷增加，最終均能達到100%，因此將轉化時間定為7 h。

圖6 底物濃度對酶轉化的影響

2.2.5 轉速對酶轉化的影響 以650 g/L L-精氨酸鹽酸鹽為底物，加酶量為24 U/g底物，反應溫度37℃，pH6.0，分別在轉速100、150和200 r/min中轉化7 h，HPLC檢測L-瓜氨酸生成量。結果顯示，不同轉速對L-瓜氨酸轉化率無影響。

3 討論

早在1971年，來自日本的Kakimoto等［14］就利用Pseudomonas putida ATCC 4359 ADI生產瓜氨酸，以L-精氨酸鹽酸鹽為底物，反應62 h后轉化率達到90.5%；1973年，Chibata等［9］報道同一來源的ADI，以L-精氨酸或DL-精氨酸為底物，可生產瓜氨酸濃度達80 g/L以上；1974年，Yamamoto等［15］用聚丙烯酰胺凝膠包埋上述來源的細胞，可將濃度0.5 mol/L的L-精氨酸鹽酸鹽完全轉化為L-瓜氨酸；2014年，王穎等［16］將來源于Pseudomonas putida ATCC 4359的ADI在E.coli中克隆表達，利用重組菌制備的粗酶液可將20 g/L L-精氨酸有效轉化為L-瓜氨酸，轉化率高于90%，該酶顯示出了與來源于Pseudomonas putida ACCC 10185的ADI 99.76%的同源性。

我國對于其他來源的ADI轉化L-精氨酸鹽酸鹽生成L-瓜氨酸的研究也有一些報道。2005年，曹瑜等［17］利用Streptococcus faecalis NJ402游離細胞的ADI，在10 L轉化罐中，可將質量濃度200 g/L的L-精氨酸完全轉化成L-瓜氨酸。2006年，張鵬等［18］運用海藻酸鈉包埋法固定化Streptococcus faecalisCGMCC 1866細胞生產L-瓜氨酸，L-精氨酸轉化率高達99%。2008年，鄭璞等［19］利用填充床反應器固定化假單胞菌細胞連續(xù)制備L-瓜氨酸，固定化細胞對底物的摩爾轉化率在95%以上。同年，姚海峰等［20］利用Streptococcus faecalis BT001，作用于濃度為96 g/L的L-精氨酸，轉化率達到98%；2010年，趙艷杰等［21］利用海藻酸鈉固定化上述細胞，填充床反應器中連續(xù)轉化濃度為100 g/L的L-精氨酸底物，摩爾轉化率為95.1%；2011年，屈冉［22］利用聚氨酯固定化上述細胞，填充床反應器中轉化濃度為100 g/L的L-精氨酸底物，L-瓜氨酸的產量在65 g/L左右。同年，鄭雄敏等［23］利用高產ADI Streptococcus faecalis BM-2 CGMCC No.4990 菌株，在30 L發(fā)酵罐上小試發(fā)酵，產L-瓜氨酸量達到98 g/L。2012年，胡延奇［24］利用工程菌中的ADI作用于質量濃度60 g/L的精氨酸，瓜氨酸的產量達55.1 g/L。

本實驗在E.coli BL21（DE3）中成功表達了來源于Pseudomonas putida ACCC 10185的ADI，酶活力單位為26 U/mL。重點考察了該重組酶制備L-瓜氨酸的應用，考察了溫度、pH、底物濃度、加酶量等對酶轉化的影響，在最優(yōu)條件下能將650 g/L的L-精氨酸鹽酸鹽完全轉化成L-瓜氨酸，均高于上述研究。下一步的研究重點是將該重組菌在3 L發(fā)酵罐中進行優(yōu)化，獲得更高表達量的酶液，為工業(yè)化奠定基礎。同時，該工藝流程簡單，操作方便，這為L-瓜氨酸的工業(yè)化生產奠定了堅實的基礎，具有廣闊的實際應用前景。

4 結論

本研究成功獲得了能夠胞內表達ADI的重組E.coli BL21（DE3）菌株，初步實驗表明重組菌發(fā)酵液ADI酶活可達26 U/mL。采用該重組ADI優(yōu)化了酶法制備L-瓜氨酸的工藝條件。結果表明，底物L-精氨酸鹽酸鹽濃度650 g/L，反應pH6.0，溫度37℃，加酶量24 U/g底物，轉速100-200 r/min，轉化時間7 h，L-瓜氨酸轉化率可達100%。

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（責任編輯 馬鑫）

Optim ization of Preparing L-citrulline by Recombinant Arginine Deim inase

Ma Yue1，2Su Lingqia1，2Wu Dan1，2Wu Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122；2. School of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122）

The arcA gene encoding ADI from Pseudomonas putida ACCC 10185 was cloned into the expression vector pET-24a（+）. The vector was then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）for intracellular production of ADI. The crude enzyme was obtained by ultrasonic treatment， and activity in the fermentation broth of recombinant E. coli BL21（DE3）was 26 U/mL. Furthermore， the condition for enzymatic conversion of L-arginine monohydrochloride to L-citrulline by the recombinant ADI was optimized. At 650 g/L of L-arginine monohydrochloride， pH6.0， 37℃， 100-200 r/min， and 24 U ADI per gram substrate incubated for 7 hours， 100% of the L-arginine monohydrochloride was transformed into L-citrulline， which was the highest level of preparing L-citrulline by enzyme method in home and abroad presently.

arginine deiminase；L-citrulline；enzymatic conversion；recombinant expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.026

2014-12-10

馬越，女，碩士研究生，研究方向：重組酶的制備和應用；E-mail：fionamy0912@sina.com

吳丹，男，碩士生導師，研究方向：食品與發(fā)酵研究；E-mail：bioenwu@aliyun.com