王紫娟 趙敏

（東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱　150040）

疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria GH-01漆酶的純化和酶學性質(zhì)研究

王紫娟 趙敏

（東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150040）

疣孢漆斑菌具有生長周期短，分泌漆酶酶活高等特點。利用已分離得到的疣孢漆斑菌GH-01（Myrothecium verrucaria GH-01）發(fā)酵產(chǎn)生粗酶液。進而通過分級沉淀、透析和層析的方法對漆酶粗酶液進行純化。SDS-PAGE和Native-PAGE結(jié)果表明純化可獲得具有漆酶活性的單體蛋白。酶學性質(zhì)研究表明，該漆酶催化最適溫度為40℃，在底物ABTS存在條件下的最適pH值為4.0，且在低溫及堿性條件具有較好的穩(wěn)定性。此外通過漆酶對4大類染料脫色能力的研究，發(fā)現(xiàn)該漆酶對偶氮類的橙黃Ⅰ和蒽醌類的茜素紅脫色有較好的脫色效果，反應1 h脫色率達80%以上；對三苯甲烷類的堿性品紅脫色能力較弱，脫色率只能達到20%左右；脫色率最差的是雜環(huán)類的亞甲基藍。在含10 U漆酶的體系中，對50 mg/L的染料降解效果相對最佳。

疣孢漆斑菌漆酶；純化；酶學性質(zhì)

漆酶（對苯二酚-氧化還原酶，laccase，EC 1.10.3.2）是一種含多銅的氧化還原酶，能夠催化多種底物的氧化，如鄰位和對位酚類、氨基苯酚、芳基二胺、多酚、聚胺和木質(zhì)素等［1-3］。此外，它還可以耦合無機離子還原分子氧生成水。最早漆酶被發(fā)現(xiàn)于日本漆樹的汁液中，目前研究發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于植物、昆蟲、真菌和細菌中［4-6］。部分漆酶已經(jīng)廣泛應用在工業(yè)過程中，如漂白、降解、脫色和制備生物電極等［1-5］。由于其具有寬范的底物特異性、催化反應沒有過氧化物和有毒物質(zhì)的生成，以及對環(huán)境無污染的特性［7］，因而近年來得到了越來越多的關(guān)注，成為了環(huán)保應用酶的研究熱點。

由于目前對真菌漆酶的研究較為深入，而產(chǎn)漆酶真菌的主要來源是擔子菌亞門的白腐真菌，而對于絲狀真菌研究較少。疣孢漆斑菌為半知菌的一種，其菌株具有生長周期短、生活史簡單、易于遺傳改造等優(yōu)點，可為后續(xù)可大規(guī)模發(fā)酵提供良好的基礎(chǔ)［8］。本研究利用一株高產(chǎn)漆酶的疣孢漆斑菌M. verrucaria GH-01獲得漆酶，并對該酶進行純化和酶學性質(zhì)的研究，探索其在染料脫色應用中的可能性，旨在為拓展半知菌漆酶種類、研究漆酶催化性能以及后續(xù)該漆酶的應用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 疣孢漆斑菌GH-01（Myrothecium verrucaria GH-01）：采自黑龍江涼水林區(qū)，經(jīng)篩選和鑒定，保存于東北林業(yè)大學微生物實驗室。

1.1.2 試劑和儀器 2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），DEAE-Sepharose FF凝膠，SephadexG-75凝膠，蛋白質(zhì)marker，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。紫外可見分光光度計、數(shù)顯恒溫水浴鍋、臺式離心機、梯度混合器、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、渦旋混勻器、紫外檢測儀、自動部分收集器等。

1.1.3 培養(yǎng)基 平板活化固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，切成大約1 cm3的小塊，沸水煮30 min，過濾取濾液補足至1 000 mL。加入蛋白胨30 g，葡萄糖40 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43 g，加入20 g瓊脂，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成約1 cm3的小塊，在1 L水中煮沸30 min，過濾取濾液補足1 L。加入蛋白胨36 g，葡萄糖24 g，MgSO4·7H2O 1.8 g，KH2PO43.6 g，銅離子濃度0.2 mmol/L，把培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶中，121℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 在培養(yǎng)8 d的平板活化固體PDA培養(yǎng)基上用打孔器打6個直徑為1 cm 的菌餅，接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃下恒溫培養(yǎng)箱振中140 r/min振蕩培養(yǎng)10 d作為發(fā)酵液。將發(fā)酵液樣品在10 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 漆酶活力測定 漆酶酶活測定以ABTS為底物，利用紫外分光光度法測定。將2.95 mL 0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH4.0）和1 mL 1 mmol/L的ABTS溶液組成的反應體系置于28℃水浴鍋內(nèi)，加入適當稀釋的酶液50 μL（空白對照為經(jīng)過高溫滅活的酶液），反應3 min，利用紫外分光光度法測定420 nm處吸光度的變化值。每個樣品取3次測量的平均值。漆酶活力的計算公式：

式中，△A：吸光度的變化值；V：溶液的體積（L）；ε420：消光系數(shù)（3.6×104mol-1·cm-1·L）；v：加入粗酶液的體積（mL）；L：比色皿的光徑（cm）；t：反應時間（min）；c：10-6mol。

1.2.3 漆酶的分離純化 將粗酶液上清逐漸加入硫酸銨，測其不同飽和度下的漆酶活力（在冰浴中進行）。選擇最佳飽和度，收集沉淀。用10 mmol/L pH7.8 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液反復沖洗沉淀使其溶解。8 000 r/min下離心10 min，去除不溶雜質(zhì)，收集上清液。將上清液置于透析袋中4℃透析過夜，聚乙二醇（PEG20000）適當濃縮。濃縮好的樣品加入緩沖液平衡過的DEAE-Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析柱中。 用緩沖液配制的0-1 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。收集在280 nm 處有吸收峰的溶液，測定其漆酶活力，將有酶活性的溶液按活力高低分別收集并適當濃縮。隨后將樣品加入緩沖液平衡過的SephadexG-75 凝膠過濾柱中，用緩沖液洗脫，收集漆酶活力較高的部分。

1.2.4 蛋白質(zhì)電泳 SDS-PAGE和Native-PAGE參照郭堯君［9］的方法。SDS-PAGE電泳采用5%濃縮膠和12%分離膠進行，凝膠用考馬斯亮藍R250染色。Native-PAGE采用5%濃縮膠和12%分離膠進行，用含有3 mmol/L ABTS的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對凝膠染色，觀察綠色的條帶。

1.2.5 漆酶的性質(zhì)研究 測定溫度對粗漆酶活性的影響：將含有漆酶的緩沖液在20-60℃下保溫3 min后測定酶活力。測定溫度對粗漆酶穩(wěn)定性的影響：將酶液置于4-60℃下保溫，每隔一段時間后取樣，在30℃下測定酶活力。測定pH值對粗漆酶活性的影響：將底物溶解于pH3.0-8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中測定漆酶活力。測定pH值對粗漆酶穩(wěn)定性的影響：將酶液溶于pH3.0-8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，每隔一段時間取樣，測定酶活力。

1.2.6 染料降解研究 染料降解反應在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（10 mmol/L pH8.0）中，溫度28℃中進行，以加入高溫滅活的漆酶為對照，用紫外分光光度計檢測染料在其最大吸收波長處的吸光度變化。考察漆酶對偶氮類染料橙黃I、蒽醌類染料茜素紅、三苯甲烷類染料堿性品紅和雜環(huán)類染料亞甲基藍等四類染料的降解脫色程度、染料濃度對脫色影響及漆酶含量對降解的影響。

脫色率=（1-A/A0）×100%

式中，A0 ：脫色反應前溶液吸光值，A ：脫色反應后溶液吸光值。所有脫色反應均重復3 次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 硫酸銨飽和度的確定

在0℃冰浴條件下，逐漸加入硫酸銨，飽和度從0-80%對M. verrucaria GH-01發(fā)酵上清液進行鹽析，結(jié)果如圖1所示。隨著硫酸銨的加入，蛋白被慢慢析出。當硫酸銨的飽和度達到65%時，發(fā)酵液上清的酶活為49.8 U/L，上清液的相對酶活為最開始的2.8%，說明酶蛋白基本都被硫酸銨沉淀結(jié)合了。因此確定硫酸銨的飽和度為65%。

圖1 硫酸銨分級沉淀的結(jié)果

2.2 純化后漆酶的電泳結(jié)果

從發(fā)酵液上清的粗酶液到純化最終獲得的酶液，結(jié)果如表1所示。最終獲得8 mL液體樣品，總酶活1 782.93 U，總蛋白3.75 mg，漆酶比活力475.45 U/mg，回收率29.34%，純化倍數(shù)4.77。

表1 漆酶的純化結(jié)果

2.3 純化后漆酶的電泳結(jié)果

將最終純化得到的酶液進行SDS-PAGE和Native SDS-PAGE 電泳，結(jié)果如圖2所示。SDS-PAGE電泳（圖2-A）顯示，出現(xiàn)藍色單一條帶，說明了從M. verrucaria GH-01發(fā)酵上清液純化后得到的漆酶為單體蛋白，目的蛋白分子量約為60 kD。通過對Native SDS-PAGE 電泳的一塊膠的不同處理，一半用考馬斯亮藍染色并脫色，另一半進入到含有ABTS的緩沖溶液中。結(jié)果（圖2-B）表明，純化酶液的單一性和漆酶活性。至此獲得M. verrucaria GH-01電泳純單體蛋白。

圖2 漆酶SDS-PAGE（A）和Native-PAGE（B）電泳結(jié)果

2.4 溫度對漆酶活性的影響及熱穩(wěn)定性的研究

在不同溫度下測定M. verrucaria GH-01的漆酶活力，結(jié)果（圖3）顯示，漆酶活性最適反應溫度為40 ℃，在20-60℃下也表現(xiàn)了較高活性。溫度對漆酶穩(wěn)定性的影響如圖4所示，0℃保存條件下，漆酶保存3 h活力基本無變化；20、30℃條件下保存漆酶3 h，漆酶活力保持70%以上；40-60℃保存下的漆酶活力下降較快。綜合考慮溫度對漆酶活力及穩(wěn)定性的影響，本實驗后續(xù)對染料的降解實驗，溫度選擇30℃。

圖3 溫度對粗漆酶活力的影響

圖4 溫度對漆酶穩(wěn)定性的影響

2.5 pH值對漆酶活性的影響及pH穩(wěn)定性的研究

不同pH值對粗漆酶活力的影響（圖5）顯示，漆酶活性最適反應pH值為4.0，在pH值為3、7、8的條件下，酶活相對較低。pH值對漆酶穩(wěn)定性的影響（圖6）顯示，pH值為6.0的條件下，粗漆酶保存3 h活力保持在75%以上；pH值為3.0、4.0條件下保存粗漆酶3 h，酶活力粗漆酶活力下降較快，下降到5%，說明了此漆酶不耐酸。

圖5 pH值對粗漆酶活力的影響

圖6 pH值對漆酶穩(wěn)定性的影響

2.6 漆酶對不同染料的脫色

4種染料橙黃I、亞甲基藍、茜素紅的染料濃度為50 mg/L，加入等量漆酶10 U，結(jié)果如圖7所示。漆酶對橙黃I和茜素紅脫色程度較高，反應1 h后脫色率達到80%以上，對堿性品紅脫色率較低在20%，而對亞甲基藍脫色率最低。隨著時間的變化，料橙黃I和亞甲基藍變化幅度較??；而茜素紅和堿性品紅隨時間變化，降解率有一定幅度的升高。

2.7 考察不同染料含量對脫色率的影響

分別配制含量為5-100 mg/L的4種不同染料，其中都加入含量為10 U的漆酶。染料的脫色情況（圖8）表明，脫色效率較好的橙黃I、茜素紅以及脫色率較低的堿性品紅都是在染料濃度為50 mg/L時脫色效率達到最高；而亞甲基藍的濃度為10 mg/L和5 mg/L時脫色效率較好。

圖7 不同染料隨時間的降解情況

圖8 漆酶含量對不同的染料的降解情況

2.8 漆酶含量的影響

漆酶含量對橙黃Ⅰ的降解脫色影響，如圖9所示。雖然漆酶的含量不同，但經(jīng)過24 h的降解脫色，脫色效率都達到80%以上。說明此漆酶對橙黃Ⅰ有很好的脫色效果。另外，隨著漆酶的含量增加，其脫色效率有小幅上升。由此可見漆酶含量對橙黃Ⅰ的降解有一定的影響，但影響較小。

圖9 漆酶含量對橙黃Ⅰ的降解情況

3 討論

雖然漆酶在動物、植物、微生物中等均能找到其存在的證據(jù)，但真菌漆酶由于其產(chǎn)酶量高和純化技術(shù)相對容易，從而得到了最廣泛的研究。在真菌漆酶的研究中又以子囊真菌（Ascomycetes）和擔子真菌（Basidiomycetes）研究的最多，而半知菌研究的特別少。目前對半知菌漆酶的研究主要集中在產(chǎn)酶菌株的分離篩選和產(chǎn)酶條件水平上，如擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）、新月彎孢（Curvularia lunata）和棘胞木霉（Trichoderma asperellum）等，但產(chǎn)酶水平與白腐真菌相比較低［9-12］。本研究不僅拓展了漆酶蛋白來源而且其對染料的降解方面表現(xiàn)出了很好的應用價值。

從M. verrucaria GH-01發(fā)酵上清液中，通過硫酸銨分級沉淀、透析和離子交換柱層析純化到了具有胞外漆酶活性的酶蛋白液，并通過SDS-PAGE和Native -PAGE證明了此酶為單體蛋白和具有漆酶活性。但從一些真菌中得到的漆酶，由于糖基含量的不同和自身結(jié)構(gòu)差異，會使得其在分子質(zhì)量存在較大差異，基本范圍在50-130 kD之間；同時也會有同工漆酶的出現(xiàn)。 Mimoz［13］就從Pleurotus eryngii的上清發(fā)酵液中純化出性質(zhì)不同的兩種漆酶同工酶，它們的糖基含量和酶學性質(zhì)等存在很大差異，而白蠟地層孔菌（Fomitella fraxinea）的兩種同工酶Lac1和Lac2性質(zhì)就很接近［14］。雖然漆酶的大小、性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)都有一定的差距，但從一些漆酶的結(jié)晶分析中可知，其三級結(jié)構(gòu)又有著一定的共性，大部分的漆酶催化中心都有4個Cu2+，他們在漆酶的催化反應中起著重要作用［15］。這也是值得我們?nèi)ヌ剿髋c研究的方面。

漆酶的酶學性質(zhì)研究表明，我們所得的漆酶與大部分真菌漆酶的性質(zhì)基本相符，其最適溫度為40℃，30℃條件下保存粗漆酶3 h，其酶活力在70%以上；最適pH為4.0，并在低溫及在堿性條件可以較好的維持漆酶的穩(wěn)定性。染料在化工行業(yè)大量使用，但由于其一些染料自然條件下很難降解，需要特殊處理才能降解。而漆酶的一個重要應用就是對染料的降解。所得漆酶在對4種染料的脫色實驗中，對橙黃I和茜素紅降解程度較高，反應1 h后降解率即可達到80%以上，對堿性品紅降解率較低在20%，漆酶對亞甲基藍降解率最低；染料濃度為50 mg/L時，其中3種染料的脫色率都是最好的；漆酶對橙黃I脫色效果隨著酶量的增加而逐漸顯著。綜上所述，該漆酶具有較好的應用前景和潛在的應用價值。

4 結(jié)論

對已經(jīng)分離鑒定出的疣孢漆斑菌GH-01所產(chǎn)漆酶對其進行分離純化，得到單體純蛋白。該漆酶催化反應的最適溫度為40℃，最適pH值為4.0。該漆酶在低溫及堿性條件具有較好的穩(wěn)定性。在對染料的脫色能力的研究中，該漆酶對橙黃Ⅰ和茜素紅脫色效果較佳，對堿性品紅和亞甲基藍脫色能力較弱。當染料未被酶飽和時，隨著漆酶濃度的增加，脫色率也會增加。在含10 U漆酶的體系中，對50 mg/L的染料降解效果相對最好。

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（責任編輯李楠）

Purification and Enzymatic Properties of Laccase from M yrothecium verrucaria GH-01

Wang Zijuan Zhao Min
（College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin150040）

Myrothecium verrucaria has the advantages of short growth cycle and high enzyme activity of secreting laccase. In this study， the crude enzyme was produced by the M. verrucaria GH-01 obtained by separation. Further we purified the crude enzyme by fractional precipitation， dialysis and chromatography. The results of SDS-PAGE and Native-PAGE indicated that the monosome protein with laccase activity was obtained by purification. The study of enzymatic properties of laccase showed that the optimal temperature of catalyzed reaction for laccase was 40℃， and the laccase activity against ABTS showed a maximum at pH4.0. It had the favorable stability under the low temperature and alkaline conditions. Besides， studying the laccase decolorizing of 4 representative dyes demonstrated that the laccase decolorizing rate for orange I of azo dyes and alizarin red of anthraquinone class was the highest with decolorizing rate over 80% by 1 h， lower for fuchsin of triphenylmethane class with decolorizing rate only 20% and lowest for methylene blue of heterocyclic class. In 10 U laccase system， the decolorizing degree of the 50mg/L dye concentration was optimal.

Myrothecium verrucaria GH-01；purification；enzymatic properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.018

2014-12-01

國家自然科學基金項目（31170553），國家林業(yè)局“948”項目（2012-4-03）

王紫娟，女，碩士研究生，研究方向：污染物降解，蛋白提純；E-mail：huerniaoming@163.com

趙敏，教授，研究方向：微生物降解；E-mail：82191513@163.com